病毒的檢測(cè)方法病毒性疾病的臨床診斷主要是利用建立在抗原和抗體特異性反應(yīng)基礎(chǔ)上的免疫學(xué)方法，這些方法或者是以已知抗原來(lái)檢測(cè)抗體，或者是以已知抗體來(lái)檢測(cè)抗原，免疫學(xué)方法所進(jìn)行的病毒診斷準(zhǔn)確、靈敏、快速、簡(jiǎn)便、成本低。用于病毒學(xué)的免疫學(xué)方法免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)原理病毒中和抗體中和病毒的感染性，CPE抑制，蝕斑減數(shù)或動(dòng)物被保護(hù)血凝抑制抗體抑制病毒的血細(xì)胞凝集作用酶免疫試驗(yàn)酶標(biāo)記抗原(或抗體)與抗體(或抗原)結(jié)合底物改變顏色放射免疫測(cè)定放射性標(biāo)記的抗體(或抗原)與抗原(或抗體)結(jié)合，放射性同位素計(jì)數(shù)器或放射自顯影檢查免疫熒光熒光素標(biāo)記的抗體與細(xì)胞內(nèi)抗原結(jié)合用熒光或紫外顯微鏡檢查免疫過(guò)氧化物酶染色過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體與細(xì)胞內(nèi)抗原結(jié)合；在底物作用下，產(chǎn)生有色的沉淀物免疫電鏡抗體聚集的病毒體在電鏡下可見(jiàn)免疫膠體金膠體金標(biāo)記的鏈酶親和素與DNA上的生物素特異性結(jié)合，通過(guò)信號(hào)放大，直接目視化檢測(cè)病毒種類(lèi)免疫毛細(xì)管區(qū)帶電泳空毛細(xì)管兩端加一個(gè)外加電壓，通過(guò)電泳遷移和電滲流的作用，樣品中的不同組分由于遷移率的不同而分開(kāi)免疫PCR用抗體來(lái)捕獲抗原，提取核酸后，再用PCR擴(kuò)增DNA片段，從而放大抗原抗體反應(yīng)快速免疫濾紙測(cè)定法把待測(cè)病毒的抗體吸附在乳膠顆粒上，通過(guò)大顆粒乳膠間接反應(yīng)小顆粒病毒的存在補(bǔ)體結(jié)合抗原-抗體復(fù)合物與補(bǔ)體結(jié)合，使得對(duì)溶血素敏感的綿羊紅血球細(xì)胞不再溶血免疫粘連血凝抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合凝集紅血球細(xì)胞的C3免疫雙擴(kuò)散抗體與抗原在凝膠中產(chǎn)生可見(jiàn)的沉淀線單向擴(kuò)散抗體從孔中擴(kuò)散，與凝膠中的抗原形成沉淀帶單向溶血抗體擴(kuò)散到凝膠中，加入的補(bǔ)體溶解吸附有病毒的紅血球細(xì)胞反向被動(dòng)血凝抗原凝集被抗體致敏的紅血球細(xì)胞乳膠凝集抗體凝集結(jié)合有抗原的乳膠顆粒1.

血凝抑制試驗(yàn)血凝抑制試驗(yàn)是于有血細(xì)胞凝集活性的病毒懸液中，加入特異性的病毒抗菌素血清，再加入適宜種類(lèi)運(yùn)動(dòng)的紅血球細(xì)胞，并在適宜溫度和pH條件下孵育。由于特異性的病毒抗體與病毒的有血細(xì)胞凝集活性的表面蛋白質(zhì)（如流感病毒的血凝素），可抑制血細(xì)胞凝集反應(yīng)發(fā)生，這是血凝抑制（HemagglutinationInhibition）現(xiàn)象。利用這一現(xiàn)象所設(shè)計(jì)的血凝抑制試驗(yàn)是鑒定血細(xì)胞凝集性病毒的常用方法。這種方法靈敏，除披膜病毒（Togavirus）以外，對(duì)于其它的病毒都有很高的特異性，而且方法簡(jiǎn)單、迅速、實(shí)驗(yàn)成本低。在試驗(yàn)時(shí)，抗血清必須經(jīng)56℃、30分鐘預(yù)處理，以除去非特異性抑制物。2.

