Sunitinib與奧沙利鉑聯用對人腸癌

Lovo細胞的作用

研究背景

大腸癌是最常見的惡性腫瘤之一,全世界每年大約有接近一百萬新發(fā)病例,同時至少五十萬患者死亡。

20年前,5-Fu是唯一的治療晚期大腸癌有效的藥物,其中位生存期只有12個月左右。近10年來,草酸鉑、伊立替康、卡培他濱等新的細胞毒藥物相繼問世,將中位生存期提高至20個月左右。

傳統的化療缺乏特異性，而靶向治療單藥有效率低，因此，如何將化療與靶向治療有機結合成為腫瘤治療的研究重點。

分子靶向治療常用的治療靶點有：

·細胞受體

·信號傳導

·抗血管生成等

血管生成在腫瘤的生長、侵襲、轉移和演進中起著非常重要的作用血管前期彌散作用生長緩慢實體瘤血管期新生毛細血管生長迅速

研究背景

—

Sunitinib

Sunitinib是一種小分子多靶點酪氨酸激酶抑制劑,,對血小板衍生生長因子受體(PDGFR)、血管內皮生長因子受體(VEGFR)、干細胞因子受體(C-Kit)等多種受體酪氨酸激酶具有抑制作用。

圖1Sunitinib抗腫瘤作用機制

Sunitinib單藥臨床有效率低,如何與化療聯合提高抗癌效應備受關注。

研究背景

—奧沙利鉑

奧沙利鉑(Oxaliplatin)是一種水溶性的鉑類復合物,對腫瘤細胞有細胞毒作用,具有抗腫瘤活性是由于鉑化后鏈間和鏈內形成加合物致DNA合成抑制,抗腫瘤活性不受DNA錯配修復缺陷或復制旁路強化的影響,與順鉑和卡鉑無交叉耐藥。研究內容根據細胞生長曲線及單藥作用抑制率設計實驗方案先奧沙利鉑+sunitinib24h后sunitinib48h

先奧沙利鉑24h后sunitinib72h

化療藥物聯合舒尼替尼作用于腫瘤細胞系先sunitinib72h后奧沙利鉑24h

實驗方法

—

材料細胞株：大腸癌Lovo細胞主要試劑及試劑盒：注射用奧沙利鉑（Oxaliplatin）蘋果酸舒尼替尼（Sunitinib/Sutent）

Hoechst凋亡試劑盒

細胞周期及凋亡檢測試劑盒

實驗方法

—

材料主要儀器設備：

流式細胞儀酶標儀熒光顯微鏡

實驗流程結腸癌Lovo細胞舒尼替尼細胞學實驗細胞增殖與活力檢測化療藥物（奧沙利鉑）周期及凋亡檢測AnnexinV聯合PI法MTT法Hoechst法選定幾種最佳的藥物聯合治療方案

實驗方法

—

主要試劑配制逐次稀釋蘋果酸舒尼替尼、奧沙利鉑，使之成系列濃度。

實驗方法

—

MTT法檢測細胞增殖情況

單藥處理：

培養(yǎng)細胞鋪板加化療藥

加DMSO棄液加MTT震蕩酶標儀測值數據處理

實驗方法

—

MTT法檢測細胞增殖情況

雙藥處理：

培養(yǎng)細胞鋪板加抑制劑

加DMSO加MTT加化療藥震蕩酶標儀測值數據處理

實驗方法

—

Hoechst法證實細胞凋亡存在

·正常細胞對染料拒染，熒光著色淡

·凋亡細胞主要攝取Hoechst染料呈強藍色熒光

·處于亞二倍體區(qū)的細胞群屬于形成凋亡小體的細胞

實驗方法

—

Hoechst法證實細胞凋亡存在

培養(yǎng)細胞藥物干預單細胞懸液

染色洗滌固定

洗滌鋪片檢測

實驗方法

—

AnnexinV－PI法檢測凋亡培養(yǎng)細胞藥物干預單細胞懸液

孵育加試劑分裝流式細胞儀分析

實驗結果

—

不同時間抑制率比較

圖2藥物Sunitinib在不同時間對Lovo細胞的抑制（%）變異來源自由度SSMSFP處理組間變異21431.1819715.591014.280.0012區(qū)組間變異5931.8561346.37215.920.0301誤差10500.980950.0981總變異172664.0189注：方差齊性檢驗P=0.1904

