HIV檢測(cè)技術(shù)HIV檢測(cè)技術(shù)1艾滋病實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)HIV抗體測(cè)定抗原測(cè)定核酸測(cè)定病毒分離CD4淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)艾滋病實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)HIV抗體測(cè)定2急性期潛伏期窗口期HIV感染以后的血清學(xué)動(dòng)態(tài)Anti-P24Anti-gp41/120(anti-gp36)HIVRNAAnti-Ag感染1周2周3周4周….1年2年3年…………….10年………..艾滋病期Anti-Ab濃度急性期潛伏期窗口期HIV感染以后的血清學(xué)動(dòng)態(tài)Anti-P243

HIV抗體檢測(cè)的目的和要點(diǎn)HIV抗體檢測(cè)可用于診斷、血液篩查、監(jiān)測(cè)等。以診斷為目的的檢測(cè)是為了確定個(gè)體HIV感染狀況，包括臨床檢測(cè)、自愿咨詢檢測(cè)、根據(jù)特殊需要進(jìn)行的體檢等。HIV抗體檢測(cè)的目的和要點(diǎn)HIV抗體檢測(cè)可用于診斷、血4以血液篩查為目的的檢測(cè)是為了防止輸血傳播HIV，包括獻(xiàn)血員篩查和原料血漿篩查。以監(jiān)測(cè)為目的的檢測(cè)是為了解不同人群HIV感染率及其變化趨勢(shì)，包括各類(lèi)高危人群、重點(diǎn)人群和一般人群。以血液篩查為目的的檢測(cè)是為了防止輸血傳播HIV，包括獻(xiàn)血員篩5初篩實(shí)驗(yàn)室設(shè)備條件獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室用房，建筑設(shè)備和儀器要符合要求II級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室酶標(biāo)儀，洗板機(jī)，精確移夜管，專(zhuān)用冰箱，離心機(jī)，水浴箱，溫箱等消毒和污染處理設(shè)施安全防護(hù)設(shè)施初篩實(shí)驗(yàn)室設(shè)備條件獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室用房，建筑設(shè)備和儀器要符合要求I6艾滋病檢測(cè)方法的意義HIV抗體篩查檢測(cè)

HIV/AIDS的篩查，但初篩陽(yáng)性結(jié)果不能做為艾滋病診斷依據(jù)，需將該標(biāo)本送確證實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行確證。HIV抗體確認(rèn)檢測(cè)（免疫印跡試驗(yàn)）

HIV/AIDS診斷的唯一依據(jù)艾滋病確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)HIV核酸檢測(cè)輔助診斷：在特殊情況下，如出現(xiàn)某些非典型的抗體反應(yīng)，特別是不確定反應(yīng)時(shí)，RNA的測(cè)定可提供有用的證據(jù)。感染早期：在HIV感染的窗口期，無(wú)法使用抗體檢測(cè)進(jìn)行診斷，此時(shí)RNA的測(cè)定具有特殊的意義，提示是否有感染的可能，但仍需追蹤檢測(cè)HIV抗體，最終根據(jù)抗體的檢測(cè)情況做出診斷。病程監(jiān)控：幫助確定疾病發(fā)展的階段。指導(dǎo)治療方案及療效測(cè)定。預(yù)測(cè)疾病進(jìn)程。艾滋病檢測(cè)方法的意義HIV抗體篩查檢測(cè)7抗體檢測(cè)

根據(jù)檢測(cè)HIV感染后產(chǎn)生的HIV抗體的間接指標(biāo)而發(fā)展起來(lái)的血清學(xué)診斷技術(shù)，分為初篩試驗(yàn)和確認(rèn)試驗(yàn)。

初篩試驗(yàn)用于對(duì)檢測(cè)對(duì)象感染情況的初步篩查，檢測(cè)結(jié)果可能會(huì)有假陽(yáng)性，不能發(fā)抗體陽(yáng)性報(bào)告確認(rèn)試驗(yàn)確定檢測(cè)對(duì)象是否有HIV抗體，可發(fā)抗體陽(yáng)性報(bào)告

抗體檢測(cè)8酶聯(lián)免疫試驗(yàn)(ELISA)最早用于檢測(cè)血清中HIV抗體的有效篩檢方法很高的敏感性和特異性根據(jù)檢測(cè)方法，可分成4類(lèi)間接法、雙抗原夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法和捕獲法HIV抗體檢測(cè)試劑根據(jù)其抗原的來(lái)源和檢測(cè)方式可分為四代

酶聯(lián)免疫試驗(yàn)(ELISA)最早用于檢測(cè)血清中HIV抗體9篩查試驗(yàn)篩查試劑經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局注冊(cè)批準(zhǔn)在試劑有效期內(nèi)酶聯(lián)免疫試劑應(yīng)批批檢合格臨床質(zhì)量評(píng)估敏感性和特異性高篩查試驗(yàn)10第一代ELISA試劑包被抗原：全病毒裂解抗原窗口期：6-8星期優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，可檢出各種抗體缺點(diǎn)：制備麻煩，成本高，假陽(yáng)性1985年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)第一個(gè)HIV抗體篩選試劑第一代ELISA試劑包被抗原：全病毒裂解抗原11第二代ELISA試劑包被抗原：重組抗原、合成多肽窗口期：4-5星期優(yōu)點(diǎn)：重組抗原可消除HLA（人類(lèi)白細(xì)胞抗原）所致的抗體假陽(yáng)性，生產(chǎn)成本低，不使用HIV病毒顆粒，較為安全，敏感性特異性較高缺點(diǎn)：仍有一定的假陽(yáng)性1990年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)第一個(gè)重組抗原篩選試劑第二代ELISA試劑包被抗原：重組抗原、合成多肽12第三代ELISA試劑包被抗原：重組抗原加合成多肽合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一個(gè)抗原決定簇，純度高，特異性也高窗口期：3星期左右優(yōu)點(diǎn)：可檢測(cè)所有不同種類(lèi)的抗體，增加了試劑的敏感性和特異性1994年發(fā)展了雙抗原夾心法，酶標(biāo)物由抗人IgG改變?yōu)樘禺愋訦IV抗原第三代ELISA試劑包被抗原：重組抗原加合成多肽13第四代ELISA試劑包被物：重組或多肽抗原+重組抗體窗口期：2星期左右優(yōu)點(diǎn)：同時(shí)檢測(cè)HIV抗原抗體，縮短窗口期注意：抗原檢測(cè)敏感性低于單獨(dú)抗原試劑(50~70pg/ml,5~10pg/ml)1998年第四代試劑首次上市第四代ELISA試劑包被物：重組或多肽抗原+重組抗體14

HIV抗體試劑盒進(jìn)展代次 抗原 方法 檢測(cè)時(shí)間 1 全病毒 間接 >2個(gè)月 2 重組或多肽 間接 3-4周 3 重組+多肽 夾心 2-3周 4 抗原+抗體 夾心 2周左右

HIV抗體試劑盒進(jìn)展代次 抗原 方法 檢測(cè)時(shí)間15Closingthewindow<infectivity=>4thgen3rdgen=>

=>1st-2ndgenHIVantigenIgMabIgGabDetectionlimit<=window第一/二代試劑檢測(cè)IgG抗體，第三代試劑檢測(cè)IgG、IgM抗體,第四代試劑同時(shí)檢測(cè)IgG、IgM抗體和P24抗原使窗口期縮短。Closingthewindow<infectivit16篩查樣品HIV抗體篩查可采用血清、血漿、濾紙干血斑、唾液和尿液樣品。篩查樣品HIV抗體篩查可采用血清、血漿、濾紙干血斑、唾液和尿17唾液檢測(cè)試劑在硝酸纖維膜上包被人工合成的HIVgp41/gp36蛋白抗原，可以同時(shí)檢測(cè)HIV－1/HIV－2抗體，原理為酶免間接法。ELISA、免疫印跡法（WB）已經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)唾液檢測(cè)試劑在硝酸纖維膜上包被人工合成的HIVgp41/gp18優(yōu)點(diǎn):1.樣品穩(wěn)定,各種溫度下穩(wěn)定性大于三周2.敏感性和特異性與標(biāo)準(zhǔn)的血清學(xué)實(shí)驗(yàn)相當(dāng)缺點(diǎn):1.預(yù)處理復(fù)雜，重復(fù)性較差2.會(huì)出現(xiàn)不同于血清抗體的種類(lèi)和滴度優(yōu)點(diǎn):19

