《水生生物DNA條形碼構(gòu)建規(guī)程》（征求意見稿）編制說明《水生生物DNA條形碼構(gòu)建規(guī)程》標(biāo)準(zhǔn)編制組二零二二年五月目錄1項(xiàng)目背景 項(xiàng)目背景任務(wù)來源本標(biāo)準(zhǔn)由南京大學(xué)提出，并由中國環(huán)境科學(xué)學(xué)會歸口，2020年申請立項(xiàng)，被列入中國環(huán)境科學(xué)學(xué)會2020年第二批標(biāo)準(zhǔn)編制計(jì)劃正式批準(zhǔn)立項(xiàng)，由南京大學(xué)等單位起草。工作過程按照標(biāo)準(zhǔn)編寫要求，項(xiàng)目承擔(dān)單位組織相關(guān)科研人員組成了標(biāo)準(zhǔn)編制組。編制組成員及時(shí)查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)資料，按照GB/T1.1—2020給出的最新規(guī)定起草和編制。在前期項(xiàng)目研究、文獻(xiàn)資料分析以及實(shí)際應(yīng)用的基礎(chǔ)上，編制組討論并確定了開展標(biāo)準(zhǔn)編制工作的原則、程序、步驟和方法，目前形成標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿及編制說明。主要工作如下：研究基礎(chǔ)2013年-2019年，編制組通過閱讀文獻(xiàn)和收集國內(nèi)外相關(guān)資料，確定了構(gòu)建我國本土水生生物DNA條形碼的工作內(nèi)容，并針對相關(guān)內(nèi)容和關(guān)鍵參數(shù)開展了大量的科學(xué)研究工作，積累了大量的數(shù)據(jù)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，初步確定了水生生物DNA條形碼構(gòu)建方法的基本框架和流程。編制啟動(dòng)編制組接到標(biāo)準(zhǔn)制定任務(wù)后，立刻組織落實(shí)標(biāo)準(zhǔn)制定工作。確定由來自高校、科研機(jī)構(gòu)、企業(yè)的相關(guān)專家組成起草組，形成標(biāo)準(zhǔn)初稿。理論研究2019年3月-2019年7月：為了按照文件要求，準(zhǔn)確完成制定工作，標(biāo)準(zhǔn)起草組通過各種途徑，收集并學(xué)習(xí)了《海洋調(diào)查規(guī)范第6部分：海洋生物調(diào)查》（GB/T12763.6）、《Sanger法測序技術(shù)指南》（GB/T34265）和《核酸提取純化方法評價(jià)通則》（GB/T37874）等相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)和書籍，并進(jìn)一步整理學(xué)習(xí)了《水質(zhì)采樣方案設(shè)計(jì)技術(shù)規(guī)定》（HJ495）、《生物遺傳資源采集技術(shù)規(guī)范》（HJ628）、《生物多樣性觀測技術(shù)導(dǎo)則內(nèi)陸水域魚類》（HJ710.7）和《生物多樣性觀測技術(shù)導(dǎo)則淡水底棲大型無脊椎動(dòng)物》（HJ710.8）等生態(tài)環(huán)境部發(fā)布的本領(lǐng)域相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)也深入學(xué)習(xí)了《林木DNA條形碼構(gòu)建技術(shù)規(guī)程》（LY/T3191）、《國境口岸醫(yī)學(xué)媒介昆蟲DNA條形碼鑒定操作規(guī)程》（SY/T4278）和《海洋浮游微藻分離和篩選技術(shù)規(guī)程》（DB21/T2777）等行業(yè)/地方標(biāo)準(zhǔn)，收集和研究了眾多國內(nèi)外水生生物DNA條形碼構(gòu)建的方法和實(shí)際案例。經(jīng)過資料分析和共性總結(jié)，初步對水生生物DNA條形碼構(gòu)建方案進(jìn)行梳理和提煉。理順了標(biāo)準(zhǔn)制定的方向和思路，形成標(biāo)準(zhǔn)編制大綱。調(diào)研/實(shí)驗(yàn)研究為了使標(biāo)準(zhǔn)具有科學(xué)性和可操作性，在2019年-2020年，標(biāo)準(zhǔn)起草組在已有的實(shí)驗(yàn)研究和資料分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步聯(lián)合多家編制單位將已構(gòu)建的方法應(yīng)用在我國重點(diǎn)流域的本土物種DNA條形碼構(gòu)建實(shí)踐中，與相關(guān)技術(shù)和管理人員進(jìn)行深入地探討，調(diào)整已有方法。標(biāo)準(zhǔn)草稿2020年2月-2020年6月：標(biāo)準(zhǔn)起草組召開起草工作研討會，就標(biāo)準(zhǔn)起草過程中存在的問題進(jìn)行集中研討。標(biāo)準(zhǔn)起草組針對不同生物類群的采樣方法和遺傳特征，進(jìn)一步完善水生生物DNA條形碼建庫的流程和關(guān)鍵參數(shù)，經(jīng)過若干次課題組內(nèi)部研討會和專家咨詢會，形成了標(biāo)準(zhǔn)草稿。標(biāo)準(zhǔn)立項(xiàng)2020年6月：標(biāo)準(zhǔn)起草組向中國環(huán)境科學(xué)學(xué)會提交制修訂立項(xiàng)申請書。2020年10月：召開標(biāo)準(zhǔn)立項(xiàng)論證會，專家組一致同意標(biāo)準(zhǔn)通過立項(xiàng)論證。2020年11月：經(jīng)中國環(huán)境科學(xué)學(xué)會審議進(jìn)行立項(xiàng)公示。2020年12月：經(jīng)中國環(huán)境科學(xué)學(xué)會審議進(jìn)行正式立項(xiàng)。（7）征求意見稿2020年12月-2021年6月：標(biāo)準(zhǔn)起草組結(jié)合文獻(xiàn)及專家建議完成標(biāo)準(zhǔn)初稿。2021年7月，中國環(huán)境科學(xué)學(xué)會通過視頻會議召開團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)專家咨詢會。與會專家聽取了編制組的匯報(bào)，審閱了相關(guān)技術(shù)文件，經(jīng)過質(zhì)詢討論，形成如下意見：編制組在集成“十二五”和“十三五”國家水體污染控制與治理科技重大專項(xiàng)相關(guān)課題研究成果基礎(chǔ)上，參考國內(nèi)外相關(guān)研究文獻(xiàn)編制了標(biāo)準(zhǔn)文本和編制說明，標(biāo)準(zhǔn)可為我國水生生物監(jiān)測與水生態(tài)健康評價(jià)提供技術(shù)支撐。標(biāo)準(zhǔn)文本內(nèi)容完整、技術(shù)路線可行。建議：①《水生生物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫構(gòu)建規(guī)范》修改為《水生生生物DNA條形碼構(gòu)建技術(shù)規(guī)程》；②根據(jù)《中國環(huán)境科學(xué)學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)管理辦法》進(jìn)一步完善和細(xì)化標(biāo)準(zhǔn)文本及編制說明。專家一致同意完善后公開征求意見。2021年8月-2022年3月：標(biāo)準(zhǔn)起草組根據(jù)專家建議進(jìn)一步修改完善。主要完善以下內(nèi)容：（1）術(shù)語和定義的規(guī)范化和統(tǒng)一性；（2）標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容的專業(yè)性和系統(tǒng)性；（3）文本的格式和規(guī)范性等。2022年4月7日，中國環(huán)境科學(xué)學(xué)會牽頭組織了關(guān)于團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的二輪專家咨詢會，與會專家聽取了編制組的匯報(bào)并對標(biāo)準(zhǔn)材料進(jìn)行了審閱。專家認(rèn)為編制單位提供的材料齊全，內(nèi)容完整；編制單位對國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)進(jìn)行了充分調(diào)研；標(biāo)準(zhǔn)定位準(zhǔn)確，技術(shù)路線合理可行，內(nèi)容完善；三項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)可為我國水生生物監(jiān)測與水生態(tài)健康評價(jià)提供技術(shù)支撐。專家組一致同意修改完善后公開征求意見。并建議：（1）進(jìn)一步完善標(biāo)準(zhǔn)文本中的術(shù)語定義；（2）根據(jù)《中國環(huán)境科學(xué)學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)管理辦法》進(jìn)一步完善用語規(guī)范，細(xì)化遺傳距離計(jì)算等內(nèi)容。2022年4月，編制組根據(jù)專家建議，進(jìn)一步對標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容和格式進(jìn)行完善。2標(biāo)準(zhǔn)制定的必要性標(biāo)準(zhǔn)制定的意義和目的水生態(tài)系統(tǒng)為人類社會的發(fā)展提供了多方面的生態(tài)服務(wù)功能，包括生物棲息地、水質(zhì)凈化、水文水量保持等。