第六章細菌和噬菌體的重組和連鎖本章重點1．細菌影印法研究。2．細菌和病毒的四種遺傳分析方法：轉化、接合、性導、轉導。3．掌握F+、F–、F'、Hfr×F–的特點。4．理解和掌握中斷雜交和重組作圖的原理。5．噬菌體結構和基因重組特點。學時：10細菌和藍綠藻：一個線條狀或環(huán)狀染色體(單倍體結構)；無典型的有絲分裂和減數(shù)分裂；染色體傳遞和重組方式與真核生物不同。E.coliT4Phage病毒：比細菌更簡單；在寄主細胞內以集團形式產(chǎn)生；屬于只有一條染色體的單倍體。第一節(jié)細菌和病毒在遺傳學

研究中的地位一、細菌：1.大?。杭毎^小、長約1~2μ

(1μ＝1/1000mm)、寬約0.5μ；2.結構：鞭毛、細胞壁、質膜、間體、核質體、核糖體3.遺傳物質：單個主染色體、一個或多個小染色體(質粒)4.涂布和繁殖：每個細胞在較短時間內(如一夜)能裂殖到107個子細胞→成為肉眼可見的菌落或克隆(clone)。5.生理特性突變：①營養(yǎng)缺陷型：喪失合成某種營養(yǎng)物質能力，不能在基本培養(yǎng)基上生長；原養(yǎng)型：野生菌株則可在基本培養(yǎng)基上生長。用不同的選擇性培養(yǎng)基測知突變的特性。②抗性突變型：如抗藥性或抗感染性。例如：青霉素（penr）抗性突變的菌落。培養(yǎng)基中加有青霉素

二、病毒：單倍體，僅一條染色體。病毒→蛋白質外殼+核酸。病毒分類：寄主：動物、植物、細菌等；遺傳物質：DNA或RNA。煙草花葉病毒腺病毒T4噬菌體愛滋病病毒

RNA

DNA

DNA

RNA

表6-1噬菌體對于分子生物學研究具有重要意義。

三、細菌和病毒在遺傳研究中的優(yōu)越性：

1．世代周期短：大腸桿菌（E.coli）20分鐘可繁殖一代。

2．便于管理和生化分析：個體小，一般在1μ至幾μ之間，操作管理方便。3．便于研究基因突變：

裸露的DNA分子（有的病毒為RNA分子），容易受環(huán)境條件的影響而發(fā)生突變；單倍體生物，不存在顯性掩蓋隱性問題，隱性突變也能表現(xiàn)出來。

4．便于研究基因的作用：

影印培養(yǎng)，易檢出營養(yǎng)缺陷型突變，有利于從生化角度來研究基因的作用。

5．便于研究基因重組：細菌具有轉化、轉導和接合作用，可以進行精密的遺傳分析。6.便于研究基因結構、功能及調控機制：細菌和病毒的遺傳物質簡單，易于進行基因定位、結構分析和分離，基因的表達調控也適于采用生理生化的方法進行深入研究。

7.便于進行遺傳操作：

染色體結構簡單，沒有組蛋白和其它蛋白的結合，更宜于進行遺傳工程的操作。四、突變型篩選

要得到特定表型的突變型，主要不是依賴使用不同的誘變劑，而是依賴于采用不同的篩選方法。

1.

糖發(fā)酵性突變株Lac-選擇：可Lac+將和Lac-涂布于伊紅-美藍（EMB）培養(yǎng)基上，Lac+可形成有金屬光澤的紫色菌落，而Lac-則形成白色菌落，因此很容易識別。

2.抗性突變體選擇：把經(jīng)過誘變處理的細胞直接涂布到含有某種噬菌體或抗菌素的培養(yǎng)基上，形成的菌落克隆就是抗性突變。

3.營養(yǎng)缺陷型突變的選擇：如選擇氨基酸營養(yǎng)缺陷型，可先把經(jīng)誘變劑，如X射線、紫外線或化學誘變劑等處理的細菌涂布在含有所有20種氨基酸的完全培養(yǎng)基上，這種培養(yǎng)基能使各種營養(yǎng)缺陷型生長，培養(yǎng)的目的是通過細胞分裂使突變型充分表現(xiàn)。

待菌落出現(xiàn)后，用印跡法（replica-platedmethod）把它們影印到基本培養(yǎng)基上鑒別出在不含任何氨基酸的培養(yǎng)基上不能生長的克隆，然后再把這一克隆培養(yǎng)到只含一種氨基酸的培養(yǎng)基上，從而判定該突變型需哪種氨基酸才能生長。

測定突變的方法──影印法：黎德伯格等（LederbergJ.和LederbergE.M.,1952）設計。LederbergJ.,1958Nobel獎獲得者，發(fā)現(xiàn)細菌轉導和接合第二節(jié)細菌的遺傳分析

一、細菌的雜交細菌主要是無性繁殖，1946年發(fā)現(xiàn)不同品系大腸桿菌可以雜交，并進行基因重組，從而首次發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌也有“性別”。

命名：野生型或營養(yǎng)缺陷型：按照菌株所不能合成的物質的前三個字母來命名，右上角標上“+”或“-”分別代表野生型和缺陷型（突變型）。抗生素敏感或抗性：取前三個字母，右上角標上s或r，代表敏感或抗性，例如，鏈霉素敏感的寫成strs，對鏈霉素抗性的寫成strr。

不同營養(yǎng)缺陷型的大腸桿菌：

A菌株：Met-bio-thr+leu+，需加甲硫氨酸和生物素。

B菌株：Met+bio+

thr-leu-，需加蘇氨酸和亮氨酸。

*A菌株和B菌株營養(yǎng)缺陷型，不能在基本培養(yǎng)上生長。

*

A+B菌株混合培養(yǎng)，在完全培養(yǎng)基上，幾小時后離心，涂布基本培養(yǎng)基上，長出原養(yǎng)型（Met+bio+thr+leu+）菌落。DemonstrationbyLederbergandTatumofgeneticrecombinationbetweenbacterialcells