尿液檢測(cè)試劑

適用對(duì)象：靜脈吸毒人群，其他高危人群的大面積流調(diào)、監(jiān)測(cè)優(yōu)點(diǎn)：1.采集、處理費(fèi)用低，較血液標(biāo)本安全2.HIV抗體在尿中十分穩(wěn)定，尿液中IgG與血液相當(dāng)缺點(diǎn)：1.檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)2.精確性低于血、唾液，陽(yáng)性者需作血清學(xué)檢測(cè)尿液檢測(cè)試劑適用對(duì)象：靜脈吸毒人群，其他高危人群的20篩查方法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）化學(xué)發(fā)光或免疫熒光試驗(yàn)快速檢測(cè)（RT）

明膠顆粒凝集試驗(yàn)（PA）免疫滲濾試驗(yàn)：斑點(diǎn)ELISA和斑點(diǎn)免疫膠體金（或膠體硒）快速試驗(yàn)免疫層析試驗(yàn)篩查方法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）21酶聯(lián)

酶聯(lián)免疫吸附－－ELISA方法間接法夾心法－－雙抗原和雙抗體競(jìng)爭(zhēng)法捕獲法酶聯(lián)酶聯(lián)免疫吸附－－ELISA方法22間接ELISA方法

Ag+Ab+Ab-E酶標(biāo)記抗人IgG標(biāo)本中的HIV抗體底物酶產(chǎn)生顏色HIV抗原固體載體間接ELISA方法酶標(biāo)記抗人IgG標(biāo)本23雙抗原夾心法Ag+Ab+Ag-E標(biāo)本中HIV抗體HIV抗原酶標(biāo)的HIV抗原雙抗原夾心法標(biāo)本中HIV抗體HIV抗原酶24雙抗原夾心法

Ag+Ab+Ag-E用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋?zhuān)芍苯佑糜跍y(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高于間接法。HIV第三代試劑都是運(yùn)用此法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。雙抗原夾心法

Ag+Ab+Ag-25

竟?fàn)嶦LISA法

Ag+Ab+Ab-E病人血清底物無(wú)色或很微量反應(yīng)酶標(biāo)抗體HIV抗原產(chǎn)生顏色竟?fàn)嶦LISA法

Ag+Ab+Ab-E26

抗原捕獲法將抗HIV-McAb包被固相板中加入HIV特異性Ag

待檢血清標(biāo)本

酶標(biāo)－Ab/(E標(biāo)抗人－IgG)

底物顯色

抗原捕獲法27抗體捕獲法（特異抗體捕獲）

抗人－IgG包被固相載體

待檢血清標(biāo)本（總IgG）E標(biāo)記HIV－Ａｇ底物

特點(diǎn)：提高敏感性\特異性抗體捕獲法（特異抗體捕獲）28試劑的平衡在ELISA測(cè)定中試劑的準(zhǔn)備最為關(guān)鍵的是，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將試劑盒先從冰箱中取出，在室溫下放置20分鐘以上后，再進(jìn)行測(cè)定，以使試劑盒在使用前與室溫平衡。這樣做的目的，主要是為了在后面的溫育反應(yīng)步驟中，能使反應(yīng)微孔內(nèi)的溫度能較快地達(dá)到所要求的高度，以滿足測(cè)定要求。試劑的平衡在ELISA測(cè)定中試劑的準(zhǔn)備最為關(guān)鍵的是，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)29加樣及試劑加樣應(yīng)用微量移液器（加樣槍)按規(guī)定的量加入微孔板的下1/3處，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡，否則會(huì)導(dǎo)致加樣不均勻或污染，加樣保持勻速：太快，無(wú)法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區(qū)，易導(dǎo)致非特異吸附。濺出會(huì)對(duì)鄰近孔產(chǎn)生污染。。每次加樣應(yīng)更換吸頭，做到一人一吸頭，以免發(fā)生交叉污染;干吸頭預(yù)先在血清中抽吸三次。加樣及試劑加樣應(yīng)用微量移液器（加樣槍)按規(guī)定的量加入微孔板的30樣本稀釋?zhuān)康氖菫榱藴p少非特異性反應(yīng)，所以一定要先加稀釋液后加樣本，特別注意加樣后要在微量振蕩器上振蕩30秒鐘，同時(shí)注意防止液體溢出。如后面操作步驟中加二種以上試劑時(shí)均需振蕩混勻。如用滴瓶滴加試劑應(yīng)先將滴瓶搖勻并擠去第一滴有氣泡的試劑后加樣

樣本稀釋?zhuān)康氖菫榱藴p少非特異性反應(yīng)，所以一定要先加稀釋液后31溫度和時(shí)間溫育溫度：ELISA作為一種固相免疫測(cè)定，抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)在固相上進(jìn)行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原完全結(jié)合，必須在一定的溫度條件下反應(yīng)一定的時(shí)間。溫育所需時(shí)間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時(shí)間相對(duì)較短。最為常用的溫育溫度為37℃。溫育時(shí)間：孔內(nèi)溫度從室溫升至37℃，需要一定的時(shí)間，尤其是在室溫比較低以及非水浴的狀態(tài)下，這段升溫時(shí)間可能還比較長(zhǎng)。注意弱陽(yáng)性標(biāo)本。溫度和時(shí)間溫育溫度：ELISA作為一種固相免疫測(cè)定，抗原抗體32邊緣效應(yīng)的排除：即外周孔顯色較中心孔深。研究證實(shí)在溫育中的熱力學(xué)梯度可能是根本原因之所。所以溫育一般采用能使反應(yīng)液溫度迅速達(dá)到平衡的水浴法。一種是放在水浴箱的隔板上，使板條與水直接接觸，另一種是放在溫箱的濕盒里。水要浸至板條的1/3處，不可將板條疊加放置。排除邊緣效應(yīng)可以提高實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性。

邊緣效應(yīng)的排除：即外周孔顯色較中心孔深。研究證實(shí)在溫育中的熱33洗滌ELISA是靠洗滌來(lái)達(dá)到分離結(jié)合與未結(jié)合抗原抗體復(fù)合物及酶標(biāo)記物的目的，同時(shí)洗滌也可將非特異吸附的蛋白質(zhì)的干擾以及血球、細(xì)菌中的酶干擾清除掉。艾滋病檢測(cè)要求使用洗板機(jī)：減少操作者人為誤差、保護(hù)操作者、降低板孔殘液量。洗滌ELISA是靠洗滌來(lái)達(dá)到分離結(jié)合與未結(jié)合抗原抗體復(fù)合物及34以HRP作為標(biāo)記酶的ELISA試劑盒中使用的洗板液一般為含0.05%Tween20的中性PBS，Tween20為一種非離子去垢劑，既含親水基團(tuán)，也含疏水基團(tuán)，其作用機(jī)理是，借助其疏水基團(tuán)與經(jīng)疏水性相互作用被動(dòng)吸附于聚苯乙烯固相上蛋白的疏水基團(tuán)形成疏水鍵，從而削弱蛋白與固相的吸附，促使蛋白質(zhì)脫離固相而進(jìn)入液相，這樣就可達(dá)到去掉非特異吸附物的目的。以HRP作為標(biāo)記酶的ELISA試劑盒中使用的洗板液一般為含035但由于抗體或抗原的包被通常也是通過(guò)在堿性條件下與固相的疏水性相互作用而被動(dòng)吸附于固相，因此要注意非離子去垢劑的使用濃度，洗板液中Tween20濃度高于0.2%，可使包被于固相上的抗原或抗體解吸附而影響試驗(yàn)的測(cè)定下限。

