8/8多肽的基本常識

保存:?大多肽在—2０℃很穩(wěn)定，特別是冷凍干燥并保存在干燥器中,在將它們暴露于空氣之前，冷凍干燥多肽可以放于室溫。這將使?jié)穸扔绊憸p少,當無法冷凍干燥時,最好的方法是以小的工作樣量存放。?對于含Cｙs,Met,TｒＰ的多肽，脫氧緩沖劑對其溶解必不可少,因為這種多肽可易空氣氧化,在封瓶前，慢慢流過多肽的氮氣或氬氣也會降低氧化作用。含Glｎ或Asn溶解性:

大多肽的首選溶劑是超純抽氣水。稀乙酸或氨水分別對于堿性或酸性多肽的溶解很重要.這些方法不溶的多肽，需要DＭＦ、脲、guanｉdinｉamｃhlｏridｅ或acｅtoniｔnle來溶解，這些溶劑可能某些實驗有副作用。所以我們建議設計多肽時要加注意。

殘基Ａla,Cyｓ，Ile,Leu，Met，Phe和Vａl將會增加多肽的溶解難度。

您需要特殊的多肽或任何技術幫助，請隨時與我們聯(lián)系。我們包你完全滿意，對于我們不能適當合成的順序，我們不收費。多肽的保存和操做??包裝1ｍｇ或更少的多肽按凈重包裝，聲明的小瓶重不含相關抗離子和水。例如，氨基酸分析決定的肽含量是8０％,在1ｍｇ樣品中,那么瓶中毛重是1.25mｇ.?大量的多肽以毛重算。標出的重量含相關抗離子和水，例如,25mg樣品中肽百分比為９0%，那么,實際肽量為25mg×90％＝２2。5ｍｇ?不要把肽含量和純度搞混了。肽的純度可能是100%，而肽含量相關帶電基團(如Arg,Lｙs）的抗離子量和肽親水性決定。這是合成肽的本身特性。凍干肽的保存?所有產(chǎn)品應存于冰箱，最好為－20℃肽溶液的保存?溶液肽遠比凍干形式不穩(wěn)定，溶液應為中性pH(pH5—7），—２0℃保存的,為避免樣品的反復凍融,最好分成小樣存放.多肽的重建和操作?

多數(shù)肽溶于無菌蒸溜水。初次溶解時,要注意使初始濃度比要求濃度大，如果多肽僅有限溶解性，這便允許加入其它溶解劑或緩沖鹽.

如果多肽在水中的溶解性有限，有幾種選擇可幫助溶解：?對堿性肽用稀乙酸(含Ａrｇ，Lys，Hｉｓ)?酸性肽用稀氨水(含Asp，Glu）

對極疏水的肽用10%有機修飾物（Ａｃetonｉtnilｅ，Methaｎol)?極不溶的肽用DMＳ0或ＤMF

gｕａｎicliｎehyｄroｃｈlｏride或脲的濃溶液也很有用,與上述方法合用，超聲處理也是溶解多肽的有效手段.多肽的包裝

目錄中所有多肽除特別說明外,純度為９５～98%。包裝為小瓶凍干粉。除特別注明外，多肽凈重包裝，例如,１mg瓶的β-amyｌoid1－４0精確含1mg的多肽。多肽凈重由氨基酸分析得到的肽含量計算。例如，一個多肽樣品毛重5ｍg,氨基酸含量８5％,多肽凈重為5mg×０.85=４。25mｇ。請注意，多肽含量不是多肽純度,與抗離子象乙酸鹽和溶劑，特別是水結合量合成多肽的本身特性。多肽純度可能達1００%,但合成品中多肽含量由氨基酸組成,硫水性，和多肽對溶劑和離子的暴露決定,特別是在純化過程中，無論多肽如何純,凍干粉多肽含量一般為70－8５％。剩余１５—30%由其它基本非肽成份構成.多肽應用和保存?多肽具廣泛的溶解性。多肽不溶的主要問題是形成二級結構。除了最太肽外，這點都會發(fā)生，在有多重疏水殘基的肽中更顯著。鹽會促進二級結構形成.我們建議先在無菌蒸餾水或去離子中溶解多肽.如需要增加溶解率,可用聲處理。溶解仍有問題,加少量稀乙酸(1０％)或氨水，會便于溶解。?要長期保存多肽,最好冷凍干燥，冷干粉可在－20℃或更低存放幾年而很少或無降解.溶液中的多肽遠不穩(wěn)定。多肽易受細菌降解,應用無菌純化水溶解。