這種原養(yǎng)型細胞如何出現(xiàn)？

A、B菌株分別培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基上→一邊加壓和吸引使培養(yǎng)液充分混合→結果任何一臂的培養(yǎng)基上均未長出原養(yǎng)型細菌。

∴直接接觸（接合）是原養(yǎng)型細胞出現(xiàn)的必要條件。A菌株B菌株大分子可通過，細菌不能通過濾片U型管的實驗（Davis，1950）

A、B菌株中都有鏈霉素敏感型（Strs）和抗鏈霉素突變型（Strr

）。在不含鏈霉素的基本培養(yǎng)基上將這兩個菌株進行正反交，即Astrs×Bstrr與Astrr×Bstrs

，結果都可以得到原養(yǎng)型菌落；在含有鏈霉素的基本培養(yǎng)基上進行同樣雜交時，只有Astrs×Bstrr得到原養(yǎng)型菌落，而雜交中Astrr×Bstrs未產(chǎn)生原養(yǎng)型菌落。

說明菌株A和菌株B在雜交中起著不同的作用，菌株A相當于雄性，是遺傳物質的供體（donor），而菌株B相當于雌性，是遺傳物質的受體(receptor)。

在含有鏈霉素的基本培養(yǎng)基中，Astrs×Bstrr的雜交能得到重組原養(yǎng)型菌落，因為供體雖然對鏈霉素敏感，不能分裂，但鏈霉素并不影響供體的基因轉移。受體是對鏈霉素抗性的，所以在含有鏈霉素的培養(yǎng)基中既不影響細胞分裂，也不影響它接受外源遺傳物質而發(fā)生重組，從而形成原養(yǎng)型菌落。

反交Astrr

×Bstrs得不到原養(yǎng)型，因為受體對鏈霉素敏感，雖然供體能轉移遺傳物質，但受體細胞不能分裂，所以不能形成原養(yǎng)型菌落。

遺傳物質是單向轉移的。海斯（HayesW.,1952）證明：接合過程是一種單向轉移，A菌株遺傳物質→B菌株，從供體（donor）到受體（receptor）。二、F因子

1.概念

F因子（Ffactor或Felement）：又稱性因子（sexfactor）或致育因子（fertilityfactor），是能夠獨立增殖的環(huán)狀DNA分子，是一種附加體。

F因子是一種封閉的環(huán)狀DNA分子，相對分子質量約為3.5×106，全長約為6×104個bp，大約為大腸桿菌環(huán)狀染色體全長的2%。他可以以游離狀態(tài)存在于細胞質中。攜帶F因子的菌株稱為供體菌或雄性，用F＋表示。未攜帶F因子的菌株為受體菌或雌性，用F－表示。2.F因子結構包含3個區(qū)域

（1）原點（origin）是轉移的起點；（2）致育基因（fertilitygene）使它具有感染性，其中一些基因是編碼形成F纖毛（Fpilus）的蛋白質，既纖毛與F-細胞表面的受體相結合，在兩個細胞間形成細胞質橋；

（3）配對區(qū)（pairingregion）與細菌染色體多處的核苷酸序列相對應，因此F因子可以分別地與染色體上這些同源序列配對，通過交換整合到染色體中，成為細菌染色體的一部分。3.F因子的三種狀態(tài)：以大腸桿菌為例：

①沒有F因子，即F－；

②一個自主狀態(tài)F因子，即F＋；

③一個整合到自己染色體內的F因子，即Hfr。

4.自主狀態(tài)時

F因子獨立進行分裂。

三、接合（conjugation）：

1.概念：是指原核生物的遺傳物質從供體（donor）轉移到受體（receptor）內的過程。特點：需通過細胞的直接接觸。Bacteriacantransferplasmids,throughconjugation2.F因子的傳遞：帶F因子的細菌較少。具有F因子的菌株可以作為供體。

∵

F因子中有形成F性傘毛（Fpilus）的基因→接合管→

F＋細胞中的F因子由接合管向F－傳遞→

F－受體變成F＋。

F＋×F－：先形成接合管，F(xiàn)因子的DNA邊轉移邊復制，F(xiàn)－細胞F＋細胞。(a)duringconjugation,thepiluspullstwobacteriatogether(b)next,abridgeformsbetweenthetwocells

低頻重組（lowfrequencyrecombination,Lfr）：F+和F-之間雜交只有F因子的傳遞，而細菌染色體并不轉移，因此盡管F因子轉移頻率很高，但兩者染色體之間重組頻率很低，因此F+品系稱為～。3.Hfr細胞的形成及染色體的轉移：F因子整合到細菌染色體上（F＋→Hfr細胞），其繁殖與細菌染色體同步進行。此時，細菌基因的重組頻率增加4倍以上，∴染色體上整合有F因子的菌株，稱為Hfr菌株。

在Hfr×F－結合時，細菌染色體由一小段單鏈的F因子為前導而轉移到F-受體→邊進入邊合成。一般僅小部分細菌染色體能夠轉入，接合中斷→受體細胞為F－，F(xiàn)因子仍留在供體內。InsertionoftheFfactorintotheE.colichromosomebycrossing-over

高頻重組（highfrequencyrecombination,Hfr）：F因子整合到細菌染色體中，與F-細胞接合后可以將供體染色體的一部分或全部傳遞給F-受體，當供體和受體的等位基因帶有不同標記時，在它們之間就可以發(fā)生重組，重組頻率可達10-2以上，故稱為Hfr品系。ThetransferofE.colichromosomemarkersmediatedbyF.4、細菌接合重組的特點