中和試驗(yàn)中和試驗(yàn)是病毒免疫學(xué)中一個(gè)非常重要的試驗(yàn)。在病毒的中和作用（neutralization）性質(zhì)上建立，即某些特異性的病毒抗體與病毒作用后，能夠使其失去感染性，抑制病毒的繁殖。這類(lèi)病毒抗體叫作中和抗體（neutralizingAbs）。病毒的中和作用不但表現(xiàn)在質(zhì)的方面，即一種病毒的感染性只能被特異性的抗體中和，而且還表現(xiàn)在量的方面，即中和一定量病毒的感染性必須有一定效價(jià)的病毒抗血清。中和試驗(yàn)仍是以測(cè)定病毒感染性的方法進(jìn)行，因此又有不同的方法。3．補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（Complementfixationassay）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)可用于檢測(cè)血清中病毒抗體的存在。補(bǔ)體的作用為能與抗原—抗體復(fù)合物結(jié)合，但不能與抗原單獨(dú)結(jié)合，也不易與抗體單獨(dú)結(jié)合；補(bǔ)體的作用沒(méi)有特異性，能與任何一組抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，它也能與紅細(xì)胞和溶血素的復(fù)合物結(jié)合，引起紅細(xì)胞破壞（溶血）。病毒抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后，其抗原抗體復(fù)合物可以結(jié)合補(bǔ)體，如再加入紅細(xì)胞和溶血素，則不會(huì)產(chǎn)生溶血現(xiàn)象；若血清中無(wú)病毒抗體，補(bǔ)體與紅細(xì)胞結(jié)合則會(huì)引起溶血。此反應(yīng)即為補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)。補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)操作繁雜，且需十分細(xì)致，反應(yīng)的各個(gè)因子的量必須有恰當(dāng)?shù)谋壤?.

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定是一種采用固相（主要為聚苯乙烯酶聯(lián)板）吸附，將免疫反應(yīng)和酶的高效催化反應(yīng)有機(jī)結(jié)合的方法，其基本原理是以酶催化的顏色反應(yīng)指示抗原抗體的結(jié)合。ELISA

方法簡(jiǎn)單，靈敏度高，特異性強(qiáng)，適于大量樣品的檢測(cè)，目前該方法已被廣泛用于植物病毒檢測(cè)。在此基礎(chǔ)上加以改進(jìn)又發(fā)展了一些新的檢測(cè)方法，如A

蛋白酶聯(lián)吸附（SPA-ELISA）、斑點(diǎn)免疫吸附（DIBA）、直接組織斑免疫測(cè)定（IDDTB）、伏安酶聯(lián)免疫分析、快速ELISA

等。5.免疫沉淀(Immunoprecipation)和免疫印跡(Immunoblotting)免疫沉淀反應(yīng)主要用于抗原或者抗體的定性檢測(cè)。其原理是指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在有電解質(zhì)存在的情況下，按適當(dāng)比例所形成的可見(jiàn)沉淀物現(xiàn)象。據(jù)此現(xiàn)象設(shè)計(jì)的沉淀實(shí)驗(yàn)主要包括絮狀沉淀試驗(yàn)，環(huán)狀沉淀試驗(yàn)和凝膠內(nèi)的沉淀試驗(yàn)。凝膠內(nèi)的沉淀試驗(yàn)依所用的實(shí)驗(yàn)方法又可分為免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)和免疫電泳技術(shù)2類(lèi)。免疫印跡(Immunoblotting)又稱蛋白質(zhì)印跡(Westernblotting)，是一種借助特異性抗體鑒定抗原的有效方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測(cè)定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新的免疫生化技術(shù)。將含有目標(biāo)蛋白(抗原)的樣品首先用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)或非變性電泳(Native)等分離后，通過(guò)轉(zhuǎn)移電泳原位轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜或其它膜的表面，然后將膜表面的蛋白質(zhì)再用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行特異性檢測(cè)。例如，將經(jīng)SDS分離的蛋白質(zhì)帶轉(zhuǎn)移到膜上后，膜用封閉液處理，然后與第一抗體反應(yīng)，膜經(jīng)漂洗后再與偶有辣根過(guò)氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)的第二抗體反應(yīng)，加人生色底物反應(yīng)之后，即可顯示出目標(biāo)蛋白的位置。由于免疫印跡具有SDS的高分辨力和固相免疫測(cè)定的高特異性和敏感性，其優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)便、標(biāo)本可長(zhǎng)期保存、結(jié)果便于比較。6.