以淡水生態(tài)系統(tǒng)為例，盡管其僅占地球水量的0.01%，但為超過10%人類所認(rèn)知的生物提供了棲息環(huán)境ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>BarrettM</Author><Year>2018</Year><RecNum>1617</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[1,2]</style></DisplayText><record><rec-number>1617</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vx5aa9zdrw2w2se2f5axza5tpvpvparzwsvz"timestamp="1636273775">1617</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>BarrettM,BelwardA,BladenS,BreezeT,BurgessN,ButchartS,ClewclowH,CornellS,CottamA,CroftS</author></authors></contributors><titles><title>Livingplanetreport2018:Aiminghigher</title></titles><pages>1-144</pages><dates><year>2018</year></dates><urls></urls></record></Cite><Cite><Author>Altermatt</Author><Year>2020</Year><RecNum>1616</RecNum><record><rec-number>1616</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vx5aa9zdrw2w2se2f5axza5tpvpvparzwsvz"timestamp="1636273414">1616</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Altermatt,Florian</author><author>Little,ChelseaJ.</author><author>Maechler,Elvira</author><author>Wang,Shaopeng</author><author>Zhang,Xiaowei</author><author>Blackman,RosettaC.</author></authors></contributors><titles><title>Uncoveringthecompletebiodiversitystructureinspatialnetworks:theexampleofriverinesystems</title><secondary-title>Oikos</secondary-title></titles><periodical><full-title>Oikos</full-title></periodical><pages>607-618</pages><volume>129</volume><number>5</number><dates><year>2020</year><pub-dates><date>May</date></pub-dates></dates><isbn>0030-1299</isbn><accession-num>WOS:000509891200001</accession-num><urls><related-urls><url><GotoISI>://WOS:000509891200001</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1111/oik.06806</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[1,2]。特別是，地球上約40%的魚類和超過30%的脊椎動(dòng)物生活在淡水生態(tài)系統(tǒng)中ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[3,4]。近年來，人類活動(dòng)和氣候變化對水生態(tài)系統(tǒng)造成破壞，導(dǎo)致水生生物多樣性下降，水生態(tài)功能受損等。相比于山林、陸地、海洋等其他生態(tài)系統(tǒng)，淡水生態(tài)系統(tǒng)中生物多樣性的下降尤為嚴(yán)重，已成為地球上退化最嚴(yán)重的生態(tài)系統(tǒng)ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[3-5]。因此，加強(qiáng)水生生物監(jiān)測和水生態(tài)系統(tǒng)的管理關(guān)乎生態(tài)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展、符合生態(tài)文明建設(shè)的發(fā)展理念。精準(zhǔn)、高效的生物監(jiān)測是生物多樣性保護(hù)和水生態(tài)健康評估的基本保障。水生生物門類繁多，分布廣泛且形態(tài)特征差異巨大，存在大量隱蔽種和未知種。我國水生生物資源非常豐富，常見的浮游植物2000余種ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>魏印心</Author><Year>2006</Year><RecNum>1292</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[6]</style></DisplayText><record><rec-number>1292</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vx5aa9zdrw2w2se2f5axza5tpvpvparzwsvz"timestamp="1589975576">1292</key></foreign-keys><ref-typename="Book">6</ref-type><contributors><authors><author>胡鴻鈞魏印心</author></authors></contributors><titles><title>中國淡水藻類:系統(tǒng)、生態(tài)及分類</title></titles><dates><year>2006</year></dates><publisher>科學(xué)出版社</publisher><urls></urls></record></Cite></EndNote>[6]，浮游動(dòng)物（橈足、枝角類和輪蟲）600多種，常見的底棲動(dòng)物超過900屬，魚類1600余種（Fishbase,https://www.fishbase.in/search.php）。此外，據(jù)科學(xué)估計(jì)，目前尚有90%以上的物種未被形態(tài)學(xué)分類描述。受傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)監(jiān)測方法的局限，不同類群的鑒定往往需要借助不同的專家，且嚴(yán)重依賴于鑒定人的專業(yè)知識和經(jīng)驗(yàn)。以底棲動(dòng)物類群為例，物種繁多，形態(tài)多樣且復(fù)雜，主要包括扁形動(dòng)物（Platyhelminthes）、線形動(dòng)物（Nematomorpha）、線蟲動(dòng)物（Nemata）、環(huán)節(jié)動(dòng)物（Annelida）、軟體動(dòng)物（Mollusca）、節(jié)肢動(dòng)物（Arthropoda）等諸多門類。由于部分類群的分類檢索系統(tǒng)尚不完善，甚至不同來源的分類資料存在分歧，導(dǎo)致物種鑒定的準(zhǔn)確率低。如在德國某河流/溪流開展的形態(tài)學(xué)方法底棲動(dòng)物監(jiān)測調(diào)查中，414個(gè)大型無脊椎動(dòng)物樣品中有29%的個(gè)體在挑選過程中被忽略，30%的物種存在專家鑒定差異，最終導(dǎo)致水生態(tài)評估結(jié)果存在分歧ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Haase</Author><Year>2010</Year><RecNum>1628</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[7]</style></DisplayText><record><rec-number>1628</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vx5aa9zdrw2w2se2f5axza5tpvpvparzwsvz"timestamp="1636859003">1628</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Haase,Peter</author><author>Pauls,SteffenU.