含有Met,Ｃｙs或Ty固相多肽合成Fmoc方法??任何多肽鏈的關鍵連接為肽鍵，由一個氨基酸的氨基與另氨基酸的縮合形成。通常一個氨基酸由一個中心碳原子組成，它由四個基它基團包圍：氨基、羰基、基和側鏈.側鏈，稱為R,區(qū)別不同氨基酸的結構.某些側鏈含有干擾肽鍵形成的功能團。因此側鏈功能團的封閉很重要。?圖工顯示了Fmoc合成的一般流程，首先第一個Fmｏｃ氨基酸通過一個酸性接頭接到不溶載體樹脂上,Fｍｏc去保護通過用堿處理樹脂來完成,一般是Ｐｏｐｅｒiｄine.用預先激活或原位激活連接第二個Ｆｍoc氨基酸.要求總多肽合成后，通過TFA分離來除去樹脂和去保護。Fmoc分離固相多肽合成中多肽分離主要用酸解Fmoc法用弱酸，比如TＦA或TMSＢr.各種添加劑,一般為thiolcompoｕnｄ，水和酚,用來保護多肽的免分離中Carｂoｃａt(yī)iｏn的破壞。下列保護基與TＦA和ＴMSBr分離相合:（略）基于保護基團的類別，必須使用去保護劑的組合。例如,當Boc和tButyl存在時,它們的Cａｒbｏｃａt(yī)ion對應物能與Trp，Tyr和Meｔ反應形成ｔbuｔyｌ產(chǎn)物.ＥDT是極有效的ｔ—ｂｕtｙｌｔriｆlｕoroacetａt(yī)e清除劑，但它不保護Ｔrp。因此，必須加水以控制烷基化。Trp的吲哚環(huán)和Tyｒ的OH極易與Pmｃ反應.水再次表現(xiàn)出對此反應的抑制。Ｔrｔ和Mtr基團也有相似情形。較此適當組合清除劑將極大降低副反應。ｔBoｃ和ＣBZ多肽合成ｔＢoｃ合成法見圖３ｔBoc法的分離法Ｂｏｃ使用強酸，比如HF，TＦMSA或TＦMoTf。分離加入各種添加劑，一般為thiol化合物以保護多肽免受carbｏcation破壞。ＨF分離法(如下）略TFＭSＯＴf分離ＴMSＯＴf分離SPＰS的一般連接方法適于固相多肽合成的連接反應要求?；磻?對同源多肽最有效。ＦmocＳＰＰS連接方法ＦmoｃSPPＳ最常用的連接法是活性酯，要么原位，要預先激活.起初Ｐ-niｔｒophｅnｙl和N－h(huán)ydnｘysuccinimiｄe激活酰是常用形式。甚至,有HOBt時，連接反應也很慢，此外，Ｆmｏｃ氨基酸ＯNSu、酯與succｉniｍido-carｂｏnｙl—β－ａlanine-N-Hyｄroxysｕccinididｅ酯副產(chǎn)物的形成相關。今天最常用的激活酯是Opfp和Odhbt。有HoBt時反應速度極快，副產(chǎn)物少。另一方面，使用象DCC，HＢTU,BOＰ,ＢOP-Ce，或TBTＵ活化劑時,能原位進行許多連接反應.Carboｎdｉimｉde的直接添加是最佳選擇.然而,TBTU和HBＴU第二個出現(xiàn)，接著ＢoP，最后是ＢoP-CＥ。再者，酯連接發(fā)現(xiàn)BoP／HｏBｔ〉Carbｏｄiimｉdo/HoBt＞Carｂodiiｍｉｄo/ODHｂT>Ｃaｒbodiiｍｉdｅ／Opｆp.最近以來，ＨOAt和其對應Ｕroｎium鹽同類物HATU的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)此ＨoＢt和HＢＴU具更強催化活性，結果是增加連接產(chǎn)出,縮短連接時間，消旋降低。故此，更適合阻位氨基酸的連接,使得難合成肽的合成更成功。ｔBocSPＰＳ的普通連接法Cａrbｏdiimｉdes，主要是DCC是使用多年的連接試劑,主要的問題是激活和?；^程中dicｙcloｈexylurｅa的沉淀。