第五章微生物的生長(zhǎng)繁殖與生存因子第五章微生物的生長(zhǎng)繁殖與生存因子1第一節(jié)微生物的生長(zhǎng)繁殖一、微生物生長(zhǎng)繁殖的概念二、研究微生物生長(zhǎng)的方法三、細(xì)菌生長(zhǎng)曲線在污（廢）水微生物處理中的應(yīng)用四、微生物生長(zhǎng)量的測(cè)定方法第一節(jié)微生物的生長(zhǎng)繁殖一、微生物生長(zhǎng)繁殖的概念2一、微生物的生長(zhǎng)繁殖的概念

微生物生長(zhǎng)是細(xì)胞物質(zhì)有規(guī)律地、不可逆增加，導(dǎo)致細(xì)胞體積擴(kuò)大的生物學(xué)過程，這是個(gè)體生長(zhǎng)的定義。繁殖是微生物生長(zhǎng)到一定階段，由于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)制與重建并通過特定方式產(chǎn)生新的生命個(gè)體，即引起生命個(gè)體數(shù)量增加的生物學(xué)過程。細(xì)菌兩次分裂之間的時(shí)間，稱為代時(shí)（世代時(shí)間）。一、微生物的生長(zhǎng)繁殖的概念微生物生長(zhǎng)是細(xì)胞物質(zhì)有規(guī)律地、不3二、研究微生物生長(zhǎng)的方法

（一）分批培養(yǎng)：將一定量的微生物接種在一個(gè)封閉的、盛有一定量液體培養(yǎng)基的容器內(nèi)，保持一定的溫度、和溶解氧量，使微生物在其中生長(zhǎng)繁殖。以細(xì)菌純種培養(yǎng)為例,將少量細(xì)菌接種到新鮮、定量的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行分批培養(yǎng)，定時(shí)取樣記數(shù)。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以細(xì)菌數(shù)目為縱坐標(biāo)，連接各取樣點(diǎn)坐標(biāo)，會(huì)出現(xiàn)微生物數(shù)量由少到多，達(dá)到高峰后又由多到少的變化曲線。即細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線。(growthcuwe)。二、研究微生物生長(zhǎng)的方法4（1）活細(xì)菌重量變化曲線曲線：群體重量W(mg/l)——時(shí)間t

細(xì)菌內(nèi)源呼吸增長(zhǎng)率上升階段

及細(xì)菌大量死亡階段

mg/L

活細(xì)菌重量t0時(shí)間曲線t`點(diǎn)切線斜率值=?

t`重量增長(zhǎng)速率t`

增長(zhǎng)率下降階段生長(zhǎng)情況用活細(xì)菌生長(zhǎng)曲線來描述（1）活細(xì)菌重量變化曲線曲線：群體重量W(mg/l)——時(shí)間5①增長(zhǎng)速率上升階段提問：為什么培養(yǎng)初期細(xì)菌群體重量增長(zhǎng)速率隨時(shí)間不斷增大？A.營養(yǎng)物豐富，細(xì)菌增殖；B.細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)以糖原、油滴等形式儲(chǔ)存營養(yǎng)物，細(xì)菌個(gè)體重量增大

增長(zhǎng)率

生上升階段

mg/mL

0時(shí)間t活細(xì)胞重量①增長(zhǎng)速率上升階段提問：為什么培養(yǎng)初期細(xì)菌群體重量增長(zhǎng)速率隨6②增長(zhǎng)速率下降階段提問：為什么增長(zhǎng)速率較前下降了？

增長(zhǎng)率下

降階段

mg/mL

0時(shí)間t活細(xì)胞重量營養(yǎng)物濃度（好氧細(xì)菌還包括氧氣）下降

這些限制性因素還不是十分嚴(yán)重，細(xì)菌的代謝速度變慢，沒有停止代謝產(chǎn)物積累對(duì)細(xì)菌的某些酶產(chǎn)生抑制②增長(zhǎng)速率下降階段提問：為什么增長(zhǎng)速率較前下降了？7③內(nèi)源呼吸及死亡階段———內(nèi)源呼吸+毒物濃度更高（個(gè)體）瘦→死（群體）死亡率大于出生率從曲線上反映為活細(xì)菌重量的進(jìn)一步持續(xù)下降。提問：此時(shí)細(xì)菌的出生率是否為零呢？為什么？不是，利用死亡細(xì)菌的殘?bào)w營養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室通常采用細(xì)菌的數(shù)量變化繪制生長(zhǎng)曲線，雖然兩種曲線在本質(zhì)上是相同的，但數(shù)量曲線也有它自身的特點(diǎn)和用途。③內(nèi)源呼吸及死亡階段———內(nèi)源呼吸+毒物濃度更高實(shí)驗(yàn)82．細(xì)菌數(shù)量生長(zhǎng)曲線

生

長(zhǎng)

速

率

靜止期

衰亡期

細(xì)菌數(shù)目的對(duì)數(shù)值

0時(shí)間t細(xì)菌的數(shù)量很大，都是10的n次方，取對(duì)數(shù)作圖時(shí)方便，0~10代表1～1010總菌數(shù)活菌數(shù)

停

滯

期對(duì)數(shù)期0+_2．細(xì)菌數(shù)量生長(zhǎng)曲線生9（1）停滯期特征：

細(xì)

菌

停

數(shù)

滯

目

期

的

對(duì)

數(shù)

