第四章白細(xì)胞抗原檢測技術(shù)P74臨床血液教研室第一節(jié)HLA檢測技術(shù)P781、血清學(xué)方法2、細(xì)胞學(xué)方法3、分子生物學(xué)方法HLA檢測技術(shù)由抗原檢測等位基因檢測HLA分型技術(shù)的應(yīng)用器官和造血干細(xì)胞移植供受者組織相容性配型血小板輸注前的配型疾病相關(guān)實(shí)驗(yàn)性診斷法醫(yī)鑒定和親子鑒定等。一、血清學(xué)分型方法血清學(xué)分型方法是用一系列已知的抗HLA抗原的標(biāo)準(zhǔn)分型血清來檢測未知淋巴細(xì)胞表面的HLA抗原型別。需要HLA抗體作為分型試劑采用微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)測定HLA-A、B、C位點(diǎn)上的等位基因。1.微量淋巴細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)P74

1964年，Terasaki建立微量淋巴細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)仍是目前HLA抗原鑒定的標(biāo)準(zhǔn)方法條件：有活力的T,B淋巴細(xì)胞

HLA分型標(biāo)準(zhǔn)血清（大部分是IgG）原理待檢淋巴細(xì)胞膜表面若具有特異HLA抗原，可與HLA特異性抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，在補(bǔ)體介導(dǎo)下發(fā)生細(xì)胞毒反應(yīng)而被殺傷。加入適當(dāng)?shù)娜玖希ㄈ缡锛t）后，被殺傷的淋巴細(xì)胞膜通透性增加，染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞著色；若淋巴細(xì)胞不帶有HLA抗原，抗原抗體未結(jié)合，則細(xì)胞膜完整，染料不能使細(xì)胞著色。在倒置顯微鏡下估計(jì)著色細(xì)胞的百分比來判斷抗原、抗體反應(yīng)的強(qiáng)度。方法評價(jià)與注意事項(xiàng)

1．血清學(xué)分型技術(shù)可以檢測HLA-I類抗原，但此技術(shù)用于檢測HLA-II類抗原難度較大，主要因?yàn)椋海?）HLA-II類抗原在未激活的T細(xì)胞上不表達(dá)，需分離純化B淋巴細(xì)胞。（2）HLA-II類抗原多態(tài)性由雙等位基因構(gòu)成，很難準(zhǔn)確判定相應(yīng)等位基因產(chǎn)物的抗原特異性。2．HLA標(biāo)準(zhǔn)分型抗血清試劑的質(zhì)量是試驗(yàn)的關(guān)鍵。（1）HLA抗血清應(yīng)使用單克隆抗血清。（2）抗體效價(jià)要適宜。（3）抗血清種類應(yīng)覆蓋本民族、本地區(qū)80%以上的HLA抗原。3.淋巴細(xì)胞：高活性，純度應(yīng)大于90%4.試驗(yàn)應(yīng)在20～25℃的室溫條件下進(jìn)行，才能獲得最佳的反應(yīng)效果。5.補(bǔ)體來源一般采用多只健康家兔血清混合。由于兔補(bǔ)體（兔血清）中無天然細(xì)胞毒抗體，不會引起假陽性反應(yīng)。6．加入染料之后須加入甲醛，甲醛固定能使活細(xì)胞具有更大的折光性，易于與死細(xì)胞區(qū)別。7．每塊反應(yīng)板應(yīng)設(shè)立陰性對照（陰性對照血清一般采有AB型男性、無受血史者血清）和陽性對照（陽性對照孔中加入抗人淋巴細(xì)胞球蛋白），在陰性對照結(jié)果為陰性、陽性對照結(jié)果為陽性反應(yīng)時(shí)，判讀結(jié)果才可靠。8．HLA血清學(xué)分型技術(shù)雖經(jīng)典，但存在標(biāo)本血淋巴細(xì)胞高活力和純度難以保證，HLA抗血清試劑存在交叉反應(yīng)、弱反應(yīng)及額外反應(yīng)等眾多因素，導(dǎo)致HLA血清學(xué)分型錯(cuò)誤率較高，目前血清學(xué)方法已逐漸被基因分型技術(shù)所取代。二、HLA細(xì)胞學(xué)分型技術(shù)P77對HLA-D抗原特異性進(jìn)行分型，曾利用該技術(shù)鑒定了多個(gè)HLA-D、HLA-DP抗原。但由于該分型技術(shù)細(xì)胞來源困難、操作繁瑣、試驗(yàn)流程長，不適合常規(guī)檢測，而且該方法指定抗原偏差較大，故該分型技術(shù)已逐漸被淘汰。三、HLA的基因分型技術(shù)自1996年，以DNA為基礎(chǔ)的HLA的基因分型技術(shù)日趨成熟，并逐漸取代血清學(xué)方法和細(xì)胞學(xué)方法。成為最準(zhǔn)確的分型技術(shù)。HLA基因分型檢測是檢測個(gè)體HLA座位上的等位基因序列情況HLA血清學(xué)技術(shù)和細(xì)胞分型技術(shù)是檢測HLA座位上的抗原情況特點(diǎn)：精確，可靠，重復(fù)性好。歧義結(jié)果低分辨分型：*后第2位（抗原分解物水平分型）高分辨分型：*后第4－8位（等位基因水平分型）HLA的基因分型方法的種類1、基于HLA基因序列不同為基礎(chǔ);2、基于HLA等位基因在PAGE中不同的構(gòu)象而設(shè)計(jì)。1.基于HLA基因序列不同為基礎(chǔ)