</author><author>Schindehuette,Karin</author><author>Sundermann,Andrea</author></authors></contributors><titles><title>FirstauditofmacroinvertebratesamplesfromanEUWaterFrameworkDirectivemonitoringprogram:humanerrorgreatlylowersprecisionofassessmentresults</title><secondary-title>JournaloftheNorthAmericanBenthologicalSociety</secondary-title></titles><periodical><full-title>JournaloftheNorthAmericanBenthologicalSociety</full-title></periodical><pages>1279-1291</pages><volume>29</volume><number>4</number><dates><year>2010</year><pub-dates><date>Dec</date></pub-dates></dates><isbn>0887-3593</isbn><accession-num>WOS:000283891800008</accession-num><urls><related-urls><url><GotoISI>://WOS:000283891800008</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1899/09-183.1</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[7]。更不用說個(gè)體微小、門類更多的浮游藻類和浮游動(dòng)物的分類鑒定。在一項(xiàng)對法國河流硅藻的生物監(jiān)測研究中，采用形態(tài)學(xué)方法對同一條河流中相同位點(diǎn)取樣分析，三個(gè)專家鑒定的硅藻種類的一致率不到1/3ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Wach</Author><Year>2019</Year><RecNum>1295</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[8]</style></DisplayText><record><rec-number>1295</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vx5aa9zdrw2w2se2f5axza5tpvpvparzwsvz"timestamp="1589976375">1295</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Wach,Marie</author><author>Gueguen,Julie</author><author>Chauvin,Christian</author><author>Delmas,Francois</author><author>Dagens,Nina</author><author>Feret,Thibaut</author><author>Loriot,Sandrine</author><author>Tison-Rosebery,Juliette</author></authors></contributors><titles><title>Probabilityofmisclassifyingriverecologicalstatus:Alarge-scaleapproachtoassignuncertaintyinmacrophyteanddiatom-basedbiomonitoring</title><secondary-title>EcologicalIndicators</secondary-title></titles><periodical><full-title>EcologicalIndicators</full-title></periodical><pages>285-295</pages><volume>101</volume><dates><year>2019</year><pub-dates><date>Jun</date></pub-dates></dates><isbn>1470-160X</isbn><accession-num>WOS:000470963300029</accession-num><urls><related-urls><url><GotoISI>://WOS:000470963300029</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1016/j.ecolind.2019.01.028</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[8]。成年魚類個(gè)體相對較大，分類鑒定相比藻類等小型生物難度略低，但魚卵、幼魚、小型魚類及非常見種的鑒定需要分析人員的長期積累和經(jīng)驗(yàn)支撐。因此，傳統(tǒng)的監(jiān)測方法不僅監(jiān)測通量低，且難以精準(zhǔn)鑒定物種，無法有效地監(jiān)測野外生物多樣性，并進(jìn)一步開展生態(tài)健康評估。目前急需在傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)基礎(chǔ)上，建立便捷準(zhǔn)確的分子鑒定手段。DNA條形碼技術(shù)是利用生物共有的、但種間差異明顯的遺傳信息脫氧核糖核酸（DNA）序列來實(shí)現(xiàn)物種鑒定的技術(shù)，具有可標(biāo)準(zhǔn)化和可量化統(tǒng)計(jì)分析的特點(diǎn)ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[9,10]。其中DNA片段要求長度較短、容易擴(kuò)增、變異率適中且種間遺傳距離明顯大于種內(nèi)遺傳距離，以形成物種特異性的條形碼。DNA條形碼數(shù)據(jù)庫用于存儲大量物種/樣本的DNA條形碼信息，用于記載物種的遺傳信息，并可用于在獲得其它樣本DNA序列后，進(jìn)行序列比對，進(jìn)而用于準(zhǔn)確地鑒定物種，識別隱蔽種甚至新物種。DNA條形碼及其數(shù)據(jù)庫使物種鑒定過程實(shí)現(xiàn)信息化和標(biāo)準(zhǔn)化，突破了傳統(tǒng)方法對鑒定者個(gè)人能力和經(jīng)驗(yàn)的過度依賴，并可利用生物殘留的組織或者遺留的DNA進(jìn)行快速有效的鑒定。但是目前的DNA條形碼技術(shù)在水生生物鑒定中多針對某單一類群，如水生昆蟲、硅藻等，且現(xiàn)有的方法流程和重要參數(shù)均不統(tǒng)一，有待標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化。本標(biāo)準(zhǔn)以構(gòu)建水生生物DNA條形碼為目標(biāo)，規(guī)范水環(huán)境生物DNA條形碼構(gòu)建方法，有效記錄本土水生生物的遺傳特征，完善我國水生生物DNA條形碼信息，為研究水生生物和水生態(tài)系統(tǒng)提供大量穩(wěn)定的、準(zhǔn)確的和可比較的數(shù)據(jù)，助力我國生物多樣性保護(hù)和水生態(tài)健康評估與恢復(fù)。國內(nèi)外相關(guān)技術(shù)發(fā)展動(dòng)態(tài)自2000年以來，全球DNA條形碼研究的相關(guān)論文超過8800篇，其中美國發(fā)表的論文數(shù)最多，其次為我國，發(fā)表論文數(shù)占全球總數(shù)的15%（圖1）。目前最為常用的DNA條形碼參考數(shù)據(jù)庫為BOLD（BarcodeofLifedata）和NCBI中的GenBank，收集了自世界各地的各個(gè)類群DNA條形碼，包含信息較為全面，但是其中存在大量的冗余甚至錯(cuò)誤信息，導(dǎo)致采用該公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋的準(zhǔn)確率偏低ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Locatelli</Author><Year>2020</Year><RecNum>1393</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[11]</style></DisplayText><record><rec-number>1393</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vx5aa9zdrw2w2se2f5axza5tpvpvparzwsvz"timestamp="1618652599">1393</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Locatelli,NicolasS.</author><author>McIntyre,PeterB.</author><author>Therkildsen,NinaO.</author><author>Baetscher,DianaS.