但由于抗體或抗原的包被通常也是通過(guò)在堿性條件下與固相的疏水性36顯色一般商品試劑盒顯色反應(yīng)條件為37℃。從理論上說(shuō)，37℃25~30分鐘才可以使HRP的底物催化反應(yīng)完全，盡管在最初的10分鐘內(nèi)，絕大部份催化反應(yīng)即可完成。但為使弱陽(yáng)性樣本孔能有充分的顯色，應(yīng)在37℃下反應(yīng)30分鐘后終止反應(yīng)。一般底物經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達(dá)頂峰，隨即逐漸減弱，至2小時(shí)后即可完全消退至無(wú)色。顯色一般商品試劑盒顯色反應(yīng)條件為37℃。從理論上說(shuō)，37℃237此外，在加入底物前，最好是先檢查一下底物溶液的有效性，即可將A和B兩種液各加一滴于清潔的空板孔或eppendorf管中，觀察是否有顯色出現(xiàn)，如有，則說(shuō)明底物已變質(zhì)。此外，在加入底物前，最好是先檢查一下底物溶液的有效性，即可將38比色ELISA的比色測(cè)定由酶標(biāo)儀進(jìn)行

顯色反應(yīng)終止后應(yīng)在30分鐘內(nèi)完成比色雙波長(zhǎng)比色：校正波長(zhǎng)均用630nm。在敏感波長(zhǎng)（450nm）和非敏感波長(zhǎng)（630nm）下各測(cè)定一次。建議盡量使用雙波長(zhǎng)比色調(diào)零而不用空白對(duì)照調(diào)零.比色ELISA的比色測(cè)定由酶標(biāo)儀進(jìn)行39讀數(shù)使用雙波長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)可以消除反應(yīng)板條上的劃痕手印的干擾。同時(shí)要注意反應(yīng)板應(yīng)用吸水紙擦干后才能置酶標(biāo)儀中比色，否則吸光度易出現(xiàn)負(fù)值或損壞濾光片。讀數(shù)使用雙波長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)可以消除反應(yīng)板條上的劃痕手印的干擾。同時(shí)40酶聯(lián)實(shí)驗(yàn)的影響因素標(biāo)本的采集和保存一般使用血清（漿）。標(biāo)本采集時(shí)應(yīng)盡量避免溶血，因紅細(xì)胞破裂可釋放過(guò)氧化物酶活性物質(zhì)干擾結(jié)果，可造成假陽(yáng)性；長(zhǎng)菌的標(biāo)本會(huì)因細(xì)菌分泌一些酶，干擾酶聯(lián)反應(yīng)；抗凝不完全的標(biāo)本因纖維蛋白元的干擾而造成假陽(yáng)性，建議盡量不用抗凝血尤其是用肝素抗凝劑。酶聯(lián)實(shí)驗(yàn)的影響因素標(biāo)本的采集和保存41標(biāo)本在冰箱中保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易導(dǎo)致血清IgG聚合，使間接法的試劑本底加深，一般血清置4℃冰箱5天內(nèi)完成測(cè)試。如需保存一周以上則要-20℃冰凍保存融解時(shí)應(yīng)上下顛倒充分混勻，同時(shí)避免氣泡盡量避免反復(fù)凍融，反復(fù)凍融過(guò)程中產(chǎn)生的機(jī)械剪切力將對(duì)樣本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用標(biāo)本在冰箱中保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易導(dǎo)致血清IgG聚合，使間接法的試劑42ELISA的靈敏度>1ng/ml水平上,因此要盡量避免標(biāo)本間的污染。標(biāo)本在保存中如出現(xiàn)細(xì)菌污染所致的混濁或絮狀物時(shí)，應(yīng)離心沉淀后取上清檢測(cè)。

ELISA的靈敏度>1ng/ml水平上,因此要盡量避免標(biāo)本間43ELISA試驗(yàn)中可能出現(xiàn)的問(wèn)題及原因分析問(wèn)題可能的原因（非試劑盒本身的原因）弱陽(yáng)性質(zhì)控樣本檢測(cè)不出溫育的時(shí)間或溫度不夠；顯色反應(yīng)時(shí)間太短；測(cè)定的重復(fù)性差（相同樣本兩次測(cè)定結(jié)果不一致）（1）加樣本及試劑量不準(zhǔn)；孔間不一致；（2）加樣過(guò)快，孔間發(fā)生污染；（3）加錯(cuò)樣本；（4）加樣本及試劑時(shí)，加在孔壁上部非包被區(qū)；（5）不同批號(hào)試劑盒中組分混用；（6）溫育時(shí)間、洗板、顯色時(shí)間不一致；（7）孔內(nèi)污染雜物；（8）酶標(biāo)儀濾光片不正確；（9）血清標(biāo)本未完全凝固即加入，反應(yīng)孔內(nèi)出現(xiàn)纖維蛋白凝固或殘留血細(xì)胞，易出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)等。ELISA試驗(yàn)中可能出現(xiàn)的問(wèn)題及原因分析問(wèn)題可能的原因（非試44問(wèn)題可能的原因（非試劑盒本身的原因）白板（陽(yáng)性對(duì)照不顯色）（1）漏加酶結(jié)合物；（2）洗板液配制中出現(xiàn)問(wèn)題，如量筒不干凈，含酶抑制物（如疊氮鈉）等。（3）漏加顯色劑A或B；（4）終止劑當(dāng)顯色劑使用。全部板孔均有顯色（1）洗板不干凈；（2）顯色液變質(zhì)；（3）加底物的吸尖受酶或金屬離子污染；（4）洗板液受酶等污染。（5）由于儀器或加樣頭造成的交叉污染。

問(wèn)題可能的原因（非試劑盒本身的原因）白板（陽(yáng)性對(duì)照不顯色）45化學(xué)發(fā)光或免疫熒光試驗(yàn)這類(lèi)試劑采用發(fā)光或熒光底物，既可檢測(cè)抗體，也可聯(lián)合檢測(cè)抗原抗體。原理：HIV抗原或抗體包被于固相載體，加入待檢樣品和酶或熒光標(biāo)記的HIV抗原或抗體，加發(fā)光或熒光底物，用發(fā)光或熒光儀測(cè)定結(jié)果。有效試驗(yàn)的陰性和陽(yáng)性對(duì)照必須符合試劑盒規(guī)定?；瘜W(xué)發(fā)光或免疫熒光試驗(yàn)這類(lèi)試劑采用發(fā)光或熒光底物，既可檢測(cè)抗46快速檢測(cè)（RT）及其它檢測(cè)試驗(yàn)這類(lèi)試驗(yàn)簡(jiǎn)便快速，適用于應(yīng)急檢測(cè)、門(mén)診急診檢測(cè)。一般可在10～30分鐘內(nèi)得出結(jié)果。快速檢測(cè)（RT）及其它檢測(cè)試驗(yàn)這類(lèi)試驗(yàn)簡(jiǎn)便快速，適用于應(yīng)急檢47①明膠顆粒凝集試驗(yàn)（PA）：原理：將HIV抗原致敏明膠顆粒作為載體，與待檢樣品作用。當(dāng)待檢樣品含有HIV抗體時(shí)，明膠顆粒與抗體發(fā)生凝集反應(yīng)，根據(jù)凝集情況判讀結(jié)果。PA試劑有兩種:同時(shí)檢測(cè)HIV-1和HIV-2抗體以及分別檢測(cè)HIV-1和HIV-2抗體。有效試驗(yàn)必須有陰性和陽(yáng)性質(zhì)控。①明膠顆粒凝集試驗(yàn)（PA）：48凝集實(shí)驗(yàn)常用的載體：紅細(xì)胞、聚苯乙烯乳膠顆粒、明膠顆粒、活性碳或硅膠鋁顆粒凝集實(shí)驗(yàn)常用的載體：紅細(xì)胞、聚苯乙烯乳膠顆粒、明膠顆粒、活性49前滯現(xiàn)象：反應(yīng)中抗體含量過(guò)多，影響抗原抗體的理想結(jié)合，大量抗體結(jié)合于抗原阻礙了交叉聯(lián)結(jié)符合體的形成，使肉眼觀察不到凝集現(xiàn)象，造成假陰性。解決辦法：稀釋樣品前滯現(xiàn)象：50凝集試驗(yàn)注意事項(xiàng)試驗(yàn)應(yīng)設(shè)對(duì)照，特別是未包被抗原的載體對(duì)照，以防止非特異載體凝集反應(yīng)的干擾乳膠試劑對(duì)于凍融過(guò)的血清假陽(yáng)性率高，對(duì)于新鮮血清沒(méi)有這種現(xiàn)象。乳膠試劑切忌凍結(jié)，凍結(jié)后易發(fā)生自凝結(jié)果判讀要及時(shí)，避免假陽(yáng)性凝集試驗(yàn)注意事項(xiàng)試驗(yàn)應(yīng)設(shè)對(duì)照，特別是未包被抗原的載體對(duì)照，以51HIV抗體檢測(cè)（明膠顆粒凝集試驗(yàn)）材料