免疫膠體金技術(shù)（Immunogold-labelassay）免疫膠體金技術(shù)最早起源于電鏡方面的研究，由于金在生物學(xué)上是惰性的，且有良好的電荷分布，可以和蛋白質(zhì)（如抗體、A

蛋白等）緊密結(jié)合，因此廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和微生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。其原理是用檸蒙酸鈉將氯金酸金離子還原為膠體金。膠體金顆粒在適當(dāng)?shù)臈l件下，以靜電、非共價(jià)鍵方式吸附抗體IgG（或A

蛋白）分子，從而形成穩(wěn)定的IgG（或A

蛋白）-

膠體金復(fù)合物。通過(guò)抗原抗體特異性結(jié)合，抗體（或A

蛋白）膠體金復(fù)合物就可以結(jié)合在抗原上。金顆粒吸附在病毒粒體周?chē)瑥亩玫矫黠@的鑒別性和可見(jiàn)度。免疫金-銀染色技術(shù)（Immunogold-silverstaining），也稱作金標(biāo)銀染技術(shù)（GoldLabelSilverStain,GLSS）。其基本原理是標(biāo)記有納米金顆粒的鏈霉親和素與靶分子上的生物素特異性結(jié)合，再以銀顆粒包裹在納米金周?chē)瑥亩鴮?shí)現(xiàn)目視化檢測(cè)。由于金標(biāo)銀染技術(shù)具有方便，快捷，經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，因此是一項(xiàng)非常有前景的病毒檢測(cè)技術(shù)。20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的斑點(diǎn)免疫金滲濾試驗(yàn)（Gotimmunogoldfitrationassay）是一種快速免疫膠體金診斷技術(shù)，該技術(shù)以硝酸纖維素膜為載體，利用微孔濾膜的滲濾濃縮和毛細(xì)管作用，使抗體抗原反應(yīng)和洗滌在一特殊的滲濾裝置中迅速完成，從而大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。在此基礎(chǔ)上，又建立了更為簡(jiǎn)易快速的膠體金免疫層析試驗(yàn)（Goldimmunochromatographyassay），該技術(shù)以硝酸纖維素膜為載體，利用微孔膜的毛細(xì)管作用，使滴加在膜條一端的液體慢慢向另一端滲透移動(dòng)，在移動(dòng)的過(guò)程中，抗體抗原發(fā)生反應(yīng)，并通過(guò)免疫金的顏色顯示出來(lái)。上述兩種快速檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速、直接，不需要酶促反應(yīng)底物，除試劑外不需任何特殊儀器設(shè)備，特別適于田間快速診斷和口岸檢疫。但不能準(zhǔn)確定量，靈敏度與酶聯(lián)免疫相當(dāng)。7.

快速免疫濾紙測(cè)定法（Rapidimmuno-filterpaperassay，RIPA）快速免疫濾紙測(cè)定類(lèi)似乳膠凝集反應(yīng)，其原理是把待測(cè)病毒的抗體吸附在乳膠顆粒上，通過(guò)大顆粒乳膠間接反應(yīng)小顆粒病毒的存在。所不同的是RIPA使用了一種紅色乳膠，從而使檢測(cè)更加簡(jiǎn)單和直觀。RIPA目測(cè)檢測(cè)提純TMV的靈敏度分別可達(dá)5ng/ml～50ng/ml。8.免疫毛細(xì)管區(qū)帶電泳（Immuno-capillaryzoneelectrophoresis，I-CZE）毛細(xì)管區(qū)帶電泳是在裝有一種電解液的空毛細(xì)管兩端加一個(gè)外加電壓，在外加電壓作用下，通過(guò)電泳遷移和電滲流的作用，樣品中的不同組分由于遷移率的不同而分開(kāi)。I-CZE將血清學(xué)反應(yīng)專化性和毛細(xì)管區(qū)帶電泳靈敏、快速、可自動(dòng)檢測(cè)的特點(diǎn)結(jié)合起來(lái)，實(shí)時(shí)檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合體。I-CZE靈敏度高，且可快速分析多個(gè)樣品，因而在無(wú)病毒苗木檢測(cè)、抗病品種選育、植物檢疫、種質(zhì)篩選等方面可發(fā)揮巨大作用，有廣闊的應(yīng)用前景。9.

免疫PCR

（Immuno-PCR

）近年來(lái)出現(xiàn)的免疫PCR

是一種將抗原抗體反應(yīng)的高特異性與PCR

的高靈敏度有機(jī)結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)，與酶聯(lián)檢測(cè)技術(shù)相比，免疫PCR

是先用抗體來(lái)捕獲抗原，提取核酸后，再用PCR擴(kuò)增DNA片段，從而放大抗原抗體反應(yīng)，大大提高了檢測(cè)靈敏度。10.