在接合期間，Hfr細胞和F-細胞之間的接合管常會自發(fā)斷裂，進入的Hfr染色體也隨之斷裂，一般說很少有整條Hfr染色體轉入F-細胞的。所以：

（1）

F-細胞得到的只是F因子的一部分，F(xiàn)因子其余部分依賴于整條Hfr染色體的轉移。這樣在Hfr×F-雜交中選出的大多數(shù)重組子仍為F-。

（2）F-受體細胞只接受部分的供體染色體，這樣的細胞就稱為部分二倍體（partialdiploid）或稱為半合子（merozygote）。

外基因子（exogenote）：在部分二倍體細胞中，供體提供的部分基因組稱為~。內基因子（endogenote）：在部分二倍體細胞中，受體提供完整的基因組，稱為~?！嗍荏w和供體的重組就是內基因子與外基因子之間的重組，而且這種重組不同于真核生物的完整的二倍體重組。部分二倍體：當F＋或Hfr的細菌染色體進入F－后，在一個短時期內，F(xiàn)－細胞內的某些位點就會成為二倍體DNA。部分二倍體中發(fā)生交換:

單數(shù)交換：打開環(huán)狀染色體，產(chǎn)生一個線性染色體，這種細胞是不能成活的。

偶數(shù)交換：產(chǎn)生可遺傳的重組體和片段。

①如果內外基因子只發(fā)生單交換，則環(huán)狀染色體被破壞，形成的線狀染色體不能復制，因而含有這種線狀染色體的細胞就不能繁殖。只有偶數(shù)次的交換才能保持細菌染色體的完整性，產(chǎn)生有活性的重組子。

②偶數(shù)次交換得到的重組子只有一種類型，因為相反的重組子（reciprocalrecombinant）是一個線狀的片段，照例不能復制，隨著細胞分裂而被丟失，所以重組后細胞所產(chǎn)生的菌落不再是部分二倍體，而是單倍體。CrossoverbetweenexogenoteandendogenoteinamerozygoteThemerozygoteAsinglecrossoverleadstoapartlydiploidlinearchromosomeAnevennumberofcrossoversleadstoaringplusalinearfragment四、中斷雜交

50年代，雅科（JacobF.）和沃爾曼（WollmanE.）：

中斷雜交試驗：發(fā)現(xiàn)接合時遺傳物質轉移是直線進行。

其方法為：

①Hfr菌株與F-菌株混合培養(yǎng)。

Hfr菌株：strsa+b+c+d+對鏈霉素敏感

F-菌株：strr

a-b-c-d-

抗鏈霉素②不同時間取樣→攪拌器中斷雜交→

稀釋→含鏈霉素完全培養(yǎng)基→

殺死Hfr細菌→

抗str細菌菌落→

影印培養(yǎng)法：鑒定a+b+c+d+各基因轉移時間。例題：Hfr菌株：蘇氨酸(thr+)、亮氨酸(leu+)、抗疊氮化物(azir)、抗T1噬菌體(tonr)、半乳糖(gal+)、乳糖(lac+)、strs

。F-菌株：thr-、leu-、azis、tons、gal-、lac-

strr型。

在時間t=0時，讓這兩種細胞培養(yǎng)物混合進行通氣培養(yǎng)，每隔一定時間取樣，把菌液放入攪拌器內攪動以打斷配對的接合管，使接合的細胞分開以中斷雜交，將中斷接合的細菌接種在幾種不同的培養(yǎng)基上，測定形成了何種重組子。

中斷雜交實驗結果表明，在接合開始后，Hfr的不同非選擇標記可與F-細胞的染色體在不同時間形成重組子。①8分鐘時：thr+進入F-細胞；

8.5分鐘時：leu+進入F-細胞；②9分鐘時：出現(xiàn)疊氮化物抗性的菌落，少數(shù)azir基因進入F-細胞；③11分鐘時：出現(xiàn)抗噬菌體T1的F-細菌；④18和25分鐘時：分別出現(xiàn)乳糖和半乳糖發(fā)酵基因，即lac+和galb+進入F-細胞。①．重組體中各標志基因進入F-

細胞中時間不同，達到最高水平的時間也不同；②．隨時間的推遲，某個基因的重組率增加；一定程度后，重組率便不再增加。如：10`tonr首次出現(xiàn)，15`時40%、25`后80%。∴Hfr中基因是按一定的線性順序依次進入F-菌株的。Interrupted-matingconjugationexperimentswithE.coli

中斷雜交技術（interruptedmatingtechnigue）：在若干不同的選擇培養(yǎng)基（selsctivemedia）上，分析Hfr染色體上其它非選擇性標記基因進入F-細菌的順序和所需時間（分鐘），繪制出連鎖圖。這種根據(jù)供體基因進入受體細胞的順序和時間繪制連鎖圖的技術，稱為～?；蜣D入時間（min）頻率thr+leu+azistonslac+gal+88.59111825100（選擇標記）100（選擇標記）90704025表6-2大腸桿菌Hfr

thr+leu+lac+gal+azistonsstrs×F-

thr－leu－lac－gal－azirtonr

strr

的結果

不同基因所能達到的穩(wěn)定轉移頻率不同，這表明它們與thr和leu座位之間以及它們之間的順序和距離不同。

Hfr細菌的基因按一定的時間順序依次地出現(xiàn)在F-細胞。因為基因在染色體上，染色體從這一端開始稱為原點，以線性方式進入F-細胞中。

基因離開原點越遠，進入F-越遲。離開原點較遠的基因，可能在轉移過程（transferprocess）停止以前，仍未轉移，因而斜率較低，達到的最高值也較小。

以基因出現(xiàn)的時間為標準→作出E.coli的遺傳連鎖圖。

用基因轉移時間進行作圖，圖距單位用分鐘來度量，全部染色體轉移需90分鐘，每分鐘以3.3×104bp即1.2μmDNA的均衡速度進行轉移，因此大腸桿菌整個環(huán)形遺傳圖為90min。