</author></authors></contributors><titles><title>GenBank'sreliabilityisuncertainforbiodiversityresearchersseekingspecies-levelassignmentforeDNA</title><secondary-title>ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica</secondary-title></titles><periodical><full-title>ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica</full-title></periodical><pages>32211-32212</pages><volume>117</volume><number>51</number><dates><year>2020</year><pub-dates><date>Dec22</date></pub-dates></dates><isbn>0027-8424</isbn><accession-num>WOS:000601315200008</accession-num><urls><related-urls><url><GotoISI>://WOS:000601315200008</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1073/pnas.2007421117</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[11]。另外，也有研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了針對特定分類群的參考DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，如針對雙鞭毛藻的數(shù)據(jù)庫DINOREF，硅藻的數(shù)據(jù)庫R-Syst::diatom，魚類數(shù)據(jù)庫FISH-BOL目前全球有30多個(gè)國家參與構(gòu)建DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，多個(gè)國家開始構(gòu)建本土物種DNA條形碼。2010年，全球20個(gè)國家發(fā)起參與了“BARCODE5000”計(jì)劃，投資1.25億美元，截止2015年，為500,000物種提供DNA條形碼。2019年，iBOL生命條形碼聯(lián)盟開啟BIOSCAN項(xiàng)目（/programs/bioscan/），來自30多個(gè)國家1000多名研究人員參與，投資1.8億美元，建立分析淡水、海洋和陸地生態(tài)系統(tǒng)近千萬個(gè)樣本覆蓋2000,000個(gè)物種的DNA條形碼，旨在加速物種發(fā)現(xiàn)，探索物種間的相互作用，以及跟蹤物種動(dòng)態(tài)。也有許多國家開始構(gòu)建整理本土物種的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫。例如奧地利條形碼計(jì)劃（ABOL）是一項(xiàng)旨在為奧地利記錄的所有動(dòng)植物物種DNA條形碼的計(jì)劃?？偛课挥诰S也納自然歷史博物館的ABOL試驗(yàn)階段和持續(xù)協(xié)調(diào)由國家教育和科學(xué)研究部提供資金。ABOL還旨在通過籌集資金，促進(jìn)DNA條形碼的各種應(yīng)用，提高公眾對生物多樣性的意識來促進(jìn)生物多樣性研究。在芬蘭FinBOL是一項(xiàng)國家級項(xiàng)目，旨在為芬蘭境內(nèi)所有動(dòng)植物物種創(chuàng)建DNA條形碼。自2011年以來，F(xiàn)inBOL一直由數(shù)個(gè)國家資助機(jī)構(gòu)提供持續(xù)資助。目前，芬蘭館藏的超過100,000個(gè)標(biāo)本已經(jīng)過條形碼處理，DNA條形碼可用于芬蘭報(bào)道的大約20,000種（約50％）。在不久的將來，F(xiàn)inBOL旨在通過采用高效的高通量測序工具從古老的博物館標(biāo)本中恢復(fù)古生物的序列信息，來擴(kuò)大全國DNA條形碼數(shù)據(jù)庫。德國聯(lián)邦教育和研究部正在資助一個(gè)自然歷史博物館和研究機(jī)構(gòu)的聯(lián)盟GBOL，以建立“德國生物條形碼”倡議。其主要目的是建立一個(gè)由專業(yè)人員和非專業(yè)人員組成的網(wǎng)絡(luò)，首先為德國動(dòng)植物和真菌建立一個(gè)DNA條形碼數(shù)據(jù)庫。荷蘭于2008年啟動(dòng)了植物和動(dòng)物條形碼組織計(jì)劃，由荷蘭博物學(xué)生物多樣性中心牽頭，與大量荷蘭非政府組織和50多名業(yè)余博物學(xué)家合作。（A）（B）圖1全球及我國DNA條形碼研究現(xiàn)狀表1各國DNA條形碼數(shù)據(jù)庫地區(qū)數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站/參考文獻(xiàn)國際NCBI/國際BOLD/國際Fish-basehttps://www.fishbase.in/search.php奧地利ABOLhttps://www.abol.ac.at/芬蘭FinBOL/德國GBOLhttps://bolgermany.de/home/en/german-barcode-of-life-2挪威NorBOL/en/瑞士SwissBOLhttp://www.swissbol.ch/葡萄牙LusoMarBoLADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[12]荷蘭NBOLADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[12]我國在高等植物、鳥類等陸生動(dòng)物類群開展DNA條形碼研究較多，并將其成功應(yīng)用在中草藥和入侵物種的分子鑒定，目前已發(fā)布了行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《林業(yè)DNA條形碼構(gòu)建技術(shù)規(guī)程》（LY/T3191）和《國境口岸醫(yī)學(xué)媒介昆蟲DNA條形碼鑒定操作規(guī)程》（SN/T4278），并發(fā)表《中國藥典中藥材DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列》和《中國藥用動(dòng)物DNA條形碼研究》等書籍。2014年，科技部通過科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)部署了“我國近海海洋生物DNA條形碼資源庫構(gòu)建”重點(diǎn)項(xiàng)目，由中國科學(xué)院海洋研究所承擔(dān)。該項(xiàng)目提出“對有代表性的重要海洋生物類群：如原核生物、植物、浮游動(dòng)物、大型底棲無脊椎動(dòng)物及魚類，在準(zhǔn)確形態(tài)鑒定的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)并規(guī)?；@取DNA條形碼序列”，預(yù)計(jì)5年內(nèi)搭建起一個(gè)涵蓋2000個(gè)物種的15000條標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)DNA條形碼數(shù)據(jù)庫。目前針對我國淡水生態(tài)系統(tǒng)水生生物的本地物種條形碼數(shù)據(jù)庫仍非常不完善。由于同一物種的不同亞種或不同生態(tài)型在分類學(xué)上屬于同一個(gè)物種，但是其基因型、條形碼信息均存在或多或少的差異。經(jīng)調(diào)查：我國常見藍(lán)藻有419種，32.20%的物種在NCBIGenBank中具有DNA條形碼，只有8.12%的物種具有充足的DNA條形碼序列（≥5）和7.16%的物種有來自中國的DNA條形碼序列。常見淡水真核浮游植物1664種，只有14.90%在NCBI公共數(shù)據(jù)庫具有DNA條形碼序列和7.21%的物種有來自中國的DNA條形碼序列。常見淡水浮游動(dòng)物626種，30.36%的物種在數(shù)據(jù)庫中有≥1條序列，17.33%具有≥5條序列，15.64%的物種有來自中國的DNA條形碼序列。常見淡水昆蟲有2256種，只有26.81%在NCBI公共數(shù)據(jù)庫具有DNA條形碼序列和12.35%的物種有來自中國的DNA條形碼序列。常見淡水魚類1201種，57.20%在NCBI公共數(shù)據(jù)庫具有COIDNA條形碼序列和32.73%的物種有來自中國的DNA條形碼序列，相比其他類群略高（表2）。以上結(jié)果充分說明，我國本土物種DNA條形碼數(shù)據(jù)缺乏，尤其缺乏來自中國本土樣本的DNA條形碼序列。這導(dǎo)致采用環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)監(jiān)測水生生物多樣性時(shí)，將序列比對到公共數(shù)據(jù)庫，將導(dǎo)致大量本土物種無法被正確注釋。因此迫切需要在國內(nèi)繼續(xù)全面構(gòu)建淡水水生生物的DNA條形碼。表2我國本土水生生物DNA條形碼覆蓋現(xiàn)狀物種類群條形碼物種數(shù)目覆蓋率%（≥1）覆蓋率（≥5）來自中國的物種占比物種名錄來源條形碼數(shù)據(jù)來源藍(lán)藻16SrDNA4196[1]NCBIGenbank真核藻類18SrDNA166414.901.567.21[1]浮游動(dòng)物MtCOI65230.3617.3315.64[2-4]水生昆蟲MtCOI225626.8112.1412.35[5]軟體動(dòng)物MtCOI50551.0928.7143.26[5]魚類MtCOI120157.2034.3932.73[6]相關(guān)國際標(biāo)準(zhǔn)或國外先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)情況目前國際及國內(nèi)沒有發(fā)表的水生生物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)。但是存在少數(shù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。