固相放射免疫測(cè)定

(solid-phaseradioimmunoassay,SPRIA)標(biāo)記抗原和非標(biāo)記抗原對(duì)特異性抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，由于標(biāo)記抗原和非特異抗體是固定的，所以標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物形成的量隨非標(biāo)記抗原的量而改變。非標(biāo)記抗原量增加，標(biāo)記抗原體復(fù)合物相應(yīng)減少，游離的標(biāo)記抗原相應(yīng)增加，即受檢標(biāo)本中抗原濃度與抗原-抗體中的放射性強(qiáng)度呈反比。測(cè)定其放射性即可推算出未知抗原的量。其優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確度好。但存在著放射性損傷的危險(xiǎn)。如此諸多的免疫學(xué)方法在病毒鑒定中主要用于兩個(gè)方面的工作：第一，將待鑒定的病毒與已知病毒的抗血清，或者是待鑒定病毒的抗血清學(xué)試驗(yàn)，對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)鑒定；第二，在病毒性疾病的臨床診斷中，將所分離到的病毒與患病宿主的急性期和恢復(fù)期的雙份血清分別進(jìn)行血凝抑制、酶聯(lián)免疫吸附等免疫學(xué)試驗(yàn)，若恢復(fù)期的病毒抗體效價(jià)較急性期有4倍增高，可基本確認(rèn)這種病毒是引起疾病的病原病毒。如果病毒已經(jīng)鑒定，更可明確疾病的性質(zhì)。除了這些免疫學(xué)方法外，已有一些分子生物學(xué)技術(shù)用于病毒的臨床診斷：（1）多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）是一種在體外高效擴(kuò)增特異性DNA的方法。其原理是用一對(duì)與雙鏈DNA互補(bǔ)的人工合成寡核苷酸作引物，使靶DNA在試管內(nèi)特異地反復(fù)復(fù)制，直到能夠用標(biāo)準(zhǔn)的核酸雜交方法檢測(cè)出來(lái)。此復(fù)制過(guò)程可導(dǎo)致靶DNA上百萬(wàn)倍擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的由兩個(gè)引物與DNA模板結(jié)合部位之間的距離決定。其方法是靶DNA首先在90~95℃加熱變性，冷卻至37~50℃退火，使引物與靶DNA的特異序列互補(bǔ)配對(duì)，在67~70℃由大腸桿菌Taq聚合酶進(jìn)行每一條鏈的復(fù)制。新合成的DNA鏈含引物的互補(bǔ)序列，可作為下一輪聚合反應(yīng)的模板。如此變性、退火、聚合，在溫度91、50、67℃調(diào)節(jié)下反復(fù)進(jìn)行，使靶DNA大量擴(kuò)增，擴(kuò)增的DNA拷貝數(shù)（Y）、放大效率（X）和循環(huán)次數(shù)（n）有以下關(guān)系：Y=（1+X）n。由于多聚酶鏈反應(yīng)能夠直接高效擴(kuò)增核酸，所以即使只要有極微量的病毒核酸存在，經(jīng)擴(kuò)增后都可以方便地檢出，對(duì)其進(jìn)行克隆和序列測(cè)定，或以其它方法進(jìn)行分析。通過(guò)選擇特異性的寡核苷酸引物，也可以確定病毒的類(lèi)型。原則上，只要有一個(gè)病毒基因存在，就可以利用這一技術(shù)檢測(cè)出來(lái)，故大大提高了病毒檢測(cè)方法的靈敏性。第一例人免疫缺陷病毒2型（HIV-2）就是用這種方法發(fā)現(xiàn)的。對(duì)于DNA病毒可以直接進(jìn)行擴(kuò)增，而對(duì)于大多數(shù)的RNA病毒，則需先將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，此方法稱RT-PCR（Reversetranscription-PCR）。用PCR檢測(cè)植物病毒所需時(shí)間短，靈敏度特別高。近年來(lái)，在此基礎(chǔ)上又發(fā)展了多種方法用于植物病毒檢測(cè)。如復(fù)合PT-PCR是在同一RT-PCR反應(yīng)體系中用幾對(duì)不同的引物同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目的片段；PCR-ELISA是用ELISA代替瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，靈敏度高。（2）分子信標(biāo)（Molecularbeacon）分子信標(biāo)是具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的一段單鏈核酸分子，5'-端和3'-端序列互補(bǔ)形成“莖”，與目標(biāo)序列互補(bǔ)的探針序列為“環(huán)”，在5'-端連接熒光組分，3'-端連接猝滅組分。反應(yīng)開(kāi)始時(shí)先將反應(yīng)液加熱到80℃，這時(shí)分子信標(biāo)變性，無(wú)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，不管有無(wú)目標(biāo)序列均有熒光。當(dāng)溫度逐漸降到20℃時(shí)，連續(xù)檢測(cè)其熒光強(qiáng)度。如果反應(yīng)中產(chǎn)生與分子信標(biāo)互補(bǔ)的目標(biāo)序列，當(dāng)溫度降到解鏈溫度時(shí)，分子信標(biāo)和目標(biāo)序列雜交，熒光部分從猝滅部分移開(kāi)，從而發(fā)出熒光。如果反應(yīng)中沒(méi)有目標(biāo)序列，分子信標(biāo)的兩臂相遇形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，不會(huì)產(chǎn)生熒光。由于只有與互補(bǔ)序列雜交后分子信標(biāo)才發(fā)出熒光，未雜交的信標(biāo)不發(fā)熒光，因此不需要從反應(yīng)混合物中除去未雜交的分子信標(biāo)，可實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，靈敏度高。（3）實(shí)時(shí)定量PCR（Real-timeQuantitativePCR）實(shí)時(shí)定量PCR