值

0時(shí)間t提問：為什么會(huì)出現(xiàn)遲緩期呢？

代謝活躍，個(gè)體體積、重量增高

不立即進(jìn)行細(xì)胞分裂、增殖，數(shù)量不變甚至減少適應(yīng)環(huán)境（合成相應(yīng)的酶），營養(yǎng)儲(chǔ)備（用于復(fù)制合成）（1）停滯期特征：細(xì)10影響停滯期的因素：接種量接種群體菌齡營養(yǎng)影響停滯期的因素：11提問：根據(jù)上述原因選擇接種何種狀態(tài)的細(xì)菌遲緩期會(huì)較長(zhǎng)？對(duì)數(shù)期的細(xì)菌、靜止期或衰亡期、受損細(xì)胞、富集培養(yǎng)基的細(xì)菌后三種靜止期細(xì)胞基本耗盡了各種輔酶或其他細(xì)胞成分受損細(xì)胞養(yǎng)傷修復(fù)富集培養(yǎng)基細(xì)菌需要合成“自力更生”酶提問：根據(jù)上述原因選擇接種何種狀態(tài)的細(xì)菌遲緩期會(huì)較長(zhǎng)？靜止期12在實(shí)際工作中如接種菌種以啟動(dòng)新的水處理設(shè)施，投加新鮮污泥時(shí)，接種的細(xì)菌不習(xí)慣于新環(huán)境，會(huì)出現(xiàn)或長(zhǎng)或短的遲緩期，遲緩期的出現(xiàn)會(huì)增加操作時(shí)間，降低工作效率采用處于高效菌群對(duì)數(shù)期的菌種、增大接種量、盡量保持接種前后所處的培養(yǎng)介質(zhì)和條件一致等方法來縮短或消除遲緩期提問：我們可以通過哪些手段縮短遲緩期呢？在實(shí)際工作中如接種菌種以啟動(dòng)新的水處理設(shè)施，投加新鮮污泥時(shí)，13（2）對(duì)數(shù)期所有細(xì)菌均繁殖故稱對(duì)數(shù)期。（相當(dāng)于重量法細(xì)菌曲線的增長(zhǎng)率上升階段）細(xì)菌數(shù)目X增長(zhǎng)率倍率的對(duì)數(shù)與時(shí)間成正比。（2）對(duì)數(shù)期所有細(xì)菌均繁殖故稱對(duì)數(shù)期。（相當(dāng)于重量法細(xì)14特點(diǎn)平均代時(shí)（繁殖一代的時(shí)間）最短提問：細(xì)菌的代時(shí)與哪些因素有關(guān)？

細(xì)

菌

數(shù)

目

的

對(duì)

對(duì)

數(shù)

數(shù)

期

值

0時(shí)間t如大腸桿菌在20℃時(shí)其代時(shí)是35℃條件下的2倍；傷寒桿菌在含0.125％的蛋白胨培養(yǎng)基中的代時(shí)為800min，而在含1.0％時(shí)僅為40min。繁殖速度最快種類遺傳、個(gè)體健康情況(營養(yǎng)、環(huán)境條件)特點(diǎn)平均代時(shí)（繁殖一代的時(shí)間）最短15此時(shí)所有細(xì)菌在二分裂生長(zhǎng),分別測(cè)定t0時(shí)刻與t時(shí)間細(xì)菌的數(shù)量X0與X對(duì)數(shù)期細(xì)菌代時(shí)G計(jì)算1→2→22→23((22)×2)→24→25……2nt0tX=X0*2nX/X0=2nX0→……X0·24→……X(X0·2n)(n=1、2、3…)

n—繁殖代數(shù)

代時(shí)此時(shí)所有細(xì)菌在二分裂生長(zhǎng),分別測(cè)定t0時(shí)刻與t時(shí)間細(xì)菌的數(shù)量16（3）靜止期出生率＝死亡率

細(xì)

菌

緩

數(shù)

慢

目

期

的

對(duì)

靜止期

對(duì)

數(shù)

衰老期

數(shù)

期

值

0t時(shí)間死亡原因—營養(yǎng)短缺、代謝毒物增多（相當(dāng)于重量變化曲線中的增長(zhǎng)率下降階段）（3）靜止期出生率＝死亡率細(xì)17（4）衰亡期死亡率＞出生率（相當(dāng)于重量法的內(nèi)源呼吸階段）由于營養(yǎng)物被耗盡，細(xì)菌因缺乏營養(yǎng)而利用貯存物質(zhì)進(jìn)行內(nèi)源代謝，即自身溶解。細(xì)菌在代謝過程中產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，會(huì)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖。死亡率增加，活菌數(shù)減少，甚至死菌數(shù)大于新生菌數(shù)。（4）衰亡期死亡率＞出生率（相當(dāng)于重量法的內(nèi)源呼吸階18活性污泥法中的序批式反應(yīng)器（SBR）法是將分批培養(yǎng)的原理應(yīng)用于污水生物處理的實(shí)例?；钚晕勰喾ㄖ械男蚺椒磻?yīng)器（SBR）法是將分批培養(yǎng)的原理應(yīng)用19是在微生物的整個(gè)培養(yǎng)期間，通過一定的方式使微生物能以恒定的比生長(zhǎng)速率生長(zhǎng)并能持續(xù)生長(zhǎng)下去的一種培養(yǎng)方法。（二）連續(xù)培養(yǎng)(continouscultureofmicroorganisms)是在微生物的整個(gè)培養(yǎng)期間，通過一定的方式使微生物能以恒定的比20（1）恒濁連續(xù)培養(yǎng)

恒濁——培養(yǎng)基濁度恒定（實(shí)質(zhì)是細(xì)菌數(shù)量恒定）新鮮培養(yǎng)基光電池光源流速控制閥出水很少應(yīng)用反饋控制（1）恒濁連續(xù)培養(yǎng)恒濁——培養(yǎng)基濁度恒定（實(shí)質(zhì)是細(xì)菌數(shù)21（2）恒化連續(xù)培養(yǎng)

化——？新鮮培養(yǎng)基流速控制閥出水應(yīng)用：環(huán)境工程、生物工程、實(shí)驗(yàn)室研究（細(xì)菌生理特性研究、細(xì)菌的快速篩選等）。

流速恒定進(jìn)料營養(yǎng)物總量（2）恒化連續(xù)培養(yǎng)化——？新鮮培養(yǎng)基流速控制閥出水流速22目前,污水連續(xù)生物處理法均類似于恒化連續(xù)培養(yǎng)；（流速不完全恒定）目前,污水連續(xù)生物處理法均類似于恒化連續(xù)培養(yǎng)；（流速不完全234．污(廢)水連續(xù)處理中的細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)不同的生物反應(yīng)器，