血清標(biāo)本,U型板,PA試劑盒(“A”溶解用液,”B”血清稀釋液,”C”致敏顆粒,”D”非致敏顆粒,陽(yáng)性對(duì)照血清,專(zhuān)用滴管.方法

(1)從4℃冰箱取出試劑盒,恢復(fù)至室溫后使用.(2)從1:4開(kāi)始做倍比稀釋.(3)用專(zhuān)用滴管,第二孔加1滴(25ul)非致敏顆?！盌”,第三孔加1滴(25ul)致敏顆?！盋”.(4)輕輕拍打微量板或在振蕩器上振蕩1分鐘混合后,室溫(20℃)靜置2小時(shí)后觀察結(jié)果.HIV抗體檢測(cè)（明膠顆粒凝集試驗(yàn)）材料52HIV抗體檢測(cè)（明膠顆粒凝集試驗(yàn)）結(jié)果判斷明膠顆粒沉積在孔底,周邊平滑,或形成致密圓圈者為陰性結(jié)果.(-)明膠顆粒沉積在孔底,中央形成致密小環(huán),周邊平滑為可疑反應(yīng).(+_)孔內(nèi)有清晰的寬環(huán)且外緣粗糙者,為陽(yáng)性結(jié)果.(+/++)孔內(nèi)凝聚顆粒形成均一的膜覆蓋在整個(gè)孔底者為強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng).(+++/++++)孔內(nèi)樣品與致敏和非致敏顆粒均產(chǎn)生凝集者,則需作重吸收試驗(yàn)后進(jìn)一步檢測(cè).HIV抗體檢測(cè)（明膠顆粒凝集試驗(yàn)）結(jié)果判斷53②免疫滲濾試驗(yàn)：斑點(diǎn)ELISA和斑點(diǎn)免疫膠體金（或膠體硒）快速試驗(yàn)原理：均以硝酸纖維膜為載體，HIV抗原點(diǎn)狀固定在膜上，加待檢樣品。陽(yáng)性結(jié)果在膜上抗原部位顯示出有色斑點(diǎn)。反應(yīng)時(shí)間在10分鐘以內(nèi)。有效試驗(yàn)的質(zhì)控點(diǎn)必須顯色。②免疫滲濾試驗(yàn)：斑點(diǎn)ELISA和斑點(diǎn)免疫膠體金（或膠體硒）54③免疫層析試驗(yàn)原理：以硝酸纖維膜為載體，HIV抗原線狀固定在膜上，待檢樣品（血液或唾液）沿著固相載體遷移，陽(yáng)性結(jié)果在膜上抗原部位顯示出有色條帶。有效試驗(yàn)的質(zhì)控帶必須顯色。③免疫層析試驗(yàn)55ELISA試劑（13種）麗珠、生物梅里埃、萬(wàn)泰、MUREX、綠科、永華、金豪、科華、新創(chuàng)、普生、中山、華美、吉比愛(ài)快速試劑（7種）科華、新創(chuàng)、PA、雅培、EY、艾康、萬(wàn)泰ELISA試劑（13種）56抗體初篩試驗(yàn)的局限性陽(yáng)性結(jié)果不能確認(rèn)，需用其他試劑復(fù)查陰性結(jié)果不能排除HIV感染：在感染早期，血清陽(yáng)轉(zhuǎn)前存在“窗口期”，在感染晚期，某些抗體可能檢測(cè)不到（如p24抗體）。反應(yīng)中抗體過(guò)量，抗原抗體比例不合適而不能形成特定結(jié)購(gòu)，出現(xiàn)凝集抑制。不能診斷<18月齡嬰兒的母嬰垂直感染新出現(xiàn)的亞群難以檢測(cè)抗體初篩試驗(yàn)的局限性陽(yáng)性結(jié)果不能確認(rèn)，需用其他試劑復(fù)查57HIV抗體初篩檢測(cè)結(jié)果解釋如何判斷嬰兒是否感染了HIV？感染了HIV的母親所生的嬰兒可能通過(guò)胎盤(pán)帶有來(lái)自母體的HIV的IgG抗體，此時(shí)HIV抗體檢測(cè)陽(yáng)性并不意味著已被感染。建議在嬰兒9個(gè)月時(shí)進(jìn)行HIV初篩檢測(cè)

如陰性，則判定為未感染HIV。如陽(yáng)性，則應(yīng)在嬰兒18個(gè)月時(shí)進(jìn)行復(fù)檢

陰性：判定為未感染。陽(yáng)性：則將血樣送至確證實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行HIV抗體的確認(rèn)試驗(yàn)。HIV抗體初篩檢測(cè)結(jié)果解釋如何判斷嬰兒是否感染了HIV？58

確認(rèn)試驗(yàn)的試劑

必須是經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局注冊(cè)批準(zhǔn)、在有效期內(nèi)的試劑。

確認(rèn)試驗(yàn)方法

包括免疫印跡試驗(yàn)（WB）、條帶免疫試驗(yàn)（LIATEKHIVⅢ）、放射免疫沉淀試驗(yàn)（RIPA）及免疫熒光試驗(yàn)（IFA）。

國(guó)內(nèi)常用的確認(rèn)試驗(yàn)方法是WB。HIV抗體確認(rèn)試驗(yàn)確認(rèn)試驗(yàn)的試劑

必須是經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局59

確認(rèn)檢測(cè)流程

先用HIV-1/2混合型試劑進(jìn)行檢測(cè)，如果呈陰性反應(yīng)，則報(bào)告HIV抗體陰性；如果呈陽(yáng)性反應(yīng)，則報(bào)告HIV-1抗體陽(yáng)性；如果不滿足陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，則判為HIV抗體檢測(cè)結(jié)果不確定。

如果出現(xiàn)HIV-2型的特異性指示條帶，需用HIV-2型免疫印跡試劑再做HIV-2的抗體確認(rèn)試驗(yàn)，呈陰性反應(yīng)，報(bào)告HIV-2抗體陰性；呈陽(yáng)性反應(yīng)則報(bào)告HIV-2抗體血清學(xué)陽(yáng)性,并將樣品送國(guó)家參比實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行核酸序列分析。確認(rèn)檢測(cè)流程

先用HIV-1/2混合型試60艾滋病實(shí)驗(yàn)室診斷確認(rèn)試驗(yàn)(蛋白印跡Western-Blot)原理

病毒裂解物抗原經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離,然后將分離后的抗原轉(zhuǎn)移(印跡)到硝酸纖維薄膜上,采用類(lèi)似ELISA的技術(shù),當(dāng)樣品中含有HIV抗體時(shí),它和印跡在硝酸纖維薄膜上的病毒抗原相結(jié)合呈現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的特異性帶型.?