如國際標(biāo)準(zhǔn)《Soilquality—IdentificationofecotoxicologicaltestspeciesbyDNAbarcoding》（ISO21286:2019），該標(biāo)準(zhǔn)基于DNA條形碼識別土壤生態(tài)毒理測試物種，未涉及到水生生物。另外歐盟已公布的DNA條形碼相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)有3個(gè)，正在起草的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)有2個(gè)，分別為：（1）《Waterquality-Technicalreportforthemanagementofdiatombarcodes》（CEN/TR17244:2018），水質(zhì)-硅藻DNA條形碼管理技術(shù)報(bào)告，主要用于驗(yàn)證生態(tài)評估的硅藻條形碼所需的數(shù)據(jù)，并對DNA條形碼數(shù)據(jù)的存儲提供建議，以確保對該信息的訪問。（2）《Algaeandalgaeproducts-Identificationofthebiomassofmicroalgae,macroalgae,cyanobacteriaandLabyrinthulomycetes-Detectionandidentificationwithmorphologicaland/ormolecularmethods》（EN17477:2021），結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子方法檢測和識別微型藻、大型藻、藍(lán)藻和網(wǎng)粘菌綱物種。（3）《Foodstuffs-DNAbarcodingoffishandfishproductsusingdefinedmitochondrialcytochromebandcytochromecoxidaseIgenesegments》（CEN/TS17303:2019），食品-采用線粒體細(xì)胞色素b和細(xì)胞色素c氧化酶I對魚類和魚類相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)行基于DNA條形碼的物種鑒定。（4）《Foodauthenticity—DNAbarcodingofmeatandmeatproductsderivedfrommammaliaandpoultryusingdefinedmitochondrialcytochromebandcytochromecoxidaseIgenesegments》（起草中）。食品鑒定-使用線粒體細(xì)胞色素b和細(xì)胞色素c氧化酶I基因片段對哺乳動(dòng)物和家禽的肉類和肉制品進(jìn)行基于DNA條形碼的物種鑒定（5）《Foodauthenticity—DNAbarcodingofbivalvesandproductsderivedfrombivalvesusingadefinedmitochondrial16SrRNAgenesegment》（起草中）。食品鑒定-用線粒體16SrRNA基因片段對雙殼類及其產(chǎn)品進(jìn)行基于DNA條形碼的物種鑒定。這些標(biāo)準(zhǔn)針對某個(gè)/些特定類群，采用DNA條形碼進(jìn)行物種鑒定。其中（3）、（4）、（5）主要用于魚類、哺乳家禽類和雙殼類等特定食物來源的真?zhèn)舞b定，（1）和（2）用于基于DNA條形碼的藻類鑒定。但是目前國際上并沒有針對所有水生生物類群的DNA條形碼構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)。與國內(nèi)相關(guān)法律法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的協(xié)調(diào)關(guān)系目前國內(nèi)關(guān)于DNA條形碼數(shù)據(jù)具有兩個(gè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，分別為行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《林業(yè)DNA條形碼構(gòu)建技術(shù)規(guī)程》（LY/T3191）和《國境口岸醫(yī)學(xué)媒介昆蟲DNA條形碼鑒定操作規(guī)程》（SN/T4278）。但是在水生生物DNA條形碼方面，目前尚無已發(fā)布的國際標(biāo)準(zhǔn)或國家標(biāo)準(zhǔn)、地方標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)有工作基礎(chǔ)目前，編制組開展了大量構(gòu)建我國重點(diǎn)流域的本土物種DNA條形碼數(shù)據(jù)庫的相關(guān)工作，積累了大量的野外調(diào)查和DNA條形碼快速建庫的工作經(jīng)驗(yàn)，對于標(biāo)準(zhǔn)的合理可操作性提供了很好的保障。同時(shí)，整理收集了國外水生生物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫構(gòu)建成功的經(jīng)驗(yàn)案例，也為標(biāo)準(zhǔn)的編制提供了很好基礎(chǔ)支撐。3標(biāo)準(zhǔn)編制依據(jù)和原則編制目的規(guī)范水生生物DNA條形碼建庫工作，促進(jìn)DNA條形碼技術(shù)在我國水生生物鑒定體系中的應(yīng)用推廣，有助于全國水生生物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建，精準(zhǔn)記錄我國本土物種的基因、種群和群落特征，支撐未來生物多樣性保護(hù)和生態(tài)修復(fù)管理工作。編制原則本標(biāo)準(zhǔn)按照《中國環(huán)境科學(xué)學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)管理辦法（試行）》的要求和規(guī)定，確定標(biāo)準(zhǔn)的組成要素。在標(biāo)準(zhǔn)制定過程中遵循了以下幾個(gè)原則：（1）科學(xué)性和規(guī)范性；（2）保證標(biāo)準(zhǔn)的先進(jìn)性和實(shí)用性；（3）與相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)、法規(guī)接軌；（4）充分考慮我國水生生物群落特征和分布，結(jié)合現(xiàn)有DNA條形碼技術(shù)的發(fā)展水平，符合我國水生生物監(jiān)測行業(yè)規(guī)范化發(fā)展需求。4規(guī)范主要技術(shù)內(nèi)容和適用范圍標(biāo)準(zhǔn)適用范圍本文件規(guī)定了水生生物DNA條形碼構(gòu)建方法及質(zhì)量控制和安全管理要求。本文件適用于淡水生態(tài)系統(tǒng)中的浮游植物、浮游動(dòng)物、水生維管植物、大型底棲無脊椎動(dòng)物和魚類等生物類群的DNA條形碼構(gòu)建；其他生態(tài)系統(tǒng)生物DNA條形碼構(gòu)建可參照執(zhí)行?？傮w框架和主要內(nèi)容本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了水生生物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫的相關(guān)術(shù)語、構(gòu)建方法及質(zhì)量控制等。（1）范圍（2）規(guī)范性引用文件（3）術(shù)語和定義（4）試劑器材（5）DNA條形碼構(gòu)建方法（6）質(zhì)量控制和安全管理規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T30989高通量基因測序技術(shù)規(guī)程GB/T34265Sanger法測序技術(shù)指南GB/T35537高通量基因測序結(jié)果評價(jià)要求GB/T37874核酸提取純化方法評價(jià)通則HJ710.7生物多樣性觀測技術(shù)導(dǎo)則內(nèi)陸水域魚類HJ710.8生物多樣性觀測技術(shù)導(dǎo)則淡水底棲大型無脊椎動(dòng)物HJ710.12生物多樣性觀測技術(shù)導(dǎo)則水生維管植物HJ1216水質(zhì)浮游植物的測定0.1ml計(jì)數(shù)框-顯微鏡計(jì)數(shù)法SC/T9402淡水浮游生物調(diào)查技術(shù)規(guī)范LY/T3191林木DNA條形碼構(gòu)建技術(shù)規(guī)程SN/T4278國境口岸醫(yī)學(xué)媒介昆蟲DNA條形碼鑒定操作規(guī)程SN/T4835實(shí)驗(yàn)室生物廢棄物管理要求DB21/T2777海洋浮游微藻分離和篩選技術(shù)規(guī)程術(shù)語和定義（1）水生生物hydrobios全部或部分生活在各種水域中的生物。主要的淡水生物類群包括浮游植物、浮游動(dòng)物、水生維管植物、大型底棲無脊椎動(dòng)物和魚類等。2007年科學(xué)出版處出版的圖書《生態(tài)學(xué)名詞》中對“水生生物”的定義為“全部或部分生活在各種水域中的動(dòng)物和植物。包括淡水生物和海洋生物”。本文件主要適用于淡水水生生物。（2）引物primer在DNA復(fù)制過程中，結(jié)合于模板鏈上并作為復(fù)制延伸的起始位點(diǎn)和/或終止位點(diǎn)的，具有一定長度和順序的寡核苷酸鏈。