PCR-SBT（PCR-直接測序分型）PCR-SSO（PCR序列特異性寡核苷酸探針）PCR-RFLP（PCR限制性片段長度多態(tài)性）PCR-SSP（PCR序列特異性引物）基因芯片技術(shù)Qiagen/OlerupSSP低分辨試劑

Qiagen/OlerupSSP高分辨試劑采用美國OneLambda公司PCR-SSP

ABDRDQ配型試劑盒腎移植供受者雙方進(jìn)行HLA基因分型Qiagen/OlerupSBT測序分型試劑

2.基于HLA等位基因在PAGE中不同構(gòu)象而設(shè)計(jì)PCR指紋技術(shù)PCR-SSCP：PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性RSCA：參比鏈介導(dǎo)的構(gòu)象分析HLA分子生物學(xué)檢測方法評價(jià)

HLA基因分型法與血清學(xué)及細(xì)胞學(xué)分型方法比較，具有分辨率高、錯(cuò)誤率少、樣本需要量少、樣本可長期保存、分型試劑可大量制備且來源不受限制、試驗(yàn)結(jié)果精確、可靠、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。HLA高分辨分型中歧義結(jié)果

HLA具有極為復(fù)雜的多基因性和高度多態(tài)性。隨著HLA等位基因的增多，同一位點(diǎn)不同等位基因之間的堿基差異序列較少，導(dǎo)致大量等位基因堿基序列高度同源，基因檢測時(shí)可得到歧義的分型結(jié)果，不能明確指定某一基因型，特別是在高分辨率分型時(shí)。HLA抗原可引起免疫應(yīng)答產(chǎn)生HLA抗體。HLA抗體在臨床上具有重要意義，可誘發(fā)移植的超急性排斥反應(yīng)、發(fā)熱性非溶血性輸血反應(yīng)、血小板輸注無效等。第二節(jié)HLA抗體檢測群體反應(yīng)性抗體（PRA）群體反應(yīng)性抗體（panelreactiveantibody，PRA）是指器官移植受者體內(nèi)存在的抗HLA抗體。也可因妊娠、反復(fù)輸血等而產(chǎn)生，與移植物排斥反應(yīng)及受者存活率密切相關(guān)。PRA測定是篩選各種組織器官移植致敏受者和了解患者術(shù)后體內(nèi)抗體水平簡便易行的方法。PRA抗體檢測方法1、補(bǔ)體依賴的淋巴細(xì)胞毒方法2、ELISA3、流式細(xì)胞術(shù)1.補(bǔ)體依賴的淋巴細(xì)胞毒方法－CDC適用：HLA-I，II類抗體，包括IgG，IgM包括：淋巴細(xì)胞毒交叉配合試驗(yàn)

OneLambda細(xì)胞板方法特點(diǎn)：靈敏度低，只能檢測補(bǔ)體結(jié)合的抗體，不能檢測非補(bǔ)體依賴的抗體，不能區(qū)分HLA特異性抗體和非特異性抗體。腎移植前－群體反應(yīng)性抗體PRA檢測

淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)原理：將病人的血清與數(shù)十份含不同HLA抗原的淋巴細(xì)胞作細(xì)胞毒抗體測定來系統(tǒng)了解移植前患者的抗體水平，判斷移植的可能性及與供者有陽性交叉的百分比。

結(jié)果判斷：通常將PRA值分為非致敏（＜10%），輕度致敏（10%-50%），高致敏（＞50%）。

2.ELASA方法特點(diǎn)：更敏感，特異性好，可檢測HLA特異性抗體，可檢測補(bǔ)體依賴或者非依賴的HLA抗體，可定量。應(yīng)用：微量ELASA篩選HLA-I，II類抗體3流式細(xì)胞術(shù)普通流式細(xì)胞術(shù)免疫磁珠流式細(xì)胞儀：基于FCM和免疫標(biāo)記技術(shù)的結(jié)合，以微球磁珠為靶細(xì)胞。Luminex100/200－液相芯片

Luminex檢測技術(shù)用于HLA抗體檢測原理：以包被抗原的微球作為靶細(xì)胞，每種微球包被一種抗原，多種微球可以在同一體系內(nèi)反應(yīng)。當(dāng)加入待檢血清與微球在室溫下孵育時(shí)，若待檢血清中存在HLA