經分析結果顯示,處理組間變異F=14.28，P=0.0012，可以認為不同用藥時間抑制率值的差異具有統計學意義；三組之間的兩兩比較采用SNK-q檢驗，三組間差異均具有統計學意義；區(qū)組間變異F=5.92，P=0.0301，可以認為不同用藥濃度抑制率值的差異具有統計學意義。Sunitinib作用于Lovo細胞表現出明顯的時間、濃度依賴性

實驗結果

—

不同時間抑制率比較

圖3

藥物奧沙利鉑在不同時間對Lovo細胞的抑制（%）變異來源自由度SSMSFP處理組間變異22.60471.30378.340.0913區(qū)組間變異53884.7101776.94204653.40<0.0001誤差101.6696210.166962總變異173888.9871注：方差齊性檢驗P=0.1904

經分析結果顯示,處理組間變異F=8.34，P=0.0913，尚不能認為不同用藥時間抑制率值的差異具有統計學意義；區(qū)組間變異F=4653.40，P<0.0001，可以認為不同用藥濃度抑制率值的差異具有統計學意義。奧沙利鉑的時間依賴性效應相對不明顯，存在濃度依賴性

實驗結果

—

不同時間抑制率比較注：A奧沙利鉑

BSunitinib圖4不同方案在各測量時間對Lovo細胞的抑制（%）變異來源自由度SSMSFP處理組間變異42628.4726657.112835.07<0.0001區(qū)組間變異53064.5971612.919432.71<0.0001誤差20374.788818.7394總變異296067.8585注：方差齊性檢驗P=0.1904

經分析結果顯示,處理組間變異F=35.07，P<0.0001，可以認為不同給藥方案抑制率值的差異具有統計學意義；五組之間的兩兩比較采用SNK-q檢驗，五組間差異均具有統計學意義；區(qū)組間變異F=32.71，P<0.0001，可以認為不同用藥濃度抑制率值的差異具有統計學意義。

實驗結果

—

細胞周期

腸癌Lovo細胞經奧沙利鉑作用24h再經Sunitinib作用72h后，G0/G1

期細胞由61.18%±2.27%下降到6.58%±2.16%,S

期細胞由29.35%±1.23%下降到28.47%±1.83%,而G2/M

期細胞由11.79%±2.08%上升到66.84%±2.44%。由此可見，先奧沙利鉑后Sunitinib聯合方案能將更多的細胞阻滯在G2/M期。實驗結果

—

細胞凋亡

腸癌Lovo細胞經奧沙利鉑作用24h再經Sunitinib作用72h后，早期凋亡率為13.28%±1.64%，晚期調往率為8.77%±2.52%，總凋亡率為20.85%±2.32%。

Hoechst法結果

圖5對照組Lovo細胞的熒光顯像（×100）

圖6最佳方案處理組Lovo細胞的熒光顯像（×200）

（先奧沙利鉑24h后Sunitinib72h組）

討論

Sunitinib與奧沙利鉑聯用作用于人腸癌Lovo細胞存在最佳聯合模式,其可將可將細胞阻滯在G2/M期，存在顯著凋亡。

討論

提示:已知化療藥物誘導細胞損傷后，部分細胞在G2/M期開始DNA修復和分裂，從而逃避凋亡。奧沙利鉑后給予Sunitinib可將細胞阻滯在G2/M期，進一步干擾損傷細胞的修復，維持奧沙利鉑誘導的凋亡。

討論

提示：奧沙利鉑引起的細胞損傷后,腫瘤細胞為逃避死亡，可能激活信號傳導通路,在這種情況下，Sunitinib阻斷通路,聯合細胞毒作用，可誘導腫瘤細胞的凋亡，并造成腫瘤細胞的不可修復性損害。

結論

本研究著眼于Sunitinib與化療藥物聯合方案的臨床合理應用，旨在為Sunitinib用于腸癌治療提供聯合用藥的實驗依據。具體研究結論可歸納為以下兩點：1、Sunitinib與奧沙利鉑聯合的體外抗腫瘤作用存在方案