[來源：GB/T34265—2017，3.4]（3）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PolymeraseChainReaction(PCR)一種體外酶促合成特異DNA片段的分子技術(shù)，由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便省時(shí)等特點(diǎn)。[來源：LY/T3191—2020，3.3，有修改]（4）Sanger測序sangersequencing用于基因測序的雙脫氧鏈末端終止法，在鏈延伸過程中利用熒光標(biāo)記雙脫氧堿基隨機(jī)阻斷，產(chǎn)生以A、T、C、G結(jié)束的四組不同長度的核苷酸鏈，通過讀取熒光信號實(shí)現(xiàn)對核酸堿基序列信息的讀取[來源：GB/T34265—2017，3.2，有修改]（5）高通量測序high-throughputsequencing這里指第二代測序技術(shù)。區(qū)別于傳統(tǒng)Sanger測序，二代測序技術(shù)是指能夠一次并行對大量核酸分子進(jìn)行平行序列測定的技術(shù)。[來源：GB/T30989—2014，3.19，有修改]（6）DNA條形碼DNAbarcode生物體細(xì)胞核或者細(xì)胞器中一段公認(rèn)的能夠代表該物種的標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增的短DNA序列，可用于實(shí)現(xiàn)生物的識別和鑒定。[來源：LY/T3191—2020，3.6，有修改]（7）遺傳距離geneticdistance通過遺傳標(biāo)記如DNA條形碼對種群或分類單元間遺傳相似性和進(jìn)化關(guān)系的測度。2007年科學(xué)出版處出版的圖書《生態(tài)學(xué)名詞》中對“遺傳距離”的定義為“通過遺傳標(biāo)記對種群或分類單元間遺傳相似性和進(jìn)化關(guān)系的測度”。2006年出版的《遺傳學(xué)名詞》（第二版）中定義為“一種用來估算兩個(gè)個(gè)體或群體之間基因差異的度量”。2020年公布的《畜牧學(xué)名詞》中定義為“一種用來度量群體間遺傳差異的指標(biāo)”。楊倩倩等ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>楊倩倩</Author><Year>2018</Year><RecNum>1650</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[13]</style></DisplayText><record><rec-number>1650</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vx5aa9zdrw2w2se2f5axza5tpvpvparzwsvz"timestamp="1637073355">1650</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">楊倩倩</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">劉蘇汶</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">俞曉平</style></author></authors></contributors><auth-address><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">中國計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院浙江省生物計(jì)量及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室</style><styleface="normal"font="default"size="100%">;</style></auth-address><titles><title><styleface="normal"font="default"size="100%">DNA</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">條形碼分析方法研究進(jìn)展</style></title><secondary-title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)</style></secondary-title></titles><periodical><full-title>應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)</full-title></periodical><pages>1006-1014</pages><volume>29</volume><number>03</number><keywords><keyword>DNA條形碼</keyword><keyword>分子鑒定</keyword><keyword>遺傳距離</keyword><keyword>遺傳相似度</keyword><keyword>系統(tǒng)發(fā)育樹</keyword><keyword>序列特征</keyword><keyword>統(tǒng)計(jì)分類</keyword></keywords><dates><year>2018</year></dates><isbn>1001-9332</isbn><call-num>21-1253/Q</call-num><urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[13]定義遺傳距離分析法是基于生物體親緣關(guān)系遠(yuǎn)近，計(jì)算DNA條形碼序列的遺傳距離，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)物種鑒定的方法。在一定的范圍內(nèi)，物種間親緣關(guān)系越近，遺傳距離越小；反之，親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，遺傳距離越大。本文件中主要通過DNA條形碼的序列差異來計(jì)算不同樣本之間的遺傳距離。（8）16S核糖體DNA16SribosomalDNA(16SrDNA)原核生物編碼核糖體小亞基16SrRNA的DNA序列。（9）18S核糖體DNA18SribosomalDNA(18SrDNA)真核生物編碼核糖體小亞基18SrRNA的DNA序列。（10）線粒體12S核糖體DNAmitochondrial12SribosomalDNA(Mt12SrDNA)后生動(dòng)物線粒體基因組上12SrRNA對應(yīng)的DNA序列。（11）線粒體細(xì)胞色素c氧化酶ImitochondrialcytochromecoxidaseI(COI)后生動(dòng)物線粒體基因組上的線粒體細(xì)胞色素c氧化酶I對應(yīng)的DNA序列。（12）憑證標(biāo)本voucherspecimen獲取DNA條形碼等分子數(shù)據(jù)的來源標(biāo)本?？梢允菢?biāo)本的一部分組織，也可以是同一批同種標(biāo)本中的一個(gè)個(gè)體，但必須與本標(biāo)本的DNA條形碼數(shù)據(jù)等分子憑證是一一對應(yīng)的關(guān)系。憑證標(biāo)本必須有唯一性的標(biāo)本編號和存放信息，便于日后查證。試劑器材試劑和材料（1）標(biāo)準(zhǔn)采樣瓶（2）1.5mL離心管：無DNA和生物殘留（3）組織基因組DNA提取試劑或試劑盒（4）PCR擴(kuò)增試劑（5）PCR擴(kuò)增引物（6）凝膠回收試劑盒（7）DNA濃度測定試劑（8）凝膠電泳相關(guān)試劑（9）分子量標(biāo)準(zhǔn)品（最小片段≥50bp）（10）測序平臺相關(guān)試劑和材料（11）無菌雙蒸水（12）通用無菌手套（13）培養(yǎng)基儀器與設(shè)備（1）冰箱：溫度調(diào)節(jié)范圍為-20℃~4℃。（2）豎式采水器（3）底棲動(dòng)物捕捉及清洗裝置（4）浮游生物網(wǎng)（5）PCR儀（6）凝膠成像儀（7）電泳儀（8）離心機(jī)（9）組織研磨器（10）渦旋混勻儀（11）測序儀（12）天平：分度值0.1mg（13）微量移液器：0.5μL~10μL，10μL~100μL，20μL~200μL，100μL~1000μLDNA條形碼構(gòu)建方法水生生物DNA條形碼構(gòu)建流程主要包括：物種鑒定、條形碼擴(kuò)增與測序、條形碼評估和物種條形碼入庫等過程（圖2）。圖2水生生物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫構(gòu)建基本流程物種鑒定浮游植物的定性樣品采集、保存與鑒定按照HJ1216的規(guī)定執(zhí)行，浮游植物的分離培養(yǎng)按照DB21/T2777的規(guī)定執(zhí)行。常用的培養(yǎng)基見附錄B。浮游動(dòng)物的定性樣品采集與鑒定按照SC/T9402的規(guī)定執(zhí)行，加乙醇溶液固定（乙醇濃度≥90%），常溫保存。水生維管植物的定性樣品采集與鑒定按照HJ710.12的規(guī)定執(zhí)行，野外干冰或-20℃保存，實(shí)驗(yàn)室-20℃保存。大型底棲無脊椎動(dòng)物的定性樣品采集與鑒定按照HJ710.8的規(guī)定執(zhí)行，加乙醇溶液固定（乙醇濃度≥90%），常溫保存。魚類樣品采集與鑒定按照HJ710.7的規(guī)定執(zhí)行，野外干冰或-20℃保存，實(shí)驗(yàn)室-20℃保存。形態(tài)學(xué)鑒定建議由具有豐富鑒定經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)人員完成，并保留憑證標(biāo)本。