是將RT-PCR

和熒光檢測(cè)相結(jié)合，利用TaqDNA

聚合酶的5'-端核酸酶活性來(lái)切割在擴(kuò)增過(guò)程中與目標(biāo)序列退火的熒光探針。探針-端連接熒光組分，3'-端連接猝滅組分，當(dāng)探針完整時(shí)，無(wú)熒光出現(xiàn)。在PCR過(guò)程中，熒光探針?；缘嘏c兩引物擴(kuò)增產(chǎn)物間的一段序列退火后被TaqDNA聚合酶切割，熒光組分與猝滅組分分開(kāi)，產(chǎn)生熒光信號(hào)，熒光信號(hào)的強(qiáng)度與目標(biāo)序列濃度或拷貝數(shù)成比例。在每一循環(huán)中，都會(huì)有更多的分子被切割下來(lái)，熒光強(qiáng)度呈指數(shù)增長(zhǎng)。實(shí)時(shí)RT-PCR

不僅可避免假陽(yáng)性的出現(xiàn)、提高檢測(cè)靈敏度、實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，并且可在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)完成，減少了污染，反應(yīng)自動(dòng)完成，易定量。（4）核酸雜交技術(shù)（Nucleicacidhybridization）核酸雜交是兩段具有一定的同源性、來(lái)源不同的核酸分子在去掉變性條件后，互補(bǔ)的區(qū)段退火形成異質(zhì)雙鏈分子的過(guò)程。核酸雜交是先將待測(cè)核酸固定在膜上，然后用核酸探針與其進(jìn)行雜交，使雜交體帶上標(biāo)記而被顯示出來(lái)。一般采用核酸點(diǎn)雜交法來(lái)檢測(cè)植物病毒，直接把病毒核酸點(diǎn)到NC膜上再使之與探針雜交；也有的直接把病毒樣品點(diǎn)到NC膜上。檢測(cè)的?；猿潭热Q于探針與病毒核酸序列的互補(bǔ)程度。核酸雜交技術(shù)適用于DNA病毒、RNA病毒及類(lèi)病毒的檢測(cè)，靈敏度高、特異性強(qiáng)。核酸雜交還可和RT-PCR