同一個Hfr菌株的轉移的起始點以及轉移順序在不同實驗中都是相同的，但是一個F+品系可產(chǎn)生許多Hfr品系，這是因為F因子在細菌染色體上有許多插入位點而且其插入取向不同而形成的。

用不同的Hfr菌株進行中斷雜交實驗，則他們的轉移起點、基因轉移順序以及轉移方向都不相同。

用一種大腸桿菌的不同Hfr菌株進行中斷雜交實驗，作出連鎖圖，其基因向F-細胞轉移的順序不同。Hfr類型原點基因轉移順序HfrH

O

thr

pro

lac

pur

gal

his

gly

thi1

O

thr

thi

gly

his

gal

pur

lac

pro

2

O

pro

thr

thi

gly

his

gal

pur

lac

3

O

pur

lac

pro

thr

thi

gly

his

galAB312

O

thi

thr

pro

lac

gur

gal

his

gly轉移的順序是不是隨機？例如：thrthigly

。

每一Hfr菌株的基因順序雖不相同，但不是隨機的。任何線性的Hfr染色體的形成都可用F因子插入環(huán)狀染色體的不同地點來說明。CirculationoftheE.colichromosome差異：不同Hfr菌株轉移的原點(O)和轉移

方向不同。進一步說明F因子和細菌染色體都是環(huán)狀。五、重組作圖（recombinationmapping）

中斷雜交是根據(jù)基因轉移的先后次序，以時間為單位進行基因定位的。

重組作圖是根據(jù)基因間重組率進行基因定位的。兩種方法相互補充，提高基因定位的精確性。

基因距離較遠中斷雜交作圖很有效?；蚓嚯x較近，基因間轉移時間＜2分鐘時，僅用中斷雜交實驗進行基因定位不精確可靠，應采用傳統(tǒng)的重組作圖法。中斷雜交可為重組作圖提供某些基因之間連鎖關系及其前后次序的依據(jù)。例：根據(jù)中斷雜交實驗已知二個基因緊密連鎖:

lac-（乳糖不發(fā)酵）

ade-（腺嘌呤缺陷型）

Hfrlac+ade+×F-lac-ade-雜交中是lac+

先進入F-受體，而ade+后進入。

①因為供體Hfr轉入片段不能獨立復制，如果未進入F-受體的基因組中去，那么在以后的細胞分裂中就丟失了；②如果已進入F-基因組中去，而且在缺乏腺嘌呤的培養(yǎng)基上表型為F-lac+ade+，這顯然是這兩個基因之外發(fā)生雙交換的產(chǎn)物，lac-ade這兩個基因之間并未發(fā)生重組；Hfrlac+ade+轉入受體后將會發(fā)生：

③表型為lac+ade-，這種類型在缺乏腺嘌呤的培養(yǎng)基上就不能生長，所以篩選不出來，而且對測定這兩個基因之間的圖距也沒有意義，因為可能是lac+進入，而ade+還未進入F-細胞；

④只有在缺乏腺嘌呤的完全培養(yǎng)基上選出lac-ade+才是真正的重組子。因為已知ade+是在lac+之后進入F-細胞，既然ade+已進入，lac+也已先進入，所以選出重組子F-lac-ade+必然是外基因子和內基因子在這兩個基因之間發(fā)生交換的結果。

F-lac-ade-在缺乏腺嘌呤的條件下是不能生長的，當然對于計算這兩個基因之間的圖距也沒有意義。因此lac與ade之間的圖距應為：

RF(lac-ade)

用重組頻率（RF）所測得的基因間距離與用中斷雜交以時間（T）為單位的基因間距離基本上是一致的。

兩個位點間的時間約為1分鐘，兩個值的比RF：T約等于20，即它們之間的關系大約是1min等于20個圖距單位。六、F′因子與性導F+與Hfr兩種菌株可以相互轉變，F(xiàn)因子可以插入到染色體中去，形成Hfr菌株；又可通過規(guī)則的交換和剪切，從染色體上完整地游離下來形成F+菌株。

F因子整合過程：可逆：發(fā)生環(huán)出時，F(xiàn)因子又可重新離開染色體。整合環(huán)出OriginandreintegrationoftheF′factor

Adelberg和Burns(1959)：

*

F′因子（F′-factor）：

F因子偶爾在環(huán)出時不夠準確，會攜帶出染色體上的一些基因，這種因子稱為F′因子。

*

F′因子攜帶染色體的節(jié)段大?。簭囊粋€標準基因到半個細菌染色體。

由于F因子在細菌染色體上插入位置不同而構成不同的Hfr品系，由此形成不同的F′因子。它們各自攜帶細菌的不同基因和不同長度的DNA片段，有的F′因子攜帶若干個基因的一大段細菌的染色體。F′因子使細菌帶有某些突出的特點：⑴F′因子轉移基因頻率極高，如同F(xiàn)因子轉移頻率；⑵F′因子自然整合率極高，并且整合在一定的座位上?！邤y帶與細菌染色體一樣的同源區(qū)段；而正常F因子可在不同座位整合。

性導（sexduction或F′-duction）：指接合時由F′因子所攜帶的外源DNA整合到細菌染色體的過程。雅科和阿代爾伯格發(fā)現(xiàn)：特殊的Hfr菌株能把lac+

等位基因高頻率地轉移到Flac-受體中?！撷賚ac基因位于遠端，中斷雜交實驗中只1/1000重組率；②由F′攜帶lac+基因進入受體后可在lac位點上形成部分二倍體F′lac+/lac-。