參考附錄A詳實(shí)記錄樣品采集信息，形態(tài)學(xué)鑒定建議由具有豐富鑒定經(jīng)驗(yàn)的分類學(xué)家完成，鑒定完成后保留憑證標(biāo)本。關(guān)于浮游植物的定性樣本采集、保存與鑒定，生態(tài)環(huán)境部發(fā)布的《水質(zhì)浮游植物的測定0.1ml計(jì)數(shù)框-顯微鏡計(jì)數(shù)法》（HJ1216）中規(guī)定使用25號浮游生物網(wǎng)采集定性樣品，采集后立即加入魯哥氏液，在室溫避光保存。關(guān)于浮游動(dòng)物的定性樣本采集，農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《淡水浮游生物調(diào)查技術(shù)規(guī)范》(SCT9402-2010)中規(guī)定，枝角類和橈足類等大型浮游動(dòng)物的定性樣品應(yīng)用13號浮游動(dòng)物網(wǎng)采集。立即加入體積分?jǐn)?shù)為40%的甲醛溶液，用量為水樣體積的4%。原生動(dòng)物和輪蟲定性樣品則用25號浮游生物網(wǎng)收集，用魯哥氏液固定，用量為水樣體積的1.0%~1.5%，若需長時(shí)間保存，則加入40%的甲醛溶液。條形碼擴(kuò)增與測序DNA提取和濃度及純度測定（1）DNA提取選取完整個(gè)體或合適部位的組織提取DNA，避免外源污染。植物和動(dòng)物組織DNA的提取分別參考LY/T3191和SN/T4278。根據(jù)《高通量基因測序樣本預(yù)處理方法第1部分：動(dòng)物組織樣本預(yù)處理》（GB/T33681.1）中對于核酸提取的定義，核酸提取是用物理、化學(xué)或生物酶的方法，釋放動(dòng)物組織樣本中的核酸并對它進(jìn)行純化，充分去除動(dòng)物組織樣本中的蛋白質(zhì)、脂類等PCR抑制劑以及提取核酸時(shí)加入的試劑，保證核酸的質(zhì)量和濃度的穩(wěn)定，以能滿足下游實(shí)驗(yàn)要求。目前DNA提取方法有酚氯仿提取法、濃鹽法、水抽提法、陰離子去污劑法（CTAB法）、離心柱法和磁珠法等。在行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《林木DNA條形碼構(gòu)建技術(shù)規(guī)程》（LY/T3191）中推薦的植物DNA提取方法主要包括CTAB法和試劑盒法。行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《國境口岸醫(yī)學(xué)媒介昆蟲DNA條形碼鑒定操作規(guī)程》（SN/T4278）中采用的動(dòng)物DNA提取方法為酚氯仿法或試劑盒DNA提取方法?，F(xiàn)在試劑盒的DNA提取方法主要為離心柱法和磁珠法。（2）DNA濃度及純度測定按GB/T37874的規(guī)定評價(jià)提取的DNA濃度和純度，一般要求濃度不低于1ng/μL，在260nm和280nm波長處的吸光度值比值（OD260nm/OD280nm）應(yīng)在1.7~1.9范圍內(nèi)。有效的DNA樣品分裝為兩份，一份在-80℃長期保存，另一份保存在-20℃用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，避免反復(fù)凍融。根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)《核酸提取純化方法評價(jià)通則》（GB/T37874），若OD260nm/OD280nm值低于1.7，說明提取的DNA中有蛋白質(zhì)、多酚等雜質(zhì)污染；若OD260nm/OD280nm值高于1.9，說明提取的DNA可能有RNA污染。若OD260nm/OD230nm值小于2.0，表明有殘存的鹽或其他分子雜質(zhì)。（3）DNA保存所有提取出的DNA，經(jīng)過濃度和質(zhì)量檢測之后，一部分保存在-20℃冰箱中用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，一部分放置在-80℃冰箱用于長期保存?zhèn)溆?。條形碼擴(kuò)增與檢測（1）條形碼擴(kuò)增針對不同生物類群選擇引物擴(kuò)增目標(biāo)DNA條形碼序列，常用PCR擴(kuò)增引物和擴(kuò)增反應(yīng)條件見附錄C。根據(jù)國家林業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《林木DNA條形碼構(gòu)建技術(shù)規(guī)程》（LY/T3191—2020）和已有的文獻(xiàn)匯總，核心DNA條形碼片段選取需要考慮多方面因素：①進(jìn)化速率。進(jìn)化速率較慢的片段可以錨定目標(biāo)物種到科/屬的較高分類等級，進(jìn)化速率較快的片段則可將近緣類群進(jìn)行識別和分辨。②分辨能力。種間有明顯的遺傳變異，而種內(nèi)變異足夠?。▓D3）；片段所含的變異位點(diǎn)多則分辨力高，進(jìn)化速率較快的片段比進(jìn)化速率較慢的片段有更高分辨力。③片段長度。足夠短，減少測序工作，且便于DNA提取和PCR擴(kuò)增，尤其是對存在DNA降解的材料(如：保存已久的臘葉標(biāo)本、處理過的民間藥材)；降低測序費(fèi)用；不同物種間序列長度變異盡可能小。④片段通用性。存在保守區(qū)域，便于設(shè)計(jì)通用引物。也可以從已發(fā)表的基因組、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選合適的DNA片段作為特定物種的條形碼。⑤目標(biāo)DNA片段還需要在公共數(shù)據(jù)庫中具有足夠的序列信息，以便在獲得DNA序列后，進(jìn)行序列比對和人工矯正。圖3DNA條形碼片段示意圖（引自Bucklinetal.2011,Annu.Rev.Mar.Sci.）ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Bucklin</Author><Year>2011</Year><RecNum>1657</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[14]</style></DisplayText><record><rec-number>1657</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vx5aa9zdrw2w2se2f5axza5tpvpvparzwsvz"timestamp="1637074291">1657</key></foreign-keys><ref-typename="BookSection">5</ref-type><contributors><authors><author>Bucklin,Ann</author><author>Steinke,Dirk</author><author>Blanco-Bercial,Leocadio</author></authors><secondary-authors><author>Carlson,C.A.</author><author>Giovannoni,S.J.</author></secondary-authors></contributors><titles><title>DNABarcodingofMarineMetazoa</title><secondary-title>AnnualReviewofMarineScience,Vol3</secondary-title><tertiary-title>AnnualReviewofMarineScience</tertiary-title></titles><pages>471-508</pages><volume>3</volume><dates><year>2011</year></dates><isbn>978-0-8243-4503-7</isbn><accession-num>WOS:000286638700018</accession-num><urls><related-urls><url><GotoISI>://WOS:000286638700018</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1146/annurev-marine-120308-080950</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[14]藍(lán)色代表種內(nèi)差異，橙色代表種間差異。A.種間差異明顯大于種內(nèi)差異，可作為候選DNA條形碼片段。B.種內(nèi)和種間遺傳距離存在交叉，不符合DNA條形碼要求。生物體的DNA存在與細(xì)胞核和部分細(xì)胞器/細(xì)胞質(zhì)中。核基因組是生物個(gè)體中主要的DNA儲存?zhèn)}，而細(xì)胞器基因組包括線粒體基因組（MtDNA）和質(zhì)體基因組，后者包括葉綠體基因組（CpDNA）。它們都位于細(xì)胞核外。細(xì)胞器DNA通常以超螺旋環(huán)狀雙鏈DNA的形式存在，它們比核基因組小的多，但數(shù)量可觀（人類細(xì)胞一般包含1000~10000個(gè)線粒體）。因此在環(huán)境中細(xì)胞器基因組比核基因組更易獲得。動(dòng)物線粒體基因組基因排列較為保守，易于操作，突變率較高但一般不會發(fā)生重組，因此是理想的DNA條形碼候選區(qū)。但植物線粒體的容易發(fā)生基因重排和重復(fù)，且核苷酸替換上進(jìn)化緩慢，不是優(yōu)選的植物條形碼區(qū)域。植物葉綠體基因組大部分結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定的，且替換率比植物線粒體基因組高的多（高等植物中高接近3倍），可以作為植物的DNA條形碼區(qū)域。