結(jié)合使用，用于病毒檢測(cè)的有斑點(diǎn)雜交、細(xì)胞內(nèi)原位雜交、DNA印跡雜交、RNA印跡雜交等。（5）基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù)又稱DNA芯片、生物芯片（biochip）、微陣列（microarray）。其原理是：將已知的生物分子探針或基因探針，大規(guī)模或有序排布于小塊硅片等載體上，與待測(cè)樣品中的生物分子或基因序列相互作用和并行反應(yīng)，在激光的激發(fā)下，產(chǎn)生的熒光譜信號(hào)被接受器收集，計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析處理數(shù)據(jù)并報(bào)告結(jié)果。其優(yōu)點(diǎn)是：可以一次性完成大量樣品DNA序列的檢測(cè)和分析，解決了傳統(tǒng)核酸雜交技術(shù)的許多不足?；蛐酒鶕?jù)所用探針的類(lèi)型不同分為cDNA微陣列(或cDNA微陣列芯片)和寡核苷酸陣列(或芯片)，根據(jù)應(yīng)用領(lǐng)域不同而制備的專用芯片如毒理學(xué)芯片(Toxchip)、病毒檢測(cè)芯片(如肝炎病毒檢測(cè)芯片)、P53基因檢測(cè)芯片等。芯片技術(shù)在病毒等微生物學(xué)診斷和流行病學(xué)調(diào)查方面有著廣闊的應(yīng)用前景。基因芯片技術(shù)不僅避免了繁瑣而費(fèi)時(shí)的病原微生物培養(yǎng)，而且不需要等到抗體的出現(xiàn)，為病原微生物診斷提供了強(qiáng)有力的技術(shù)手段。Hauser等應(yīng)用DNA芯片技術(shù)在艾滋病患者出現(xiàn)抗體反應(yīng)之前檢測(cè)到艾滋病病毒，對(duì)該病的早期診斷意義重大。此外，基因芯片技術(shù)對(duì)人巨細(xì)胞病毒、肝炎病毒、結(jié)核分枝桿菌的診斷及致病微生物的鑒別亦發(fā)揮一定作用。練習(xí)：一、單項(xiàng)選擇題1．今年3月12日，國(guó)家藥監(jiān)局發(fā)布通告，五款新冠抗原自測(cè)產(chǎn)品正式上市，居民可購(gòu)買(mǎi)試劑盒自測(cè)新冠病毒抗原。新冠病毒抗原檢測(cè)試劑盒利用了人工標(biāo)記的抗體，檢測(cè)新冠病毒表面的特定抗原。與核酸檢測(cè)相比，抗原檢測(cè)因?yàn)闆](méi)有擴(kuò)增，敏感性要略微低一點(diǎn)，但一旦檢測(cè)出陽(yáng)性，就會(huì)具有很強(qiáng)的價(jià)值。以下關(guān)于抗原和抗原檢測(cè)的敘述，正確的是（）A．抗原是由漿細(xì)胞產(chǎn)生的免疫活性物質(zhì)B．抗原檢測(cè)陰性的人一定不會(huì)是感染者C．抗原檢測(cè)可以逐步取代核酸檢測(cè)作為確診依據(jù)D．抗原檢測(cè)利用了抗原抗體特異性結(jié)合的原理2．導(dǎo)致新冠肺炎的病原體是“2019﹣nCoV”病毒，該病毒為RNA病毒，其序列中具有RNA聚合酶基因，無(wú)逆轉(zhuǎn)錄酶基因?？焖贉?zhǔn)確的檢測(cè)對(duì)疫情防控起著至關(guān)重要的作用。病毒的檢測(cè)方法有：用“新冠病毒核酸檢測(cè)試劑盒”，檢測(cè)病毒的遺傳物質(zhì)RNA；特異性抗原蛋白檢測(cè)，即檢測(cè)病毒表面的一種糖蛋白；特異性抗體檢測(cè)，即檢測(cè)感染者體內(nèi)通過(guò)免疫反應(yīng)所產(chǎn)生的某種抗體。下列有關(guān)說(shuō)法不正確的是（）A．方法都需要從患者體內(nèi)采集病毒樣本B．方法都需要用到抗原﹣抗體雜交的方法C．某人有可能為陽(yáng)性為陰性，也可能為陽(yáng)性為陰性D．由于RNA相比DNA穩(wěn)定性差，往往將病毒樣本的RNA進(jìn)行RT﹣PCR，即以病毒RNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行分段測(cè)序，在該過(guò)程中需要用到的工具酶有逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶3．導(dǎo)致新冠肺炎的病原體是“2019﹣nCoV”病毒，該病毒為RNA病毒，其序列中具有RNA聚合酶基因，無(wú)逆轉(zhuǎn)錄酶基因?？焖贉?zhǔn)確的檢測(cè)對(duì)疫情防控起著至關(guān)重要的作用。病毒的檢測(cè)方法有：用“新冠病毒核酸檢測(cè)試劑盒”，檢測(cè)病毒的遺傳物質(zhì)RNA；特異性抗原蛋白檢測(cè)，即檢測(cè)病毒表面的一種糖蛋白；特異性抗體檢測(cè)，即檢測(cè)感染者體內(nèi)通過(guò)免疫反應(yīng)所產(chǎn)生的某種抗體。下列有關(guān)說(shuō)法不正確的是（）A．方法都需要從患者體內(nèi)采集病毒樣本B．方法都需要用到抗原﹣抗體雜交的方法C．某人有可能為陽(yáng)性為陰性，也可能為陽(yáng)性為陰性D．由于RNA相比DNA穩(wěn)定性差，往往將病毒樣本的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，擴(kuò)增之后進(jìn)行分段測(cè)序，在該過(guò)程中需要用到的酶有逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶二、非選擇題4．