HIV-1抗體特異帶包括：

env帶gp160/gp120、gp41；

gag帶p55、p24、p17（或p18）；pol帶p66（或p65）、p51、p31。?HIV-2抗體特異條帶包括：

env帶gp140/gp105、gp36；

gag帶p56、p26、p16；

pol帶p68、p53、p34。

（由于使用的毒株不同，HIV-2env帶也可為gp125/gp80、gp36）。艾滋病實(shí)驗(yàn)室診斷確認(rèn)試驗(yàn)(蛋白印跡Western-Blot)61WB原理WB原理62確認(rèn)試驗(yàn)結(jié)果的判定

下面是我國(guó)使用WB確認(rèn)HIV感染的判定標(biāo)準(zhǔn)和判定結(jié)果的基本原則。在實(shí)際工作中還應(yīng)參照所用試劑盒說(shuō)明書(shū)綜合判定，遇疑難情況應(yīng)報(bào)上級(jí)實(shí)驗(yàn)室解決。

&HIV-1抗體陽(yáng)性（+）

至少有2條env帶（gp41和gp160/gp120）出現(xiàn)，或至少1條env帶和p24帶同時(shí)出現(xiàn)。

&HIV-2抗體陽(yáng)性（+）

同時(shí)符合以下2條標(biāo)準(zhǔn)可判為HIV-2抗體血清學(xué)陽(yáng)性：

（1）符合WHO陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)，即出現(xiàn)至少2條env帶（gp36和gp140/gp105）。

（2）符合試劑盒提供的陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)。

&HIV抗體陰性（-）

無(wú)HIV抗體特異帶出現(xiàn)。

&HIV抗體不確定（±）

出現(xiàn)HIV抗體特異帶，但不足以判定陽(yáng)性。

確認(rèn)試驗(yàn)結(jié)果的判定

下面是我國(guó)使用WB確認(rèn)HIV感染的判63HIV抗體WB實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)1324GP160GP120P66

P55P51GP41P31P24P17血清對(duì)照P39HIV-2特異帶HIV抗體WB實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)GP160GP12064WB結(jié)果解釋W(xué)B結(jié)果解釋65HIV不確定結(jié)果的分析HIV抗體不確定結(jié)果的原因1.HIV早期感染，此時(shí)可能僅出現(xiàn)一條env帶或p24、p31、p55帶2.非特異反應(yīng)，如高丙球蛋白血癥、某些病毒性疾病和寄生蟲(chóng)感染、自身免疫性疾病等可引起該現(xiàn)象3.少數(shù)晚期艾滋病患者4.與HIV裂解物中的宿主細(xì)胞成分發(fā)生交叉反應(yīng)5.O亞型毒株解決辦法：隨訪HIV不確定結(jié)果的分析HIV抗體不確定結(jié)果的原因66窗口期定義

從HIV感染到HIV抗體被檢出的時(shí)間,一般為六周到十二周窗口期定義67

窗口期的決定因素

初篩試劑質(zhì)量和測(cè)試技術(shù)機(jī)體免疫反應(yīng)病毒特性-窗口期無(wú)法避免

窗口期的決定因素

初篩試劑質(zhì)量和測(cè)試技術(shù)68謝謝大家謝謝大家69HIV檢測(cè)技術(shù)HIV檢測(cè)技術(shù)70艾滋病實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)HIV抗體測(cè)定抗原測(cè)定核酸測(cè)定病毒分離CD4淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)艾滋病實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)HIV抗體測(cè)定71急性期潛伏期窗口期HIV感染以后的血清學(xué)動(dòng)態(tài)Anti-P24Anti-gp41/120(anti-gp36)HIVRNAAnti-Ag感染1周2周3周4周….1年2年3年…………….10年………..艾滋病期Anti-Ab濃度急性期潛伏期窗口期HIV感染以后的血清學(xué)動(dòng)態(tài)Anti-P2472

HIV抗體檢測(cè)的目的和要點(diǎn)HIV抗體檢測(cè)可用于診斷、血液篩查、監(jiān)測(cè)等。以診斷為目的的檢測(cè)是為了確定個(gè)體HIV感染狀況，包括臨床檢測(cè)、自愿咨詢檢測(cè)、根據(jù)特殊需要進(jìn)行的體檢等。HIV抗體檢測(cè)的目的和要點(diǎn)HIV抗體檢測(cè)可用于診斷、血73以血液篩查為目的的檢測(cè)是為了防止輸血傳播HIV，包括獻(xiàn)血員篩查和原料血漿篩查。以監(jiān)測(cè)為目的的檢測(cè)是為了解不同人群HIV感染率及其變化趨勢(shì)，包括各類(lèi)高危人群、重點(diǎn)人群和一般人群。以血液篩查為目的的檢測(cè)是為了防止輸血傳播HIV，包括獻(xiàn)血員篩74初篩實(shí)驗(yàn)室設(shè)備條件獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室用房，建筑設(shè)備和儀器要符合要求II級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室酶標(biāo)儀，洗板機(jī)，精確移夜管，專(zhuān)用冰箱，離心機(jī)，水浴箱，溫箱等消毒和污染處理設(shè)施安全防護(hù)設(shè)施初篩實(shí)驗(yàn)室設(shè)備條件獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室用房，建筑設(shè)備和儀器要符合要求I75艾滋病檢測(cè)方法的意義HIV抗體篩查檢測(cè)

HIV/AIDS的篩查，但初篩陽(yáng)性結(jié)果不能做為艾滋病診斷依據(jù)，需將該標(biāo)本送確證實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行確證。HIV抗體確認(rèn)檢測(cè)（免疫印跡試驗(yàn)）

HIV/AIDS診斷的唯一依據(jù)艾滋病確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)HIV核酸檢測(cè)輔助診斷：在特殊情況下，如出現(xiàn)某些非典型的抗體反應(yīng)，特別是不確定反應(yīng)時(shí)，RNA的測(cè)定可提供有用的證據(jù)。感染早期：在HIV感染的窗口期，無(wú)法使用抗體檢測(cè)進(jìn)行診斷，此時(shí)RNA的測(cè)定具有特殊的意義，提示是否有感染的可能，但仍需追蹤檢測(cè)HIV抗體，最終根據(jù)抗體的檢測(cè)情況做出診斷。病程監(jiān)控：幫助確定疾病發(fā)展的階段。指導(dǎo)治療方案及療效測(cè)定。預(yù)測(cè)疾病進(jìn)程。艾滋病檢測(cè)方法的意義HIV抗體篩查檢測(cè)76抗體檢測(cè)

根據(jù)檢測(cè)HIV感染后產(chǎn)生的HIV抗體的間接指標(biāo)而發(fā)展起來(lái)的血清學(xué)診斷技術(shù)，分為初篩試驗(yàn)和確認(rèn)試驗(yàn)。

初篩試驗(yàn)用于對(duì)檢測(cè)對(duì)象感染情況的初步篩查，檢測(cè)結(jié)果可能會(huì)有假陽(yáng)性，不能發(fā)抗體陽(yáng)性報(bào)告確認(rèn)試驗(yàn)確定檢測(cè)對(duì)象是否有HIV抗體，可發(fā)抗體陽(yáng)性報(bào)告

抗體檢測(cè)77酶聯(lián)免疫試驗(yàn)(ELISA)最早用于檢測(cè)血清中HIV抗體的有效篩檢方法很高的敏感性和特異性根據(jù)檢測(cè)方法，可分成4類(lèi)間接法、雙抗原夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法和捕獲法HIV抗體檢測(cè)試劑根據(jù)其抗原的來(lái)源和檢測(cè)方式可分為四代