細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)可能不同！乃至同一反應(yīng)器內(nèi)不同位置處4．污(廢)水連續(xù)處理中的細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)不同的生物反應(yīng)器，24連續(xù)生物處理中的細(xì)菌狀態(tài)表

細(xì)菌的生長(zhǎng)階段應(yīng)用舉例特點(diǎn)停滯期無連續(xù)化穩(wěn)定操作中沒有這一階段對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期高負(fù)荷活性污泥法(大部分區(qū)域)靜止期生物膜法常規(guī)活性污泥法(大部分區(qū)域)生長(zhǎng)繁殖快，代謝活力強(qiáng)，能大量去除廢水中有機(jī)物。（缺點(diǎn)是細(xì)菌表面的粘液層和莢膜尚未形成，運(yùn)動(dòng)很活躍，不易自行凝聚成菌膠團(tuán)，沉淀性能差，致使出水水質(zhì)有機(jī)物濃度相對(duì)較高）衰老期低濃度污水延時(shí)曝氣法污泥的厭氧消化營養(yǎng)物濃度過低，難以滿足其他階段細(xì)菌的生長(zhǎng)需要雖然比對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的差，但仍有相當(dāng)?shù)拇x活力，細(xì)菌體內(nèi)積累了大量貯存物，如異染粒、聚β—羥基丁酸等，體表的粘液層和莢膜強(qiáng)化了細(xì)菌的生物吸附能力，自我絮凝、聚合能力強(qiáng)，在二沉池中泥水分離效果好，出水水質(zhì)好。1:0.4~0.8BOD.d-細(xì)菌與降解BOD重量比1:0.4以下連續(xù)生物處理中的細(xì)菌狀態(tài)表細(xì)菌的生長(zhǎng)階段應(yīng)用舉例特點(diǎn)停滯期25進(jìn)水對(duì)數(shù)期穩(wěn)定期衰老期平推流式活性污泥法占優(yōu)勢(shì)進(jìn)水對(duì)數(shù)期穩(wěn)定期衰老期平推流式活性污泥法占優(yōu)勢(shì)26四、微生物生長(zhǎng)（數(shù)量）測(cè)定方法（1）直接計(jì)數(shù)法（測(cè)定微生物總數(shù)）借助顯微鏡觀察測(cè)定優(yōu)點(diǎn)：快速提問:有哪些缺點(diǎn)?缺點(diǎn)：不能區(qū)分細(xì)菌的死活分四種四、微生物生長(zhǎng)（數(shù)量）測(cè)定方法（1）直接計(jì)數(shù)法（測(cè)定微生物271.涂片染色法1.涂片染色法282.計(jì)數(shù)器(血球計(jì)數(shù)板）測(cè)定法0.052cm2×250.1ml菌液2.計(jì)數(shù)器(血球計(jì)數(shù)板）測(cè)定法0.052cm2×250.1m29提問：數(shù)了125個(gè)小格中有90個(gè)細(xì)菌，樣品中的細(xì)菌濃度是多少？(90個(gè)÷125)*400/0.1ml=2880個(gè)/ml適用范圍：測(cè)定個(gè)體較大的細(xì)菌或原生動(dòng)物細(xì)菌個(gè)體若太小、過多，由于每一小格中細(xì)菌層層疊加，相互遮擋，難以準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。數(shù)數(shù)細(xì)菌（或其他微生物或細(xì)胞）數(shù)目，（一般數(shù)125個(gè)小格），折算樣品細(xì)菌濃度；提問：數(shù)了125個(gè)小格中有90個(gè)細(xì)菌，樣品中的細(xì)菌濃度是多少303.比例計(jì)數(shù)法比例——樣品菌液與等體積的血液混合，觀測(cè)二者比例提問：如果平均每個(gè)視野中細(xì)菌數(shù)量/紅血球的數(shù)量比例為5.5：1，則細(xì)菌數(shù)量=？5.5×400萬個(gè)/ml=2.2×107個(gè)/mL樣品紅血球數(shù)已知(男性400~500萬個(gè)／ml，女性350~450萬個(gè)／ml)，平均400萬個(gè)/ml細(xì)菌紅血球3.比例計(jì)數(shù)法比例——樣品菌液與等體積的血液混合，觀測(cè)二者比314．比濁計(jì)數(shù)法濁——細(xì)菌懸浮液的濁度提問：如何定量二者關(guān)系呢？細(xì)菌不完全透光，一定范圍內(nèi)菌溶液的混濁度與菌數(shù)量成正比4．比濁計(jì)數(shù)法濁——細(xì)菌懸浮液的濁度提問：如何定324．比濁計(jì)數(shù)法濁——細(xì)菌懸浮液的濁度細(xì)菌不完全透光，一定范圍內(nèi)菌溶液的混濁度與菌數(shù)量成正比4．比濁計(jì)數(shù)法濁——細(xì)菌懸浮液的濁度細(xì)菌不完全透33

（1）制標(biāo)準(zhǔn)曲線（OD~No）（2）測(cè)菌液濁度，查圖表得出細(xì)菌數(shù)量濁度儀或721分光光度儀（1）制標(biāo)準(zhǔn)曲線（OD~No）（2）測(cè)菌液濁度，查圖表得34（二）間接計(jì)數(shù)法(活菌計(jì)數(shù)法)提問：前述方法中計(jì)數(shù)的不都是活菌，如何分辨菌死活？繁殖提問：細(xì)菌繁殖的可見現(xiàn)象是什么？產(chǎn)生菌落（固體培養(yǎng)基培養(yǎng)）、菌液混濁（液體培養(yǎng)基培養(yǎng)）計(jì)數(shù)原理：一個(gè)細(xì)菌可繁殖成一個(gè)菌落或一群細(xì)菌.缺點(diǎn)：慢

分固體培養(yǎng)法和液體培養(yǎng)法（二）間接計(jì)數(shù)法(活菌計(jì)數(shù)法)提問：前述方法中計(jì)數(shù)的不都35無菌水1.