通過(guò)咽拭子取樣進(jìn)行RT﹣PCR技術(shù)檢測(cè)是目前臨床上診斷新型冠狀病毒感染疑似患者的常用方法，用于核酸檢測(cè)的RT﹣PCR試劑盒的部分工作原理簡(jiǎn)圖如圖。請(qǐng)回答問(wèn)題。（1）RT﹣PCR是指以病毒的RNA為模板通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程合成，并對(duì)該產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的過(guò)程。PCR擴(kuò)增時(shí)，退火溫度的設(shè)定是成敗的關(guān)鍵。退火溫度過(guò)高會(huì)破壞與的堿基配對(duì)。（2）利用RT﹣PCR試劑盒對(duì)新型冠狀病毒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，除借助上述RT﹣PCR技術(shù)外，還需要有特異性探針。探針是指以放射性同位素、生物素或熒光染料等進(jìn)行標(biāo)記的已知核苷酸序列的核酸片段，核酸探針與目標(biāo)核苷酸序列間的分子雜交遵循。（3）為研制抗病毒A的單克隆抗體，某科研團(tuán)隊(duì)以小鼠為實(shí)驗(yàn)材料，進(jìn)行了圖2相關(guān)實(shí)驗(yàn)。下表為部分實(shí)驗(yàn)步驟，請(qǐng)完成表格。實(shí)驗(yàn)步驟的目的簡(jiǎn)要操作過(guò)程誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生能夠分泌特定抗體的B淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)前必須給小鼠甲注射制成單細(xì)胞懸液取小鼠脾臟剪碎，用處理使其分散成單個(gè)細(xì)胞，加入培養(yǎng)液用選擇培養(yǎng)基篩選出雜交細(xì)胞將B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞用試劑處理后，將多種細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基上中培養(yǎng)篩選出克隆化培養(yǎng)和專一抗體檢測(cè)進(jìn)行二次篩選使能產(chǎn)生目標(biāo)抗體的雜交細(xì)胞大量將二次篩選出的能產(chǎn)生目標(biāo)抗體的雜交細(xì)胞注射到小鼠腹腔內(nèi)培養(yǎng)或在體外培養(yǎng)5．新冠病毒的流行給人類(lèi)生活造成極大的影響。研發(fā)疫苗是防控新冠肺炎疫情的有效措施。3月初，我國(guó)自主研發(fā)的新冠病毒抗原檢測(cè)試劑盒上市，適用于三類(lèi)人群自行篩查，有利于提高“早發(fā)現(xiàn)”能力?；卮鹣铝袉?wèn)題：（1）人接種疫苗后，疫苗中的有效成分作為刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體。一旦新冠病毒侵入已免疫的機(jī)體，會(huì)迅速繁殖、分化，產(chǎn)生大量抗體?？贵w在患者體內(nèi)的作用是。（2）侵入機(jī)體的新冠病毒會(huì)激活T細(xì)胞增殖分化為，直接攻擊被病毒入侵的細(xì)胞，釋放出的病毒被吞噬、消滅。（3）新冠病毒抗原檢測(cè)試劑盒檢測(cè)新冠病毒的原理是。6．新冠肺炎是由新冠病毒感染引起的呼吸道傳染病。某些患者早期病情較輕，后期因發(fā)生細(xì)胞因子風(fēng)暴病情突然加重。圖示為細(xì)胞因子風(fēng)暴造成肺損傷的機(jī)制?；卮鹣铝袉?wèn)題：（1）為及時(shí)確診，科學(xué)家研制了基因檢測(cè)試劑盒，其機(jī)理為：分離待測(cè)個(gè)體細(xì)胞的總RNA，在酶的作用下得到相應(yīng)的DNA，該DNA擴(kuò)增后將樣本中微量的病毒信息放大，最后以熒光的方式讀取信號(hào)。這種方法也會(huì)出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象，請(qǐng)分析其中的原因（答出一點(diǎn)即可）。（2）預(yù)防新冠肺炎的有效措施是接種新型冠狀病毒滅活疫苗，滅活的含義是。（3）據(jù)圖可知，細(xì)胞因子風(fēng)暴造成肺損傷的機(jī)制是。利用的受體免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后，制備的單克隆抗體可用于新冠肺炎細(xì)胞因子風(fēng)暴的治療。相較于從動(dòng)物血清中分離所需抗體，單克隆抗體具有特點(diǎn)。生產(chǎn)單克隆抗體的過(guò)程，需要用到的動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)有（4）我國(guó)醫(yī)療工作者用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞靜脈輸入法對(duì)4例新冠肺炎重癥患者進(jìn)行了治療，效果良好。