F′因子轉移細菌基因不同于Hfr菌株。

1.Hfrthr+leu+strs×F-thr-leu-strr

篩選出F-:thr+leu+strr重組子

2.F′thr+leu+strs×F-thr-leu-strr

篩選出F′:thr+leu+strr重組子

雜交中把混合培養(yǎng)物涂布在含鏈霉素的基本培養(yǎng)基上，第一個雜交選出的菌株都是F-，因此不能將thr+leu+轉入F-菌株。

第二個雜交選出的菌株都帶有活性的F`因子，能與其他F-菌株雜交，并能將thr+leu+轉入F-菌株，而且這些菌株也具有F′因子，所以都是F+，仍具有感染能力。

產(chǎn)生F′因子的Hfr菌株仍保持單倍體狀態(tài)，F(xiàn)′因子轉入到受體細胞之后，由于引入了供體細胞的部分基因，從而構成了部分二倍體。性導在遺傳學

分析中的作用部分二倍體如果不發(fā)生重組

1.F′因子自主復制，可在細菌細胞中延續(xù)下去；

2.性導所形成的部分二倍體可用作不同突變型之間的互補測驗→確定這兩個突變型是屬于同一個基因或是兩個不同基因；3.觀察由性導形成的雜合的部分二倍體中某一性狀的表現(xiàn)→確定等位基因中的顯隱性關系；

4.分離出大量F′因子（每個F′因子攜帶有不同大腸桿菌基因）

→利用不同基因在一起的并發(fā)性導的頻率來作圖；部分二倍體如果發(fā)生了重組

即F′因子所攜帶的供體細菌染色體同受體細菌染色體之間的同源重組，如果發(fā)生了單交換，就導致F′整合形成Hfr品系，同時F′因子上所攜帶的基因發(fā)生重組；如果雙交換，則形成F′品系，只是F′因子的細菌基因和受體染色體的等位基因之間發(fā)生互換。并發(fā)性導(co-sexduction):是建立遺傳圖的另一手段，兩個位點必須密切相連才能處在同一個F′因子上。獲得兩個位點間重組率→每個片段的連鎖群。

性導作圖法與轉導作圖法相同。三種不同的致育因子的相互關系

1.F′是帶有部分細菌染色體F因子，它的性質在F和Hfr之間。Hfr通過交換，可以形成帶有部分細菌染色體的F′因子，而F′因子又可通過交換整合到細菌染色體的原來位置，回復到以前的Hfr狀態(tài)。

2.F′因子連同它所帶有的部分細菌染色體可一起轉移到F-細胞，其轉移速率近于F因子。

3.有F因子的細胞是F+細胞，沒有F因子的細胞是F-細胞。F因子由供體進入F-細胞，使受體細胞成為F+細胞，但供體細胞仍為F+，其染色體很少轉移。F因子可通過簡單交換整合到細菌染色體上，形成Hfr染色體。反過來，通過簡單交換，又可從Hfr染色體產(chǎn)生F因子。不同的Hfr菌株的染色體轉移起始點和方向不同，這是由于F因子整合的位置和方向不同的緣故。

4.Hfr能以高頻率把細菌染色體轉移到F-細菌中，而F因子因位于Hfr染色體的最末端，極少進入。F′因子和F因子很容易轉移到F-細胞中，但供體染色體的轉移率很低。SummaryofthevariouseventsthattakeplaceintheconjugationcycleE.coli七、轉化（transformation）概念：某些細菌通過其細胞膜攝取周圍供體的染色體片段，將此外源DNA片段通過重組整合到自己染色體組的過程。1928年，格里費斯（GriffithF.）在肺炎雙球菌中發(fā)現(xiàn)轉化現(xiàn)象。1944年，阿委瑞（AveryO.T.）進行肺炎雙球菌轉化試驗；證實遺傳物質是DNA；轉化是細菌交換基因的方法之一。轉化的條件：細菌活躍攝取外源DNA分子；具備重組程序所必需的酶。轉化三種細菌：肺炎雙球菌；枯草桿菌；流感嗜血桿菌。轉化的兩個例子：①用兩個帶有不同抗性的肺炎雙球菌群體混合→可以發(fā)現(xiàn)帶有雙抗性的細菌。細菌裂解→DNA殘留→其它細菌攝取轉化。②枯草桿菌活細胞表面分泌DNA，可被其它細胞攝取。（一）供體與受體的互作：①轉化片斷的大?。悍窝纂p球菌轉化：DNA片斷至少有800bp；枯草桿菌的轉化：DNA片斷至少有16000bp。②供體DNA分子存在的數(shù)目：供體DNA分子數(shù)目與特定基因的成功轉化有關。鏈霉素抗性基因轉化：每個細胞含有10個DNA分子之前，抗性轉化體數(shù)目一直與DNA分子存在數(shù)目成正比。

原因：細菌的細胞壁或細胞膜上有固定數(shù)量的DNA接受座位，故一般細菌攝取的DNA分子數(shù)<10個。③受體的生理狀態(tài)：感受態(tài)是處于剛停止DNA合成、而蛋白質合成繼續(xù)活躍進行時的狀態(tài)?；钴S合成的蛋白質可使細菌細胞壁易于接受轉化DNA。

只有感受態(tài)受體細胞才能攝取并轉化外源DNA，而這種感受態(tài)也只能發(fā)生在細菌生長周期的某一時間范圍內。（二）轉化DNA的攝取和整合過程：

①結合與穿入：雙鏈DNA分子結合在受體座位上（可逆），可被DNA酶降解；接受座位飽和性。

DNA攝取(不可逆)，不受DNA酶破壞。

穿入后，由外切酶或DNA移位酶降解其中一條鏈。

②聯(lián)會：按各個位點與其相應的受體DNA片段聯(lián)會。親緣關系越遠，聯(lián)會越小、轉化的可能性越小。↓③整合(重組)：

是指單鏈的轉化DNA與受體DNA對應位點的置換→穩(wěn)定地進入到受體DNA。對同源DNA具有特異性。異源DNA，視親緣關系遠近也可發(fā)生不同頻率整合。