稀釋平板計(jì)數(shù)法—固體培養(yǎng)法第一步：菌樣巧妙稀釋得到不同稀釋度（10-x）菌液菌樣被無菌水不同稀釋倍率后平板培養(yǎng)圖無菌水1.稀釋平板計(jì)數(shù)法—固體培養(yǎng)法第一步：菌樣巧妙稀釋得36

10-210-3

10-410-5

各取1ml，均勻涂布于冷固體培養(yǎng)基平板上或與溫?zé)嵋簯B(tài)固體培養(yǎng)基混合冷卻。第三步：培養(yǎng)稀釋度過低，菌落密集無法計(jì)數(shù)可以計(jì)數(shù)，但數(shù)量過多，費(fèi)時(shí)費(fèi)力數(shù)量合適，統(tǒng)計(jì)計(jì)算，作為結(jié)果數(shù)量太少，誤差因素太大，不做計(jì)數(shù)第二步：接種平板每一個(gè)細(xì)菌會(huì)生成一個(gè)菌落10-210-31037一般計(jì)數(shù)平板的細(xì)菌生長(zhǎng)菌落數(shù)以30~300個(gè)為宜。第四步：計(jì)數(shù)細(xì)菌數(shù)量=？細(xì)菌數(shù)量=數(shù)出的菌落數(shù)/稀釋度例如：10-5稀釋度時(shí)菌落數(shù)為125個(gè)細(xì)菌數(shù)量=125/10-5=1.25×107個(gè)/mL

平板計(jì)數(shù)法是采用最廣的一種活菌計(jì)數(shù)法如國標(biāo)法水中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定。注意：作空白及取平行樣（2～3組）均值減小誤差平均一般計(jì)數(shù)平板的細(xì)菌生長(zhǎng)菌落數(shù)以30~300個(gè)為宜。第四步：382.稀釋液體計(jì)數(shù)法特點(diǎn)：液體培養(yǎng)、統(tǒng)計(jì)學(xué)查表計(jì)數(shù)又稱MPN法（或最可能數(shù)法）MostProbableNumber例如測(cè)定SRB（硫酸鹽還原菌，厭氧）的數(shù)量提問：能用稀釋平板法計(jì)數(shù)嗎？為什么？一般不能，厭氧菌暴露在空氣中不能生長(zhǎng)（除非厭氧培養(yǎng)箱）對(duì)這類菌可以利用它們生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生的硫化亞鐵黑色特征進(jìn)行深層隔氧液體培養(yǎng)，按MPN法進(jìn)行計(jì)數(shù)。2.稀釋液體計(jì)數(shù)法特點(diǎn)：液體培養(yǎng)、統(tǒng)計(jì)學(xué)查表計(jì)數(shù)對(duì)這類39

332010-4

10-5

10-63

10-

10-210-3

10-410-5（1）稀釋（2）稀釋接種樣品在液體表面加一層無菌液體石蠟隔絕氧氣，恒溫37℃培養(yǎng)14天記錄變黑的試管情況（3）培養(yǎng)1ml+9ml培養(yǎng)基提問：為什么有些試管變黑有些沒有？稀釋程度、取樣概率

40(4)統(tǒng)計(jì)－查表－計(jì)算

根據(jù)不同稀釋度變黑試管①統(tǒng)計(jì)出數(shù)量指標(biāo)三位數(shù)及其中最低稀釋度（取變黑的管數(shù)最多、稀釋度又最低的生長(zhǎng)管數(shù)，為第一位數(shù)字，后面兩個(gè)稀釋度的生長(zhǎng)管數(shù)后兩位數(shù)）提問：上例情況而言統(tǒng)計(jì)數(shù)量是幾？②查表表——MPN表32010-4(4)統(tǒng)計(jì)－查表－計(jì)算根據(jù)不同稀釋度變黑試管②查表32041MPN三管法測(cè)數(shù)統(tǒng)計(jì)表水中大腸菌群、鐵細(xì)菌、硝化菌、亞硝化菌也用這種方法進(jìn)行數(shù)量統(tǒng)計(jì)。個(gè)菌/毫升細(xì)菌最可能數(shù)——通過其他精確的計(jì)數(shù)法，確定的各種數(shù)量指標(biāo)時(shí)細(xì)菌數(shù)量的最可能值上面例子中數(shù)量指標(biāo)“320”對(duì)應(yīng)的細(xì)菌最可能數(shù)為9.5個(gè)菌/毫升，最低稀釋度為10-4，折算出樣品中菌濃度為

？個(gè)菌/毫升。MPN三管法測(cè)數(shù)統(tǒng)計(jì)表水中大腸菌群、鐵細(xì)菌、硝化菌、亞硝化菌423.薄膜計(jì)數(shù)法薄膜——微孔濾膜（φ0.45um）（2）濾膜培養(yǎng)膜有菌面沖上原理——膜抽濾（細(xì)菌濃縮）+膜平板培養(yǎng)

+

計(jì)數(shù)（1）抽濾（濾器及膜事先滅菌）3.薄膜計(jì)數(shù)法薄膜——微孔濾膜（φ0.45um）（2）濾膜43（3）統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)提問：假如測(cè)出250個(gè)菌落，抽濾了50ml自來水，自來水中菌濃度是多少呢？

250÷50ml=5個(gè)/ml自來水樣品中的細(xì)菌數(shù)量=菌落數(shù)÷抽濾樣品的體積數(shù)要求——樣品潔凈如空氣或飲用水。？堵孔、菌太多難以分散提問：如何用活菌計(jì)數(shù)法測(cè)定較臟的水樣？減少濾液體積、無菌水稀釋（3）統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)要求——樣品潔凈提問：如何用活菌計(jì)數(shù)法測(cè)定較臟44(三)重量法（計(jì)算生長(zhǎng)量）提問：已知什么條件通過測(cè)定細(xì)菌群體重量知道其數(shù)量？已知單個(gè)細(xì)菌的平均重量除法計(jì)算細(xì)菌的濕重量＝10-15~10-11g/個(gè)細(xì)胞干重約為濕重的10％~20％。1.干重法方法：含菌水樣在105～110℃下進(jìn)行干燥恒重（本質(zhì)測(cè)水中懸浮物重量MLSS或MLVSS）。(三)重量法（計(jì)算生長(zhǎng)量）提問：已知什么條件通過測(cè)定細(xì)菌群體45懸浮物＝無機(jī)物+有機(jī)物（包括細(xì)菌）提問：如何確定懸浮物中有機(jī)物與無機(jī)物的量？高溫(550℃)灼燒