酶聯(lián)免疫試驗(yàn)(ELISA)最早用于檢測(cè)血清中HIV抗體78篩查試驗(yàn)篩查試劑經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局注冊(cè)批準(zhǔn)在試劑有效期內(nèi)酶聯(lián)免疫試劑應(yīng)批批檢合格臨床質(zhì)量評(píng)估敏感性和特異性高篩查試驗(yàn)79第一代ELISA試劑包被抗原：全病毒裂解抗原窗口期：6-8星期優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，可檢出各種抗體缺點(diǎn)：制備麻煩，成本高，假陽(yáng)性1985年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)第一個(gè)HIV抗體篩選試劑第一代ELISA試劑包被抗原：全病毒裂解抗原80第二代ELISA試劑包被抗原：重組抗原、合成多肽窗口期：4-5星期優(yōu)點(diǎn)：重組抗原可消除HLA（人類(lèi)白細(xì)胞抗原）所致的抗體假陽(yáng)性，生產(chǎn)成本低，不使用HIV病毒顆粒，較為安全，敏感性特異性較高缺點(diǎn)：仍有一定的假陽(yáng)性1990年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)第一個(gè)重組抗原篩選試劑第二代ELISA試劑包被抗原：重組抗原、合成多肽81第三代ELISA試劑包被抗原：重組抗原加合成多肽合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一個(gè)抗原決定簇，純度高，特異性也高窗口期：3星期左右優(yōu)點(diǎn)：可檢測(cè)所有不同種類(lèi)的抗體，增加了試劑的敏感性和特異性1994年發(fā)展了雙抗原夾心法，酶標(biāo)物由抗人IgG改變?yōu)樘禺愋訦IV抗原第三代ELISA試劑包被抗原：重組抗原加合成多肽82第四代ELISA試劑包被物：重組或多肽抗原+重組抗體窗口期：2星期左右優(yōu)點(diǎn)：同時(shí)檢測(cè)HIV抗原抗體，縮短窗口期注意：抗原檢測(cè)敏感性低于單獨(dú)抗原試劑(50~70pg/ml,5~10pg/ml)1998年第四代試劑首次上市第四代ELISA試劑包被物：重組或多肽抗原+重組抗體83

HIV抗體試劑盒進(jìn)展代次 抗原 方法 檢測(cè)時(shí)間 1 全病毒 間接 >2個(gè)月 2 重組或多肽 間接 3-4周 3 重組+多肽 夾心 2-3周 4 抗原+抗體 夾心 2周左右

HIV抗體試劑盒進(jìn)展代次 抗原 方法 檢測(cè)時(shí)間84Closingthewindow<infectivity=>4thgen3rdgen=>

=>1st-2ndgenHIVantigenIgMabIgGabDetectionlimit<=window第一/二代試劑檢測(cè)IgG抗體，第三代試劑檢測(cè)IgG、IgM抗體,第四代試劑同時(shí)檢測(cè)IgG、IgM抗體和P24抗原使窗口期縮短。Closingthewindow<infectivit85篩查樣品HIV抗體篩查可采用血清、血漿、濾紙干血斑、唾液和尿液樣品。篩查樣品HIV抗體篩查可采用血清、血漿、濾紙干血斑、唾液和尿86唾液檢測(cè)試劑在硝酸纖維膜上包被人工合成的HIVgp41/gp36蛋白抗原，可以同時(shí)檢測(cè)HIV－1/HIV－2抗體，原理為酶免間接法。ELISA、免疫印跡法（WB）已經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)唾液檢測(cè)試劑在硝酸纖維膜上包被人工合成的HIVgp41/gp87優(yōu)點(diǎn):1.樣品穩(wěn)定,各種溫度下穩(wěn)定性大于三周2.敏感性和特異性與標(biāo)準(zhǔn)的血清學(xué)實(shí)驗(yàn)相當(dāng)缺點(diǎn):1.預(yù)處理復(fù)雜，重復(fù)性較差2.會(huì)出現(xiàn)不同于血清抗體的種類(lèi)和滴度優(yōu)點(diǎn):88

尿液檢測(cè)試劑

適用對(duì)象：靜脈吸毒人群，其他高危人群的大面積流調(diào)、監(jiān)測(cè)優(yōu)點(diǎn)：1.采集、處理費(fèi)用低，較血液標(biāo)本安全2.HIV抗體在尿中十分穩(wěn)定，尿液中IgG與血液相當(dāng)缺點(diǎn)：1.檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)2.精確性低于血、唾液，陽(yáng)性者需作血清學(xué)檢測(cè)尿液檢測(cè)試劑適用對(duì)象：靜脈吸毒人群，其他高危人群的89篩查方法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）化學(xué)發(fā)光或免疫熒光試驗(yàn)快速檢測(cè)（RT）

明膠顆粒凝集試驗(yàn)（PA）免疫滲濾試驗(yàn)：斑點(diǎn)ELISA和斑點(diǎn)免疫膠體金（或膠體硒）快速試驗(yàn)免疫層析試驗(yàn)篩查方法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）90酶聯(lián)

酶聯(lián)免疫吸附－－ELISA方法間接法夾心法－－雙抗原和雙抗體競(jìng)爭(zhēng)法捕獲法酶聯(lián)酶聯(lián)免疫吸附－－ELISA方法91間接ELISA方法

Ag+Ab+Ab-E酶標(biāo)記抗人IgG標(biāo)本中的HIV抗體底物酶產(chǎn)生顏色HIV抗原固體載體間接ELISA方法酶標(biāo)記抗人IgG標(biāo)本92雙抗原夾心法Ag+Ab+Ag-E標(biāo)本中HIV抗體HIV抗原酶標(biāo)的HIV抗原雙抗原夾心法標(biāo)本中HIV抗體HIV抗原酶93雙抗原夾心法

Ag+Ab+Ag-E用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋?zhuān)芍苯佑糜跍y(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高于間接法。HIV第三代試劑都是運(yùn)用此法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。雙抗原夾心法

Ag+Ab+Ag-94

竟?fàn)嶦LISA法

Ag+Ab+Ab-E病人血清底物無(wú)色或很微量反應(yīng)酶標(biāo)抗體HIV抗原產(chǎn)生顏色竟?fàn)嶦LISA法

Ag+Ab+Ab-E95

抗原捕獲法將抗HIV-McAb包被固相板中加入HIV特異性Ag

待檢血清標(biāo)本

酶標(biāo)－Ab/(E標(biāo)抗人－IgG)

底物顯色

抗原捕獲法96抗體捕獲法（特異抗體捕獲）

抗人－IgG包被固相載體

待檢血清標(biāo)本（總IgG）E標(biāo)記HIV－Ａｇ底物

特點(diǎn)：提高敏感性\特異性抗體捕獲法（特異抗體捕獲）97試劑的平衡在ELISA測(cè)定中試劑的準(zhǔn)備最為關(guān)鍵的是，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將試劑盒先從冰箱中取出，在室溫下放置20分鐘以上后，再進(jìn)行測(cè)定，以使試劑盒在使用前與室溫平衡。這樣做的目的，主要是為了在后面的溫育反應(yīng)步驟中，能使反應(yīng)微孔內(nèi)的溫度能較快地達(dá)到所要求的高度，以滿足測(cè)定要求。試劑的平衡在ELISA測(cè)定中試劑的準(zhǔn)備最為關(guān)鍵的是，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)98加樣及試劑加樣應(yīng)用微量移液器（加樣槍)按規(guī)定的量加入微孔板的下1/3處，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡，否則會(huì)導(dǎo)致加樣不均勻或污染，加樣保持勻速：太快，無(wú)法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區(qū)，易導(dǎo)致非特異吸附。濺出會(huì)對(duì)鄰近孔產(chǎn)生污染。。每次加樣應(yīng)更換吸頭，做到一人一吸頭，以免發(fā)生交叉污染;干吸頭預(yù)先在血清中抽吸三次。加樣及試劑加樣應(yīng)用微量移液器（加樣槍)按規(guī)定的量加入微孔板的99樣本稀釋?zhuān)康氖菫榱藴p少非特異性反應(yīng)，所以一定要先加稀釋液后加樣本，特別注意加樣后要在微量振蕩器上振蕩30秒鐘，同時(shí)注意防止液體溢出。如后面操作步驟中加二種以上試劑時(shí)均需振蕩混勻。如用滴瓶滴加試劑應(yīng)先將滴瓶搖勻并擠去第一滴有氣泡的試劑后加樣