（三）連鎖判斷

①如果A和B是連鎖的，當DNA濃度下降時，AB同時轉化頻率和A或B轉化頻率下降程度相同；

②如果A和B不連鎖，AB轉化頻率下降將遠遠超過A或B轉化頻率下降的程度，因為在較低的濃度范圍內，轉化頻率和轉化DNA的濃度成正比關系。（四）轉化頻率低的原因：

1.受體細菌細胞壁只在特定區(qū)域形成臨時通道，允許外源ＤＮＡ片段通過。２.外源ＤＮＡ進入還必須有酶或蛋白質分子以及能量的協(xié)同作用。（五）細菌的轉化與作圖轉化中供體DNA片段可以攜帶若干個基因，連鎖基因可同時被轉化，但同時被轉化的基因不一定連鎖。黎德伯格等用枯草桿菌進行轉化和重組試驗：

DNA片段進入受體細胞后，可與受體染色體發(fā)生重組。緊密連鎖的兩個基因有較多的機會在同一個DNA片段中→同時整合到受體染色體中。

枯草桿菌菌株trp2+his2+tyr1+

作為供體，提取其DNA向受體trp2-his2-tyr1-菌株進行轉化。

trp2+his2+tyr1+

×

trp2-his2-tyr1-座位轉化體類別trp2+---+++his2++-+--+tyr1+++--+-11940366068541826001071180親本型（++）重組型（+-）和（-+）重組值trp2-his211940+11802600+107+3660+4180.34trp2-tyr111940+1072600+1180+3660+6850.40His2-tyr111940+3660418+1180+685+1070.13三者并發(fā)轉化的頻率高，故這3個基因是連鎖的，其中his2和tyr1連鎖最為緊密：單交換時，染色體開環(huán)易降解，故不存在單交換類型；只有雙交換和偶數(shù)的多交換才有效。第三節(jié)噬菌體的遺傳分析

MicrographofabacteriophageattachingtoabacteriumandinjectingitsDNA

一、噬菌體的結構：1.結構簡單：

蛋白質外殼、核酸、某些碳水化合物、脂肪等。2.多樣性的原因：外殼的蛋白質種類、染色體類型和結構。3.兩大類：①烈性噬菌體：T噬菌體系列（T1~T7）；②溫和性噬菌體:P1和λ噬菌體。T4噬菌體從大腸桿菌中釋放（一）烈性噬菌體

1.概念：烈性噬菌體（virulentphages）：感染宿主細胞后就進入裂解反應，使宿主細胞裂解。2.結構大同小異，外貌一般呈蝌蚪狀：

T偶列噬菌體

頸部：中空的針狀結構及外鞘；尾部：由基板、尾針和尾絲組成。頭部：雙鏈DNA分子的染色體；3.T偶列噬菌體的侵染過程（如T4噬菌體）尾絲固定于大腸桿菌，遺傳物質注入→破壞寄主細胞遺傳物質→降解細菌的染色體，為自身DNA合成提供游離的核苷酸，→合成噬菌體遺傳物質和蛋白質→組裝許多新的子噬菌體→溶菌酶裂解細菌→釋放出大量噬體。T4噬菌體侵染大腸桿菌的生活周期PhageT4,showinitsfreestateandintheprocessofinfectinganE.colicellAgeneralizedbacteriophagelyticcycle（二）溫和噬菌體

1.概念：溫和（溶源性）噬菌體（temperatephages）：感染宿主細胞后具有裂解和溶源兩種發(fā)育途徑。

例如：λ和P1噬菌體，λ和P1各代表一種略有不同的溶源性類型。2.溶源性噬菌體的生活周期：①λ噬菌體：噬菌體侵入后，細菌不裂解→附在E.coli染色體上的gal和bio位點間的attλ座位上→整合到細菌染色體，并能阻止其它λ噬菌體的超數(shù)感染。λ噬菌體特定位點的整合②P1噬菌體：不整合到細菌的染色體上，而是獨立存在于細胞質內。

原噬菌體：整合到宿主基因組中或在染色體外以游離形式存在的噬菌體。僅少數(shù)基因活動，表達出阻礙物關閉其它基因。原噬菌體經(jīng)誘導可轉變?yōu)榱倚允删w→

裂解途徑。3.P1和λ噬菌體的特性：①

P1和λ各代表不同的溶源性類型：

P1噬菌體：侵入后并不整合到細菌的染色體上，獨立存在于細胞質內；

λ噬菌體：通過交換整合到細菌染色體上。②溶源性細菌分裂→兩個子細胞：

P1噬菌體復制則使每個子細胞中至少含有一個拷貝；

λ噬菌體隨細胞染色體復制而復制，細胞中有一個拷貝。③共同特點：核酸既不大量復制，也不大量轉錄和翻譯。P1和λ噬菌體的生活周期特性

溫和噬菌體的感染周期

生活周期分為裂解途徑溶源途徑裂解周期（lyticcycle）溶源周期（lysogeniccycle）Alternativecellcyclesofatemperatephageanditshost

溶源性細菌（lysogenicbacterium）：帶有某種噬菌體，但并不立即導致溶菌的現(xiàn)象稱為溶源性，這樣的細菌就稱為～。非溶源性細菌（non-lysogenicbacterium）：失去原噬菌體的細菌稱為～。

溶源性細菌有兩個重要特性：

1.免疫性：細菌細胞內已有了侵入的噬菌體，再也不會受到同一種噬菌體的侵染。

2.可誘導性：通常由于原噬菌體的自發(fā)誘導，每一代可能有萬分之一溶源性細菌被裂解，釋放出大量噬菌體，這一過程稱為裂解周期。用紫外線或化學物質誘導，90%的溶源性細菌進入裂解周期，完成組裝的完整噬菌體釋放出來。二、溶源性的遺傳基礎

原始E.coli菌株對于λ溫和噬菌體來說是溶源菌。如果F+與F-細胞間進行雜交，發(fā)現(xiàn)雜交結果與所用的溶源菌菌株有關。Zygoticinduction