無機(jī)物化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，高溫下不會(huì)分解提問：什么情況下可以直接用懸浮物的重量表示細(xì)菌的重量？懸浮物中絕大多數(shù)是細(xì)菌。懸浮物＝無機(jī)物+有機(jī)物（包括細(xì)菌）

46（1）懸浮物中絕大多數(shù)為細(xì)菌時(shí)細(xì)胞數(shù)目=MLSS÷個(gè)體細(xì)菌的平均干重量離心沉淀濾膜過濾計(jì)算105~110℃下進(jìn)行干燥恒重稱重或MLSS懸浮物（1）懸浮物中絕大多數(shù)為細(xì)菌時(shí)細(xì)胞數(shù)目=MLSS÷個(gè)體細(xì)47（2）除細(xì)菌外還有大量無機(jī)懸浮物時(shí)

W無MLVSS揮發(fā)性懸浮物＝MLSS

－W無

=細(xì)菌群體的干重量細(xì)胞數(shù)目=

MLVSS÷個(gè)體細(xì)菌的平均干重量

550℃下灼燒2h稱重105~110℃下進(jìn)行干燥恒重稱重MLSS（2）除細(xì)菌外還有大量無機(jī)懸浮物時(shí)48總體來說重量法方法誤差較大，一般只作為菌數(shù)粗略估算如活性污泥測(cè)定（以重量MLSS、MLVSS間接表示細(xì)菌數(shù)量）總體來說重量法方法誤差較大，一般只作為菌數(shù)粗略估算492.DNA含量法同種細(xì)菌的DNA含量一致,可通過測(cè)定DNA的含量來表示細(xì)菌的生長(zhǎng)量少量純細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)細(xì)菌數(shù)量的測(cè)定。精確性非常高，對(duì)樣品純度以及儀器和人員的要求較高，2.DNA含量法同種細(xì)菌的DNA含量一致,可通過測(cè)定DNA的50總污染物影響促反應(yīng)的方程表達(dá)式——v——總污染物微生物利用速度；V—（KX)—最大速度；X—微生物濃度

Ks－飽和常數(shù)

Ks勞倫斯方程忽略KX

KX(四)其它生理生化指標(biāo)法提問：v指什么？COD降解vO2消耗v＆＆產(chǎn)物產(chǎn)生v？求作試驗(yàn)！總污染物影響促反應(yīng)的方程表達(dá)式——Ks勞倫斯方程忽略KX51提問：當(dāng)你需要測(cè)定某水樣中細(xì)菌數(shù)量時(shí)，你該如何選擇方法？視要求、水樣菌量、測(cè)試條件等等靈活選取提問：當(dāng)你需要測(cè)定某水樣中細(xì)菌數(shù)量時(shí)，你該如何選擇方法？視要52

第五章微生物的生長(zhǎng)繁殖與生存因子第五章微生物的生長(zhǎng)繁殖與生存因子53第一節(jié)微生物的生長(zhǎng)繁殖一、微生物生長(zhǎng)繁殖的概念二、研究微生物生長(zhǎng)的方法三、細(xì)菌生長(zhǎng)曲線在污（廢）水微生物處理中的應(yīng)用四、微生物生長(zhǎng)量的測(cè)定方法第一節(jié)微生物的生長(zhǎng)繁殖一、微生物生長(zhǎng)繁殖的概念54一、微生物的生長(zhǎng)繁殖的概念

微生物生長(zhǎng)是細(xì)胞物質(zhì)有規(guī)律地、不可逆增加，導(dǎo)致細(xì)胞體積擴(kuò)大的生物學(xué)過程，這是個(gè)體生長(zhǎng)的定義。繁殖是微生物生長(zhǎng)到一定階段，由于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)制與重建并通過特定方式產(chǎn)生新的生命個(gè)體，即引起生命個(gè)體數(shù)量增加的生物學(xué)過程。細(xì)菌兩次分裂之間的時(shí)間，稱為代時(shí)（世代時(shí)間）。一、微生物的生長(zhǎng)繁殖的概念微生物生長(zhǎng)是細(xì)胞物質(zhì)有規(guī)律地、不55二、研究微生物生長(zhǎng)的方法

（一）分批培養(yǎng)：將一定量的微生物接種在一個(gè)封閉的、盛有一定量液體培養(yǎng)基的容器內(nèi)，保持一定的溫度、和溶解氧量，使微生物在其中生長(zhǎng)繁殖。以細(xì)菌純種培養(yǎng)為例,將少量細(xì)菌接種到新鮮、定量的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行分批培養(yǎng)，定時(shí)取樣記數(shù)。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以細(xì)菌數(shù)目為縱坐標(biāo)，連接各取樣點(diǎn)坐標(biāo)，會(huì)出現(xiàn)微生物數(shù)量由少到多，達(dá)到高峰后又由多到少的變化曲線。即細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線。(growthcuwe)。二、研究微生物生長(zhǎng)的方法56（1）活細(xì)菌重量變化曲線曲線：群體重量W(mg/l)——時(shí)間t

細(xì)菌內(nèi)源呼吸增長(zhǎng)率上升階段

及細(xì)菌大量死亡階段

mg/L

活細(xì)菌重量t0時(shí)間曲線t`點(diǎn)切線斜率值=?

t`重量增長(zhǎng)速率t`

增長(zhǎng)率下降階段生長(zhǎng)情況用活細(xì)菌生長(zhǎng)曲線來描述（1）活細(xì)菌重量變化曲線曲線：群體重量W(mg/l)——時(shí)間57①增長(zhǎng)速率上升階段提問：為什么培養(yǎng)初期細(xì)菌群體重量增長(zhǎng)速率隨時(shí)間不斷增大？A.營養(yǎng)物豐富，細(xì)菌增殖；B.細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)以糖原、油滴等形式儲(chǔ)存營養(yǎng)物，細(xì)菌個(gè)體重量增大