樣本稀釋?zhuān)康氖菫榱藴p少非特異性反應(yīng)，所以一定要先加稀釋液后100溫度和時(shí)間溫育溫度：ELISA作為一種固相免疫測(cè)定，抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)在固相上進(jìn)行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原完全結(jié)合，必須在一定的溫度條件下反應(yīng)一定的時(shí)間。溫育所需時(shí)間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時(shí)間相對(duì)較短。最為常用的溫育溫度為37℃。溫育時(shí)間：孔內(nèi)溫度從室溫升至37℃，需要一定的時(shí)間，尤其是在室溫比較低以及非水浴的狀態(tài)下，這段升溫時(shí)間可能還比較長(zhǎng)。注意弱陽(yáng)性標(biāo)本。溫度和時(shí)間溫育溫度：ELISA作為一種固相免疫測(cè)定，抗原抗體101邊緣效應(yīng)的排除：即外周孔顯色較中心孔深。研究證實(shí)在溫育中的熱力學(xué)梯度可能是根本原因之所。所以溫育一般采用能使反應(yīng)液溫度迅速達(dá)到平衡的水浴法。一種是放在水浴箱的隔板上，使板條與水直接接觸，另一種是放在溫箱的濕盒里。水要浸至板條的1/3處，不可將板條疊加放置。排除邊緣效應(yīng)可以提高實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性。

邊緣效應(yīng)的排除：即外周孔顯色較中心孔深。研究證實(shí)在溫育中的熱102洗滌ELISA是靠洗滌來(lái)達(dá)到分離結(jié)合與未結(jié)合抗原抗體復(fù)合物及酶標(biāo)記物的目的，同時(shí)洗滌也可將非特異吸附的蛋白質(zhì)的干擾以及血球、細(xì)菌中的酶干擾清除掉。艾滋病檢測(cè)要求使用洗板機(jī)：減少操作者人為誤差、保護(hù)操作者、降低板孔殘液量。洗滌ELISA是靠洗滌來(lái)達(dá)到分離結(jié)合與未結(jié)合抗原抗體復(fù)合物及103以HRP作為標(biāo)記酶的ELISA試劑盒中使用的洗板液一般為含0.05%Tween20的中性PBS，Tween20為一種非離子去垢劑，既含親水基團(tuán)，也含疏水基團(tuán)，其作用機(jī)理是，借助其疏水基團(tuán)與經(jīng)疏水性相互作用被動(dòng)吸附于聚苯乙烯固相上蛋白的疏水基團(tuán)形成疏水鍵，從而削弱蛋白與固相的吸附，促使蛋白質(zhì)脫離固相而進(jìn)入液相，這樣就可達(dá)到去掉非特異吸附物的目的。以HRP作為標(biāo)記酶的ELISA試劑盒中使用的洗板液一般為含0104但由于抗體或抗原的包被通常也是通過(guò)在堿性條件下與固相的疏水性相互作用而被動(dòng)吸附于固相，因此要注意非離子去垢劑的使用濃度，洗板液中Tween20濃度高于0.2%，可使包被于固相上的抗原或抗體解吸附而影響試驗(yàn)的測(cè)定下限。

但由于抗體或抗原的包被通常也是通過(guò)在堿性條件下與固相的疏水性105顯色一般商品試劑盒顯色反應(yīng)條件為37℃。從理論上說(shuō)，37℃25~30分鐘才可以使HRP的底物催化反應(yīng)完全，盡管在最初的10分鐘內(nèi)，絕大部份催化反應(yīng)即可完成。但為使弱陽(yáng)性樣本孔能有充分的顯色，應(yīng)在37℃下反應(yīng)30分鐘后終止反應(yīng)。一般底物經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達(dá)頂峰，隨即逐漸減弱，至2小時(shí)后即可完全消退至無(wú)色。顯色一般商品試劑盒顯色反應(yīng)條件為37℃。從理論上說(shuō)，37℃2106此外，在加入底物前，最好是先檢查一下底物溶液的有效性，即可將A和B兩種液各加一滴于清潔的空板孔或eppendorf管中，觀察是否有顯色出現(xiàn)，如有，則說(shuō)明底物已變質(zhì)。此外，在加入底物前，最好是先檢查一下底物溶液的有效性，即可將107比色ELISA的比色測(cè)定由酶標(biāo)儀進(jìn)行

顯色反應(yīng)終止后應(yīng)在30分鐘內(nèi)完成比色雙波長(zhǎng)比色：校正波長(zhǎng)均用630nm。在敏感波長(zhǎng)（450nm）和非敏感波長(zhǎng)（630nm）下各測(cè)定一次。建議盡量使用雙波長(zhǎng)比色調(diào)零而不用空白對(duì)照調(diào)零.比色ELISA的比色測(cè)定由酶標(biāo)儀進(jìn)行108讀數(shù)使用雙波長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)可以消除反應(yīng)板條上的劃痕手印的干擾。同時(shí)要注意反應(yīng)板應(yīng)用吸水紙擦干后才能置酶標(biāo)儀中比色，否則吸光度易出現(xiàn)負(fù)值或損壞濾光片。讀數(shù)使用雙波長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)可以消除反應(yīng)板條上的劃痕手印的干擾。同時(shí)109酶聯(lián)實(shí)驗(yàn)的影響因素標(biāo)本的采集和保存一般使用血清（漿）。標(biāo)本采集時(shí)應(yīng)盡量避免溶血，因紅細(xì)胞破裂可釋放過(guò)氧化物酶活性物質(zhì)干擾結(jié)果，可造成假陽(yáng)性；長(zhǎng)菌的標(biāo)本會(huì)因細(xì)菌分泌一些酶，干擾酶聯(lián)反應(yīng)；抗凝不完全的標(biāo)本因纖維蛋白元的干擾而造成假陽(yáng)性，建議盡量不用抗凝血尤其是用肝素抗凝劑。酶聯(lián)實(shí)驗(yàn)的影響因素標(biāo)本的采集和保存110標(biāo)本在冰箱中保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易導(dǎo)致血清IgG聚合，使間接法的試劑本底加深，一般血清置4℃冰箱5天內(nèi)完成測(cè)試。如需保存一周以上則要-20℃冰凍保存融解時(shí)應(yīng)上下顛倒充分混勻，同時(shí)避免氣泡盡量避免反復(fù)凍融，反復(fù)凍融過(guò)程中產(chǎn)生的機(jī)械剪切力將對(duì)樣本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用標(biāo)本在冰箱中保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易導(dǎo)致血清IgG聚合，使間接法的試劑111ELISA的靈敏度>1ng/ml水平上,因此要盡量避免標(biāo)本間的污染。標(biāo)本在保存中如出現(xiàn)細(xì)菌污染所致的混濁或絮狀物時(shí)，應(yīng)離心沉淀后取上清檢測(cè)。