正交F+

(λ)×F-，即F+細胞是帶有λ噬菌體的溶源菌時，幾乎不產(chǎn)生溶源性重組子?！咴贖fr(λ)×F-中，Hfr菌株的前端基因可在F-受體中出現(xiàn)，但后端基因的重組子得不到。

反交F+

×F-(λ)，即F-細胞是帶有λ噬菌體的溶源菌時，可偶爾產(chǎn)生溶源性重組子。

∵在雜交Hfr×F-(λ)中，Hfr基因轉移到F-細胞，所以有Hfr基因的溶源性F-重組子很容易得到。

合子誘導（zygoticinduction）：溶源性Hfr與非溶源性F-受體雜交時，經(jīng)過一定時間，λ原噬菌體進入一個無免疫能力的細胞，原噬菌體隨即開始復制，使細胞裂解，釋放出游離的噬菌體，這個現(xiàn)象叫~。原噬菌體進入非溶源性細胞后，使受體細胞裂解，這樣在λ噬菌體轉移以后才進入F-細胞的Hfr后端基因就無法得到了。三、噬菌體突變的基因重組與作圖

1.噬菌體遺傳性狀分為兩類：

形成的噬菌斑形狀：指噬菌斑大小、邊緣清晰度、透明程度。

寄主范圍：指噬菌體感染和裂解的菌株范圍。2．T2突變型的兩點測交①正常噬菌體r+：緩慢溶菌，噬菌斑小而邊緣模糊。

r–突變體（rapidlysis，速溶性）：快速溶菌，噬菌斑大而邊緣清楚。②寄主范圍突變體：指能克服噬菌體抗性的突變體。例：h+

噬菌體：只侵染大腸桿菌B株→半透明噬菌斑。

h–突變株：能利用B株和B/2株→透明噬菌斑。

③雙重感染：

h–和h+均能感染B株→可用T2兩個親本h–r+和h+r–同時感染B菌株。

h–r+(透明，小)×h+r–(半透明，大)

↓同時感染B菌株獲得噬菌體子代

親本型：h–r+，h+r–

重組型：h–r–，h+r+將親本型和重組型混合子代

↓感染混合有B和B/2菌株的培養(yǎng)基

↓h–r+(親)：噬菌斑透明、小，邊緣模糊h+r–(親)：噬菌斑半透明、大，邊緣清楚h–r–(重組)：噬菌斑透明、小，邊緣清楚h+r+(重組)：噬菌斑半透明、小，邊緣模糊表型推導的基因型透明，小半透明，大半透明，小透明，大h-r+h+r-h+r+h-r-④重組值計算：重組值=重組噬菌斑數(shù)/總噬菌斑×100%

=[(h+r++h–r–)/(h+r–+h–r++h+r++h–r–)]×100%去掉%即可作為圖距。AdoubleinfectionofE.colibytwophagePlaquephenotypesproducedbyprogenyofthecrossh

－r＋

×h＋

r－

⑤不同的快速溶菌突變型在表型上不同，記作ra、rb、rc，用不同快速溶菌突變型h+rx-與宿主范圍突變型h-rx+雜交。重組值隨著r基因的不同而有變化，可以據(jù)此作連鎖圖。h+r-×h-r+獲得試驗結果列于下表：

分別作出ra

、rb

、rc與h的三個連鎖圖:雜交每一基因型的%重組值h+r+h+r-h-r+h-r-h+ra×

h-r+h+rb×h-r+h+rc×h-r+12.05.90.734.032.039.042.056.059.012.06.40.924/100=24%12.3/100.3=12.3%1.6/99.6=1.6%

四種可能的基因排列連鎖圖:

？

1234再做雜交：rcrb+

×

rc+rb

↓結果表明:rc—rb的重組值>rb—h∴h位于rb及rc之間，排列順序→

rc–h–rb。由于T2噬菌體的連鎖圖是環(huán)狀的，所以2、3排列都對。

3.T4突變型的三點測交

在噬菌體中也可以用三點測交進行基因定位。用T4噬菌體的兩個品系感染大腸桿菌。

一個品系m：小噬菌斑

r：快速溶菌

tu：渾濁溶菌斑另一個品系是對這三個性狀都是野生型+++。T4的mrtu×+++三點測交結果類型噬菌斑數(shù)百分數(shù)%重組頻率m-rr-tum-tu親本類型mrtu+++3467372933.536.1單交換型m+++rtu5204745.04.6√√單交換型mr+++tu8539658.29.3√√雙交換型m+tu+r+1621721.61.7√√合計1034212.920.827.1

根據(jù)這些結果，可繪制出這三個基因的染色體圖：

m←12.9→r←20.8→tu

三點測交所得的8種噬菌斑都可觀察到，因為病毒是單倍體，親本型與重組型可直接從后代中表現(xiàn)出來，直接統(tǒng)計各種噬菌斑類型即可，不必考慮對子代如何進行選擇。四、轉導（transduction）

1.概念：指以噬菌體為媒介進行的細菌遺傳物質重組，是細菌遺傳物質傳遞和交換方式之一。

2.特點：以噬菌體為媒介→細菌的一段染色體被錯誤地

包裝在噬菌體的蛋白質外殼內→通過感染轉移到另一個受體細胞內。

∵感染細菌的能力決定于噬菌體的蛋白質外殼。（一）普遍性轉導（generalizedtransduction）：可以轉移細菌染色體的很多不同部分，這類噬菌體的轉導叫做～。

黎德伯格與津德（1951）發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌中轉導現(xiàn)象。（1）將兩個沙門氏菌的營養(yǎng)缺陷型進行雜交：phe-trp-tyr-met+his+

×

phe+trp+tyr+met-his-

↓混合培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)原養(yǎng)型的菌落

頻率為1/105但在使用戴維斯U形管時也出現(xiàn)了原養(yǎng)性菌落。（2）產(chǎn)生上述結果的原因:

①是否屬于恢復突變?高頻率出現(xiàn)不可能是回復突變。

②是否屬于接合、性導?戴維斯U型管試驗(防止細胞直接接觸)→結果也獲得野生型重組體，排除由于接合或性導而產(chǎn)生基因重組可能性。

③是否屬于轉化?