增長(zhǎng)率

生上升階段

mg/mL

0時(shí)間t活細(xì)胞重量①增長(zhǎng)速率上升階段提問：為什么培養(yǎng)初期細(xì)菌群體重量增長(zhǎng)速率隨58②增長(zhǎng)速率下降階段提問：為什么增長(zhǎng)速率較前下降了？

增長(zhǎng)率下

降階段

mg/mL

0時(shí)間t活細(xì)胞重量營養(yǎng)物濃度（好氧細(xì)菌還包括氧氣）下降

這些限制性因素還不是十分嚴(yán)重，細(xì)菌的代謝速度變慢，沒有停止代謝產(chǎn)物積累對(duì)細(xì)菌的某些酶產(chǎn)生抑制②增長(zhǎng)速率下降階段提問：為什么增長(zhǎng)速率較前下降了？59③內(nèi)源呼吸及死亡階段———內(nèi)源呼吸+毒物濃度更高（個(gè)體）瘦→死（群體）死亡率大于出生率從曲線上反映為活細(xì)菌重量的進(jìn)一步持續(xù)下降。提問：此時(shí)細(xì)菌的出生率是否為零呢？為什么？不是，利用死亡細(xì)菌的殘?bào)w營養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室通常采用細(xì)菌的數(shù)量變化繪制生長(zhǎng)曲線，雖然兩種曲線在本質(zhì)上是相同的，但數(shù)量曲線也有它自身的特點(diǎn)和用途。③內(nèi)源呼吸及死亡階段———內(nèi)源呼吸+毒物濃度更高實(shí)驗(yàn)602．細(xì)菌數(shù)量生長(zhǎng)曲線

生

長(zhǎng)

速

率

靜止期

衰亡期

細(xì)菌數(shù)目的對(duì)數(shù)值

0時(shí)間t細(xì)菌的數(shù)量很大，都是10的n次方，取對(duì)數(shù)作圖時(shí)方便，0~10代表1～1010總菌數(shù)活菌數(shù)

停

滯

期對(duì)數(shù)期0+_2．細(xì)菌數(shù)量生長(zhǎng)曲線生61（1）停滯期特征：

細(xì)

菌

停

數(shù)

滯

目

期

的

對(duì)

數(shù)

值

0時(shí)間t提問：為什么會(huì)出現(xiàn)遲緩期呢？

代謝活躍，個(gè)體體積、重量增高

不立即進(jìn)行細(xì)胞分裂、增殖，數(shù)量不變甚至減少適應(yīng)環(huán)境（合成相應(yīng)的酶），營養(yǎng)儲(chǔ)備（用于復(fù)制合成）（1）停滯期特征：細(xì)62影響停滯期的因素：接種量接種群體菌齡營養(yǎng)影響停滯期的因素：63提問：根據(jù)上述原因選擇接種何種狀態(tài)的細(xì)菌遲緩期會(huì)較長(zhǎng)？對(duì)數(shù)期的細(xì)菌、靜止期或衰亡期、受損細(xì)胞、富集培養(yǎng)基的細(xì)菌后三種靜止期細(xì)胞基本耗盡了各種輔酶或其他細(xì)胞成分受損細(xì)胞養(yǎng)傷修復(fù)富集培養(yǎng)基細(xì)菌需要合成“自力更生”酶提問：根據(jù)上述原因選擇接種何種狀態(tài)的細(xì)菌遲緩期會(huì)較長(zhǎng)？靜止期64在實(shí)際工作中如接種菌種以啟動(dòng)新的水處理設(shè)施，投加新鮮污泥時(shí)，接種的細(xì)菌不習(xí)慣于新環(huán)境，會(huì)出現(xiàn)或長(zhǎng)或短的遲緩期，遲緩期的出現(xiàn)會(huì)增加操作時(shí)間，降低工作效率采用處于高效菌群對(duì)數(shù)期的菌種、增大接種量、盡量保持接種前后所處的培養(yǎng)介質(zhì)和條件一致等方法來縮短或消除遲緩期提問：我們可以通過哪些手段縮短遲緩期呢？在實(shí)際工作中如接種菌種以啟動(dòng)新的水處理設(shè)施，投加新鮮污泥時(shí)，65（2）對(duì)數(shù)期所有細(xì)菌均繁殖故稱對(duì)數(shù)期。（相當(dāng)于重量法細(xì)菌曲線的增長(zhǎng)率上升階段）細(xì)菌數(shù)目X增長(zhǎng)率倍率的對(duì)數(shù)與時(shí)間成正比。（2）對(duì)數(shù)期所有細(xì)菌均繁殖故稱對(duì)數(shù)期。（相當(dāng)于重量法細(xì)66特點(diǎn)平均代時(shí)（繁殖一代的時(shí)間）最短提問：細(xì)菌的代時(shí)與哪些因素有關(guān)？

細(xì)

菌

數(shù)

目

的

對(duì)

對(duì)

數(shù)

數(shù)

期

值

0時(shí)間t如大腸桿菌在20℃時(shí)其代時(shí)是35℃條件下的2倍；傷寒桿菌在含0.125％的蛋白胨培養(yǎng)基中的代時(shí)為800min，而在含1.0％時(shí)僅為40min。繁殖速度最快種類遺傳、個(gè)體健康情況(營養(yǎng)、環(huán)境條件)特點(diǎn)平均代時(shí)（繁殖一代的時(shí)間）最短67此時(shí)所有細(xì)菌在二分裂生長(zhǎng),分別測(cè)定t0時(shí)刻與t時(shí)間細(xì)菌的數(shù)量X0與X對(duì)數(shù)期細(xì)菌代時(shí)G計(jì)算1→2→22→23((22)×2)→24→25……2nt0tX=X0*2nX/X0=2nX0→……X0·24→……X(X0·2n)(n=1、2、3…)

n—繁殖代數(shù)

代時(shí)此時(shí)所有細(xì)菌在二分裂生長(zhǎng),分別測(cè)定t0時(shí)刻與t時(shí)間細(xì)菌的數(shù)量68（3）靜止期出生率＝死亡率