干細(xì)胞的特點(diǎn)是，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞除有干細(xì)胞特點(diǎn)外，還可以分泌多種營(yíng)養(yǎng)因子和調(diào)節(jié)物質(zhì)，其表面抗原不明顯，不會(huì)引起患者免疫排斥。由此分析，在治療過(guò)程中間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)揮的作用可能是。（至少答出兩點(diǎn)）7．研究人員基于新型冠狀病毒（2019﹣nCoV）表面抗原研發(fā)出靈敏性高的抗體診斷試劑盒，采一滴血僅十分鐘就可以得出檢測(cè)結(jié)果。如圖是新型冠狀病毒（2019﹣nCoV）引發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)的部分示意圖。請(qǐng)分析回答：（1）2019﹣nCoV侵入人體后，大多數(shù)病毒會(huì)被吞噬細(xì)胞吞噬，該過(guò)程屬于人體第道防線。除防御功能之外，免疫系統(tǒng)還具有功能。圖中Ⅰ～Ⅶ表示不同種類(lèi)的細(xì)胞，其中不能特異性識(shí)別抗原的有（填序號(hào)）。（2）細(xì)胞Ⅰ（填細(xì)胞名稱）把病毒特有的抗原暴露出來(lái)，呈遞給輔助性T細(xì)胞，使該細(xì)胞開(kāi)始增殖、分化并分泌，進(jìn)而產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫。（3）研究人員研發(fā)的靈敏性高的抗體診斷試劑盒能檢測(cè)出抗原利用的免疫學(xué)原理是。（4）免疫預(yù)防，一般要進(jìn)行預(yù)防接種。疫苗研制成為抗2019﹣nCoV的首選，多次注射疫苗的目的是使人體內(nèi)產(chǎn)生。8．EB病毒又稱人類(lèi)皰疹病毒4型（HHV﹣4）。它主要感染人類(lèi)口咽部的上皮細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞。臨床表現(xiàn)多樣，但有三個(gè)典型癥狀為發(fā)熱、咽炎和頸淋巴結(jié)腫大。隨著疾病的發(fā)展，病毒可播散至其他淋巴結(jié)。病毒攜帶者和病人是本病的傳染源。（1）EB病毒侵入人體后，臨床表現(xiàn)發(fā)熱的現(xiàn)象，若某患者的體溫維持在39.5度的高溫，此時(shí)患者體內(nèi)的產(chǎn)熱量（填大于、等于或小于）散熱量。（2）EB病毒侵入人體后，吞噬細(xì)胞一方面可以吞噬消滅病毒，另一方面將處理后的抗原呈遞給T細(xì)胞，上述過(guò)程是人體的第道防線在發(fā)揮作用。當(dāng)EB病毒侵入宿主細(xì)胞后，主要通過(guò)免疫來(lái)清除病毒。（3）預(yù)防傳染病的重要措施是接種疫苗，目前市場(chǎng)上已經(jīng)有針對(duì)EB病毒的疫苗問(wèn)世，接種疫苗預(yù)防疾病的原理是。（4）在EB病毒的臨床檢測(cè)中，利用靈敏度高的抗體診斷試劑盒檢測(cè)血清中相應(yīng)的EB抗原，其免疫學(xué)原理是利用了抗體與抗原結(jié)合的具有性。9．根據(jù)材料回答問(wèn)題：材料一：科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)新型冠狀病毒S蛋白（Spikeprotein，刺突蛋白）可與宿主細(xì)胞的病毒受體結(jié)合，是決定病毒入侵易感細(xì)胞的關(guān)鍵蛋白。（1）以S蛋白作為可制備單克隆抗體生產(chǎn)快速檢測(cè)新冠病毒的試劑盒。單克隆抗體制備過(guò)程中有兩次篩選，第一次篩選的目的是得到的雜交瘤細(xì)胞，該雜交瘤細(xì)胞還需進(jìn)行，經(jīng)過(guò)多次篩選，就可獲得足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。材料二：新型冠狀病毒核酸檢測(cè)采用熒光定量PCR儀，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的累積（以Ct值表示）來(lái)確定樣本中是否有病毒核酸。新冠病毒的遺傳物質(zhì)為RNA，科學(xué)家先將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄，再將得到的cDNA進(jìn)行多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增得到了大量DNA片段（如圖所示）。（2）在上述技術(shù)中，用到的酶有（至少寫(xiě)出兩種）。（3）科學(xué)家已測(cè)出新冠病毒的核酸序列，據(jù)圖分析，Ⅰ、Ⅱ過(guò)程需要根據(jù)病毒的核苷酸序列設(shè)計(jì)。過(guò)程Ⅱ中以cDNA為模板經(jīng)過(guò)三步循環(huán)擴(kuò)增得到多個(gè)DNA片段，第次復(fù)制后就能獲得兩條鏈等長(zhǎng)的DNA序列。（4）采集新冠肺炎疑似患者的咽部細(xì)胞樣本提取核酸進(jìn)行上述PCR過(guò)程，每一個(gè)擴(kuò)增出來(lái)的DNA序列，都可與預(yù)先加入的一段熒光標(biāo)記探針結(jié)合，產(chǎn)生熒光信號(hào)，擴(kuò)增出來(lái)的靶基因越多，觀察到的Ct值就越。10．新型冠