結果表現(xiàn)為不受DNA酶的影響，排除了由于DNA片斷通過濾片經(jīng)轉化實現(xiàn)基因重組可能性。

（3）唯一可能的結論是：這種重組通過一種過濾性因子實現(xiàn)。

這種過濾性因子稱為FA，不受DNA酶的影響。FA為噬菌體P22（溶源性）。

①濾板孔徑允許這種因子通過，因此稱為過濾因子，而這種因子大小和質量與P22相同；

②免疫學實驗驗證這種因子可以被P22抗血清滅活；

③如果用抗性品系來代替敏感品系，那么在U型管的兩端都不出現(xiàn)野生型重組了。

④進一步研究也驗證了細菌菌株是攜帶P22原噬菌體的溶源性細菌。

P22在感染細菌細胞時，細菌染色體斷裂成小片段。在形成噬菌體顆粒時，偶爾錯誤地把細菌染色體的片段組裝到頭部，而不是他們自己的遺傳物質。

轉導噬菌體（transducingphage）或轉導顆粒（transducingparticles）：把細菌染色體片段包裝在噬菌體蛋白質外殼內而產(chǎn)生的假噬菌體（不包含噬菌體的遺傳物質）。

決定噬菌體的吸附和注入DNA這兩種功能取決于它的蛋白質外殼，所以轉導顆?？梢晕降郊毦毎?，并注入他們的DNA。此時噬菌體DNA中包含了部分的細菌基因。

當轉導噬菌體內容物注入一個受體細胞后，形成一個部分二倍體，然后導入的基因通過重組，整合到宿主細菌的染色體上。錯誤包裝(1/1000機率)同源重組同源重組

噬菌體攜帶供體的染色體片段完全是隨機的，也就是說，供體基因組中所有基因具有同等機會被轉導形成部分二倍體，經(jīng)交換和重組后，形成不同轉導子。各個標記基因轉導頻率大致相同，這種轉導就是普遍性轉導（generaltransduction）。Themechanismofgeneralizedtransduction.∵轉導噬菌體——一般只有0.3%左右噬菌體基因組大小相當于沙門氏菌的1%∴普遍性轉導頻率很低，對每一個基因來說轉導頻率是有限的。頻率：1%×0.3%=3×10-5

如果細菌的兩個基因之間距離大于噬菌體的染色體長度，一般不能同時進行轉導，除非攜帶不同基因顆粒同時感染同一細菌細胞。頻率：10-5×10-5=10-10

共轉導或并發(fā)轉導（cotransduction）：兩個基因同時轉導的現(xiàn)象。

如果兩個基因始終是一起轉導或同時轉導頻率較高，那么可以證明這兩個基因是連鎖的。兩個基因共轉導頻率愈高，表明兩個基因連鎖愈緊密，相反，共轉導頻率愈低，則表明這兩個基因距離愈遠。

雙因子轉導（two-factortransduction）：每次觀察兩個基因的轉導，通過每兩個基因之間的共轉導頻率可以確定這些基因在染色體上的次序。若要分析３個基因則需做３次雙因子轉導實驗，才能確定這３個基因的次序。

假定這３次實驗結果為：①a基因和b基因共轉導的頻率高；②a基因和c基因共轉導頻率也高；③b和c基因的共轉導頻率很低，那么這３個基因的次序就應為b、a、c。

三因子轉導（three-factortransduction）分析，則只做一次實驗就可推出３個基因的次序。以普遍性轉導噬菌體P1為例，測定大腸桿菌的leu（亮氨酸合成)、thr（蘇氨酸合成）、azi(疊氮化鈉抗性）三個基因的順序。每個選擇的標記基因進行多次試驗：三個位點之間的連鎖關系：實驗1：

2種可能排列：

azi

leu

thr

√

leu

azi

thr實驗2：肯定三個基因的順序是：

azi

leu

thr實驗3：證明這一順序，因為leu+和thr+片段之間從未攜帶有azir。實驗選擇的標記基因未選擇的標記基因頻率123

leu+

thr+

leu+thr+50%azir2%thr+3%leu+0%azir

0%azir

通過合轉導關系求出兩基因之間的物理距離：

d=同一染色體上兩基因之間的物理距離；

L=轉導DNA的平均長度；

X=兩個基因共轉導的頻率。由以上公式可知：

轉導DNA的平均長度約為１個病毒基因組的大??；通過試驗測知兩個基因的合轉導頻率，就可估算出兩個基因間的物理距離。

通過3因子轉導可以得到不同類型的轉導子及其頻率，顯然頻率最低的一類轉導子是最難于轉導的，因為它的產(chǎn)生需要同時發(fā)生的交換次數(shù)最多。這種轉導子的3個基因中，兩邊的應為供體基因，中間的受體基因。

例如：大腸桿菌leu+arg+met+細胞作供體，leu-arg-met-作為受體，由P1噬菌體作為載體進行轉導。最初選擇的是leu+轉導子，然后檢查leu+轉導子中其他兩個基因被轉導的情況，得到的轉導子類型和數(shù)目如下：(1)leu+arg-met-453(2)leu+arg+met-114(3)leu+arg+met+36(4)leu+arg-met+0603IncorporationofalatemarkerintotheF－E.colichromosome

可見：

①第四類基因型的轉導子是很難發(fā)生的，由此類轉導子基因型可以看出這三個基因的排列次序是leuargmet；

②

leu+和arg+在第二、三類轉導子中