細(xì)

菌

緩

數(shù)

慢

目

期

的

對(duì)

靜止期

對(duì)

數(shù)

衰老期

數(shù)

期

值

0t時(shí)間死亡原因—營養(yǎng)短缺、代謝毒物增多（相當(dāng)于重量變化曲線中的增長(zhǎng)率下降階段）（3）靜止期出生率＝死亡率細(xì)69（4）衰亡期死亡率＞出生率（相當(dāng)于重量法的內(nèi)源呼吸階段）由于營養(yǎng)物被耗盡，細(xì)菌因缺乏營養(yǎng)而利用貯存物質(zhì)進(jìn)行內(nèi)源代謝，即自身溶解。細(xì)菌在代謝過程中產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，會(huì)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖。死亡率增加，活菌數(shù)減少，甚至死菌數(shù)大于新生菌數(shù)。（4）衰亡期死亡率＞出生率（相當(dāng)于重量法的內(nèi)源呼吸階70活性污泥法中的序批式反應(yīng)器（SBR）法是將分批培養(yǎng)的原理應(yīng)用于污水生物處理的實(shí)例?；钚晕勰喾ㄖ械男蚺椒磻?yīng)器（SBR）法是將分批培養(yǎng)的原理應(yīng)用71是在微生物的整個(gè)培養(yǎng)期間，通過一定的方式使微生物能以恒定的比生長(zhǎng)速率生長(zhǎng)并能持續(xù)生長(zhǎng)下去的一種培養(yǎng)方法。（二）連續(xù)培養(yǎng)(continouscultureofmicroorganisms)是在微生物的整個(gè)培養(yǎng)期間，通過一定的方式使微生物能以恒定的比72（1）恒濁連續(xù)培養(yǎng)

恒濁——培養(yǎng)基濁度恒定（實(shí)質(zhì)是細(xì)菌數(shù)量恒定）新鮮培養(yǎng)基光電池光源流速控制閥出水很少應(yīng)用反饋控制（1）恒濁連續(xù)培養(yǎng)恒濁——培養(yǎng)基濁度恒定（實(shí)質(zhì)是細(xì)菌數(shù)73（2）恒化連續(xù)培養(yǎng)

化——？新鮮培養(yǎng)基流速控制閥出水應(yīng)用：環(huán)境工程、生物工程、實(shí)驗(yàn)室研究（細(xì)菌生理特性研究、細(xì)菌的快速篩選等）。

流速恒定進(jìn)料營養(yǎng)物總量（2）恒化連續(xù)培養(yǎng)化——？新鮮培養(yǎng)基流速控制閥出水流速74目前,污水連續(xù)生物處理法均類似于恒化連續(xù)培養(yǎng)；（流速不完全恒定）目前,污水連續(xù)生物處理法均類似于恒化連續(xù)培養(yǎng)；（流速不完全754．污(廢)水連續(xù)處理中的細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)不同的生物反應(yīng)器，

細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)可能不同！乃至同一反應(yīng)器內(nèi)不同位置處4．污(廢)水連續(xù)處理中的細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)不同的生物反應(yīng)器，76連續(xù)生物處理中的細(xì)菌狀態(tài)表

細(xì)菌的生長(zhǎng)階段應(yīng)用舉例特點(diǎn)停滯期無連續(xù)化穩(wěn)定操作中沒有這一階段對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期高負(fù)荷活性污泥法(大部分區(qū)域)靜止期生物膜法常規(guī)活性污泥法(大部分區(qū)域)生長(zhǎng)繁殖快，代謝活力強(qiáng)，能大量去除廢水中有機(jī)物。（缺點(diǎn)是細(xì)菌表面的粘液層和莢膜尚未形成，運(yùn)動(dòng)很活躍，不易自行凝聚成菌膠團(tuán)，沉淀性能差，致使出水水質(zhì)有機(jī)物濃度相對(duì)較高）衰老期低濃度污水延時(shí)曝氣法污泥的厭氧消化營養(yǎng)物濃度過低，難以滿足其他階段細(xì)菌的生長(zhǎng)需要雖然比對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的差，但仍有相當(dāng)?shù)拇x活力，細(xì)菌體內(nèi)積累了大量貯存物，如異染粒、聚β—羥基丁酸等，體表的粘液層和莢膜強(qiáng)化了細(xì)菌的生物吸附能力，自我絮凝、聚合能力強(qiáng)，在二沉池中泥水分離效果好，出水水質(zhì)好。1:0.4~0.8BOD.d-細(xì)菌與降解BOD重量比1:0.4以下連續(xù)生物處理中的細(xì)菌狀態(tài)表細(xì)菌的生長(zhǎng)階段應(yīng)用舉例特點(diǎn)停滯期77進(jìn)水對(duì)數(shù)期穩(wěn)定期衰老期平推流式活性污泥法占優(yōu)勢(shì)進(jìn)水對(duì)數(shù)期穩(wěn)定期衰老期平推流式活性污泥法占優(yōu)勢(shì)78四、微生物生長(zhǎng)（數(shù)量）測(cè)定方法（1）直接計(jì)數(shù)法（測(cè)定微生物總數(shù)）借助顯微鏡觀察測(cè)定優(yōu)點(diǎn)：快速提問:有哪些缺點(diǎn)?缺點(diǎn)：不能區(qū)分細(xì)菌的死活分四種四、微生物生長(zhǎng)（數(shù)量）測(cè)定方法（1）直接計(jì)數(shù)法（測(cè)定微生物791.涂片染色法1.涂片染色法802.計(jì)數(shù)器(血球計(jì)數(shù)板）測(cè)定法0.052cm2×250.1ml菌液2.計(jì)數(shù)器(血球計(jì)數(shù)板）測(cè)定法0.052cm2×250.1m81提問：數(shù)了125個(gè)小格中有90個(gè)細(xì)菌，樣品中的細(xì)菌濃度是多少？(90個(gè)÷125)*400/0.1ml=2880個(gè)/ml適用范圍：測(cè)定個(gè)體較大的細(xì)菌或原生動(dòng)物細(xì)菌個(gè)體若太小、過多，由于每一小格中細(xì)菌層層疊加，相互遮擋，難以準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。數(shù)數(shù)細(xì)菌（或其他微生物或細(xì)胞）數(shù)目，（一般數(shù)125個(gè)小格），折算樣品細(xì)菌濃度；提問：數(shù)了125個(gè)小格中有90個(gè)細(xì)菌，樣品中的細(xì)菌濃度是多少823.比例計(jì)數(shù)法比例——樣品菌液與等體積的血液混合，觀測(cè)二者比例提問：如果平均每個(gè)視野中細(xì)菌數(shù)量/紅血球的數(shù)量比例為5.5：1，則細(xì)菌數(shù)量=？5.5×400萬個(gè)/ml=2.2×107個(gè)/mL樣品紅血球數(shù)已知(男性400~500萬個(gè)／ml，女性350~450萬個(gè)／ml)，平均400萬個(gè)/ml細(xì)菌紅血球3.比例計(jì)數(shù)法比例——樣品菌液與等體積的血液混合，觀測(cè)二者比834．比濁計(jì)數(shù)法濁——細(xì)菌懸浮液的濁度提問：如何定量二者關(guān)系呢？細(xì)菌不完全透光，一定范圍內(nèi)菌溶液的混濁度與菌數(shù)量成正比4．比濁計(jì)數(shù)法濁——細(xì)菌懸浮液的濁度提問：如何定844．比濁計(jì)數(shù)法濁——細(xì)菌懸浮液的濁度細(xì)菌不完全透光，一定范圍內(nèi)菌溶液的混濁度與菌數(shù)量成正比4．比濁計(jì)數(shù)法濁——細(xì)菌懸浮液的濁度細(xì)菌不完全透85