ELISA的靈敏度>1ng/ml水平上,因此要盡量避免標(biāo)本間112ELISA試驗(yàn)中可能出現(xiàn)的問(wèn)題及原因分析問(wèn)題可能的原因（非試劑盒本身的原因）弱陽(yáng)性質(zhì)控樣本檢測(cè)不出溫育的時(shí)間或溫度不夠；顯色反應(yīng)時(shí)間太短；測(cè)定的重復(fù)性差（相同樣本兩次測(cè)定結(jié)果不一致）（1）加樣本及試劑量不準(zhǔn)；孔間不一致；（2）加樣過(guò)快，孔間發(fā)生污染；（3）加錯(cuò)樣本；（4）加樣本及試劑時(shí)，加在孔壁上部非包被區(qū)；（5）不同批號(hào)試劑盒中組分混用；（6）溫育時(shí)間、洗板、顯色時(shí)間不一致；（7）孔內(nèi)污染雜物；（8）酶標(biāo)儀濾光片不正確；（9）血清標(biāo)本未完全凝固即加入，反應(yīng)孔內(nèi)出現(xiàn)纖維蛋白凝固或殘留血細(xì)胞，易出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)等。ELISA試驗(yàn)中可能出現(xiàn)的問(wèn)題及原因分析問(wèn)題可能的原因（非試113問(wèn)題可能的原因（非試劑盒本身的原因）白板（陽(yáng)性對(duì)照不顯色）（1）漏加酶結(jié)合物；（2）洗板液配制中出現(xiàn)問(wèn)題，如量筒不干凈，含酶抑制物（如疊氮鈉）等。（3）漏加顯色劑A或B；（4）終止劑當(dāng)顯色劑使用。全部板孔均有顯色（1）洗板不干凈；（2）顯色液變質(zhì)；（3）加底物的吸尖受酶或金屬離子污染；（4）洗板液受酶等污染。（5）由于儀器或加樣頭造成的交叉污染。

問(wèn)題可能的原因（非試劑盒本身的原因）白板（陽(yáng)性對(duì)照不顯色）114化學(xué)發(fā)光或免疫熒光試驗(yàn)這類(lèi)試劑采用發(fā)光或熒光底物，既可檢測(cè)抗體，也可聯(lián)合檢測(cè)抗原抗體。原理：HIV抗原或抗體包被于固相載體，加入待檢樣品和酶或熒光標(biāo)記的HIV抗原或抗體，加發(fā)光或熒光底物，用發(fā)光或熒光儀測(cè)定結(jié)果。有效試驗(yàn)的陰性和陽(yáng)性對(duì)照必須符合試劑盒規(guī)定。化學(xué)發(fā)光或免疫熒光試驗(yàn)這類(lèi)試劑采用發(fā)光或熒光底物，既可檢測(cè)抗115快速檢測(cè)（RT）及其它檢測(cè)試驗(yàn)這類(lèi)試驗(yàn)簡(jiǎn)便快速，適用于應(yīng)急檢測(cè)、門(mén)診急診檢測(cè)。一般可在10～30分鐘內(nèi)得出結(jié)果。快速檢測(cè)（RT）及其它檢測(cè)試驗(yàn)這類(lèi)試驗(yàn)簡(jiǎn)便快速，適用于應(yīng)急檢116①明膠顆粒凝集試驗(yàn)（PA）：原理：將HIV抗原致敏明膠顆粒作為載體，與待檢樣品作用。當(dāng)待檢樣品含有HIV抗體時(shí)，明膠顆粒與抗體發(fā)生凝集反應(yīng)，根據(jù)凝集情況判讀結(jié)果。PA試劑有兩種:同時(shí)檢測(cè)HIV-1和HIV-2抗體以及分別檢測(cè)HIV-1和HIV-2抗體。有效試驗(yàn)必須有陰性和陽(yáng)性質(zhì)控。①明膠顆粒凝集試驗(yàn)（PA）：117凝集實(shí)驗(yàn)常用的載體：紅細(xì)胞、聚苯乙烯乳膠顆粒、明膠顆粒、活性碳或硅膠鋁顆粒凝集實(shí)驗(yàn)常用的載體：紅細(xì)胞、聚苯乙烯乳膠顆粒、明膠顆粒、活性118前滯現(xiàn)象：反應(yīng)中抗體含量過(guò)多，影響抗原抗體的理想結(jié)合，大量抗體結(jié)合于抗原阻礙了交叉聯(lián)結(jié)符合體的形成，使肉眼觀察不到凝集現(xiàn)象，造成假陰性。解決辦法：稀釋樣品前滯現(xiàn)象：119凝集試驗(yàn)注意事項(xiàng)試驗(yàn)應(yīng)設(shè)對(duì)照，特別是未包被抗原的載體對(duì)照，以防止非特異載體凝集反應(yīng)的干擾乳膠試劑對(duì)于凍融過(guò)的血清假陽(yáng)性率高，對(duì)于新鮮血清沒(méi)有這種現(xiàn)象。乳膠試劑切忌凍結(jié)，凍結(jié)后易發(fā)生自凝結(jié)果判讀要及時(shí)，避免假陽(yáng)性凝集試驗(yàn)注意事項(xiàng)試驗(yàn)應(yīng)設(shè)對(duì)照，特別是未包被抗原的載體對(duì)照，以120HIV抗體檢測(cè)（明膠顆粒凝集試驗(yàn)）材料

血清標(biāo)本,U型板,PA試劑盒(“A”溶解用液,”B”血清稀釋液,”C”致敏顆粒,”D”非致敏顆粒,陽(yáng)性對(duì)照血清,專(zhuān)用滴管.方法

(1)從4℃冰箱取出試劑盒,恢復(fù)至室溫后使用.(2)從1:4開(kāi)始做倍比稀釋.(3)用專(zhuān)用滴管,第二孔加1滴(25ul)非致敏顆?！盌”,第三孔加1滴(25ul)致敏顆?！盋”.(4)輕輕拍打微量板或在振蕩器上振蕩1分鐘混合后,室溫(20℃)靜置2小時(shí)后觀察結(jié)果.HIV抗體檢測(cè)（明膠顆粒凝集試驗(yàn)）材料121HIV抗體檢測(cè)（明膠顆粒凝集試驗(yàn)）結(jié)果判斷明膠顆粒沉積在孔底,周邊平滑,或形成致密圓圈者為陰性結(jié)果.(-)明膠顆粒沉積在孔底,中央形成致密小環(huán),周邊平滑為可疑反應(yīng).(+_)孔內(nèi)有清晰的寬環(huán)且外緣粗糙者,為陽(yáng)性結(jié)果.(+/++)孔內(nèi)凝聚顆粒形成均一的膜覆蓋在整個(gè)孔底者為強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng).(+++/++++)孔內(nèi)樣品與致敏和非致敏顆粒均產(chǎn)生凝集者,則需作重吸收試驗(yàn)后進(jìn)一步檢測(cè).HIV抗體檢測(cè)（明膠顆粒凝集試驗(yàn)）結(jié)果判斷122②免疫滲濾試驗(yàn)：斑點(diǎn)ELISA和斑點(diǎn)免疫膠體金（或膠體硒）快速試驗(yàn)原理：均以硝酸纖維膜為載體，HIV抗原點(diǎn)狀固定在膜上，加待檢樣品。陽(yáng)性結(jié)果在膜上抗原部位顯示出有色斑點(diǎn)。反應(yīng)時(shí)間在10分鐘以內(nèi)。有效試驗(yàn)的質(zhì)控點(diǎn)必須顯色。②免疫滲濾試驗(yàn)：斑點(diǎn)ELISA和斑點(diǎn)免疫膠體金（或膠體硒）123③免疫層析試驗(yàn)原理：以硝酸纖維膜為載體，HIV抗原線狀固定在膜上，待檢樣品（血液或唾液）沿著固相載體遷移，陽(yáng)性結(jié)果在膜上抗原部位顯示出有色條帶。有效試驗(yàn)的質(zhì)控帶必須顯色。③免疫層析試驗(yàn)124ELISA試劑（13種）麗珠、生物梅里埃、萬(wàn)泰、MUREX、綠科、永華、金豪、科華、新創(chuàng)、普生、中山、華美、吉比愛(ài)快速試劑（7種）科華、新創(chuàng)、PA、雅培、EY、艾康、萬(wàn)泰ELISA試劑（13種）125抗體初篩試驗(yàn)的局限性陽(yáng)性結(jié)果不能確認(rèn)，需用其他試劑復(fù)查陰性結(jié)果不能排除H