選擇DNA條形碼需要綜合考慮不同條形碼區(qū)域?qū)δ繕?biāo)類群的覆蓋度和區(qū)分度。目前浮游植物常用的DNA條形碼序列包括核基因的16SrDNA（藍(lán)藻門），18SrDNA（真核藻類）、28SrDNA（真核藻類）、ITS（轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，Internaltranscribedspacer）、葉綠體rbcL（Rubisco大亞基，Ribulose-1，5-biphosphatecarboxylase）和matK（成熟酶k，MaturaseK）等（表3）ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[15,16]。其中18SrDNA基因具有更高的物種覆蓋率及較為完善的條形碼數(shù)據(jù)庫，已被廣泛應(yīng)用于監(jiān)測海洋和淡水真核藻類的組成結(jié)構(gòu)ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>張麗娟</Author><Year>2021</Year><RecNum>1660</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[17]</style></DisplayText><record><rec-number>1660</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vx5aa9zdrw2w2se2f5axza5tpvpvparzwsvz"timestamp="1637074749">1660</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>張麗娟</author><author>徐杉</author><author>趙崢</author><author>周小華</author><author>馮慶</author><author>楊江華</author><author>李飛龍</author><author>王志浩</author><author>張效偉</author></authors></contributors><auth-address>南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院污染控制與資源化國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;昆明學(xué)院昆明滇池(湖泊)污染防治合作研究中心;昆明市河湖生態(tài)健康評估與修復(fù)院士工作站;</auth-address><titles><title>環(huán)境DNA宏條形碼監(jiān)測湖泊真核浮游植物的精準(zhǔn)性</title><secondary-title>環(huán)境科學(xué)</secondary-title></titles><periodical><full-title>環(huán)境科學(xué)</full-title></periodical><pages>796-807</pages><volume>42</volume><number>02</number><keywords><keyword>環(huán)境DNA(eDNA)</keyword><keyword>宏條形碼</keyword><keyword>真核浮游植物</keyword><keyword>生物多樣性</keyword><keyword>精確性</keyword></keywords><dates><year>2021</year></dates><isbn>0250-3301</isbn><call-num>11-1895/X</call-num><urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[17]。16SrDNA基因是藍(lán)藻門等微生物中最為常用的DNA條形碼。表3常用的浮游植物DNA條形碼比較ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[15]條形碼基因組優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)18SrDNA核基因組進(jìn)化速率適中，易擴(kuò)增，最常用，數(shù)據(jù)庫全種水平區(qū)分能力一般，只適用于真核藻類16SrDNA核基因組進(jìn)化速率適中，易擴(kuò)增，最常用，數(shù)據(jù)庫全種水平區(qū)分能力一般，只適用于藍(lán)藻門ITS核基因組分辨水平高，片段短，易于擴(kuò)增和測序長度變異大RbcL葉綠體基因組容易擴(kuò)增，鑒別到科屬水平能力高進(jìn)化緩慢；種水平區(qū)分能力一般，全序列測序需要四對引物matK葉綠體基因組進(jìn)化速率快，長度適中，種間差異明顯，轉(zhuǎn)化速率低現(xiàn)有的引物很難實(shí)現(xiàn)普遍擴(kuò)增，不同類群鑒別時(shí)所選用的引物對也不盡相同表4常用的浮游植物DNA條形碼信息靶向類群基因名稱引物名稱引物序列（5’-3’）長度（bp）參考文獻(xiàn)藍(lán)藻門16SrDNA16S-27FAGAGTTTGATCCTGGCTCAG1400-1600ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Lane</Author><Year>1991</Year><RecNum>1713</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[18]</style></DisplayText><record><rec-number>1713</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vx5aa9zdrw2w2se2f5axza5tpvpvparzwsvz"timestamp="1637159291">1713</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Lane,D.J.</author></authors></contributors><titles><title>16S/23SrRNAsequencing</title><secondary-title>Nucleicacidtechniquesinbacterialsystematics</secondary-title></titles><periodical><full-title>Nucleicacidtechniquesinbacterialsystematics</full-title></periodical><dates><year>1991</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[18]16S-1492RRGMAACCTTGTACGACTT16S_V3_V416S-338FACTCCTACGGGAGGCAGCAG400-500ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Li</Author><Year>2019</Year><RecNum>1715</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[19]</style></DisplayText><record><rec-number>1715</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vx5aa9zdrw2w2se2f5axza5tpvpvparzwsvz"timestamp="1637159997">1715</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Li,XiaoChuang</author><author>Huo,Shouliang</author><author>Zhang,Jingtian</author><author>Ma,Chunzi</author><author>Xiao,Zhe</author><author>Zhang,Hanxiao</author><author>Xi,Beidou</author><author>Xia,Xinghui</author></authors></contributors><titles><title>Metabarcodingrevealsamorecomplexcyanobacterialcommunitythanmorphologicalidentification</title><secondary-title>EcologicalIndicators</secondary-title></titles><periodical><full-title>EcologicalIndicators</full-title></periodical><pages>105653</pages><volume>107</volume><keywords><keyword>Database</keyword><keyword>Diversity</keyword><keyword>Metabarcoding</keyword><keyword>Morphology</keyword><keyword>Taxonomy</keyword></keywords><dates><year>2019</year><pub-dates><date>2019/12/01/</date></pub-dates></dates><isbn>1470-160X</isbn><urls><related-urls><url>/science/article/pii/S1470