（1）制標(biāo)準(zhǔn)曲線（OD~No）（2）測(cè)菌液濁度，查圖表得出細(xì)菌數(shù)量濁度儀或721分光光度儀（1）制標(biāo)準(zhǔn)曲線（OD~No）（2）測(cè)菌液濁度，查圖表得86（二）間接計(jì)數(shù)法(活菌計(jì)數(shù)法)提問：前述方法中計(jì)數(shù)的不都是活菌，如何分辨菌死活？繁殖提問：細(xì)菌繁殖的可見現(xiàn)象是什么？產(chǎn)生菌落（固體培養(yǎng)基培養(yǎng)）、菌液混濁（液體培養(yǎng)基培養(yǎng)）計(jì)數(shù)原理：一個(gè)細(xì)菌可繁殖成一個(gè)菌落或一群細(xì)菌.缺點(diǎn)：慢

分固體培養(yǎng)法和液體培養(yǎng)法（二）間接計(jì)數(shù)法(活菌計(jì)數(shù)法)提問：前述方法中計(jì)數(shù)的不都87無菌水1.

稀釋平板計(jì)數(shù)法—固體培養(yǎng)法第一步：菌樣巧妙稀釋得到不同稀釋度（10-x）菌液菌樣被無菌水不同稀釋倍率后平板培養(yǎng)圖無菌水1.稀釋平板計(jì)數(shù)法—固體培養(yǎng)法第一步：菌樣巧妙稀釋得88

10-210-3

10-410-5

各取1ml，均勻涂布于冷固體培養(yǎng)基平板上或與溫?zé)嵋簯B(tài)固體培養(yǎng)基混合冷卻。第三步：培養(yǎng)稀釋度過低，菌落密集無法計(jì)數(shù)可以計(jì)數(shù)，但數(shù)量過多，費(fèi)時(shí)費(fèi)力數(shù)量合適，統(tǒng)計(jì)計(jì)算，作為結(jié)果數(shù)量太少，誤差因素太大，不做計(jì)數(shù)第二步：接種平板每一個(gè)細(xì)菌會(huì)生成一個(gè)菌落10-210-31089一般計(jì)數(shù)平板的細(xì)菌生長(zhǎng)菌落數(shù)以30~300個(gè)為宜。第四步：計(jì)數(shù)細(xì)菌數(shù)量=？細(xì)菌數(shù)量=數(shù)出的菌落數(shù)/稀釋度例如：10-5稀釋度時(shí)菌落數(shù)為125個(gè)細(xì)菌數(shù)量=125/10-5=1.25×107個(gè)/mL

平板計(jì)數(shù)法是采用最廣的一種活菌計(jì)數(shù)法如國標(biāo)法水中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定。注意：作空白及取平行樣（2～3組）均值減小誤差平均一般計(jì)數(shù)平板的細(xì)菌生長(zhǎng)菌落數(shù)以30~300個(gè)為宜。第四步：902.稀釋液體計(jì)數(shù)法特點(diǎn)：液體培養(yǎng)、統(tǒng)計(jì)學(xué)查表計(jì)數(shù)又稱MPN法（或最可能數(shù)法）MostProbableNumber例如測(cè)定SRB（硫酸鹽還原菌，厭氧）的數(shù)量提問：能用稀釋平板法計(jì)數(shù)嗎？為什么？一般不能，厭氧菌暴露在空氣中不能生長(zhǎng)（除非厭氧培養(yǎng)箱）對(duì)這類菌可以利用它們生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生的硫化亞鐵黑色特征進(jìn)行深層隔氧液體培養(yǎng)，按MPN法進(jìn)行計(jì)數(shù)。2.稀釋液體計(jì)數(shù)法特點(diǎn)：液體培養(yǎng)、統(tǒng)計(jì)學(xué)查表計(jì)數(shù)對(duì)這類91

332010-4

10-5

10-63

10-

10-210-3

10-410-5（1）稀釋（2）稀釋接種樣品在液體表面加一層無菌液體石蠟隔絕氧氣，恒溫37℃培養(yǎng)14天記錄變黑的試管情況（3）培養(yǎng)1ml+9ml培養(yǎng)基提問：為什么有些試管變黑有些沒有？稀釋程度、取樣概率

92(4)統(tǒng)計(jì)－查表－計(jì)算

根據(jù)不同稀釋度變黑試