并且伴有許多副反應,已有幾種產(chǎn)生可溶脲的Carbodiiｍide，例如DIC，t-butylｍetｈyl—和t—ｔaｔｙｌlethyl－ｃａrbodiｉｍidｅ，但是這些試劑未解決副反應的問題。結果生產(chǎn)出了新的激活劑。首先是ＢOP，隨后是PyBrｏp,ＰyＢOP,HBTU，TＢＴU和HＡＴＵ。所有前述試劑都要活性堿基。所有前面討論的DCC及其衍生物都通過對稱酐的形成起作.通常，對稱酐反應性極強已廣泛用于ＳPＳＳ，特別t－Boc合成中,對稱酐整合入Fｍoc氨基酸有一些困難,例如，從N－(3—diｍethｙlaｍｉｎoｐropyl）—N？/FOＮT〉—ｅthyｌ-carｂｏdiｉmides—HＧ制備的對稱酐，由于Ｚ—ａlkory—5(4Ｈ）—ｏｘayoｌｎe中間體的形成，在Ｃarbodｉimidｉe和tｅrtianyａｍines存在時重排，還有,不是所有的Fmoc對稱酐都溶于ＤＣM，或者無論所有試劑如何都不溶。對稱酐的另一種改變是混合酐,Carboxglic—Carbｏｎate或Ｃaｒboxｇlｉc-ｐｈｏsｐhｉｎｉc混合酐，典型的情況且是,由活性ｉsｏｂutyl—或isｏpｒｏｐｙl—cｈorｏfｏrmatｅ制備這些，用Nox被阻氨基酸代替phｏsphiｎiccｈｌｏｒｉｄe.通常反應迅速及少或無有副反應.混合酐,N－carbｏxｙ酐（NCAS），也叫,Leuch酐，已廣泛用于多聚氨基酸制備，這類化合物聯(lián)合Ｎox保護和活化炭基，一旦和另一個氨基酸或肽殘基反應，釋放CO2做為副產(chǎn)物。用光氣處理α氨基酸很容易得到ＮCA衍生物，在嚴格調控條件下，ＮCＡ衍生物常結晶析出,便可使用。這些條件要求嚴格控制合成中的PH，在ＰＨ值低于１０時，NCA和肽或氨基酸殘基反應產(chǎn)物，肽—Carbamate易失去CＯ2形成自由α-氨基端,發(fā)生聚合。pH10．5時，ＮCA便水解隆解。所以反應在ＰＨ10.2條件下進行。別的條件要求是反應在０℃液相合成?基于將單個Ｎ—α保護氨基酸反復加到生長的氨基成份上,合成一步步地進行,通常從合成鏈的Ｃ端氨基酸開始，接著的單個氨基酸的連接通過用ＤＣC,混合炭酐,或N—caｒboｘy酐方法實現(xiàn)。Carboｄiiｍide方法包括用DＣC做連接劑連接N－和Ｃ—保護氨基酸。重要的是,這種連接試劑促接N保護氨基酸自己炭基和Ｃ保護氨基酸自由氨基間的縮水，形成肽鏈，同時產(chǎn)出N，N？／FONT＞—dyaylcoherｃyｌureａ副產(chǎn)物。然而，此方法因其導致消旋的副反應,或在強堿存在時形成5（4H）-oxaylｏnes和Ｎ—acylｕreａ而受到影響.慶幸地是，這些副反應能最小化,如果還不能完全消除。方法是加入象ＨｏSu或ＨｏBT這樣的連接催化劑，此外，此方法也可用于合成N保護氨基酸的活性酯衍生物。依次產(chǎn)生的活性酯將自發(fā)與任何別的C保護氨基酸或肽反應形成新的肽。?當從副產(chǎn)品,diａｙdoｈexyｌurｅa分離活性酯有困難時,可用混合Carboｎiｃ酐方法，此方法由兩步組成，第一步是在有teｒtｉarｙ堿的有機溶劑中用適當?shù)孽；燃せ頝x保護氨基酸的炭基，第二步是讓肽或氨基酸的自由氨基與Carbｏnic酐反應.Carboｎic酐通常加到自由氨基的14倍.

雖然此方法在低溫時高效高產(chǎn)，產(chǎn)品純，但也有其缺點,例如,由羰基的強激活酐衍生物有消旋傾向。然而此問題在使用Nｘ-α—Urｅｔhane保護基(Cｂ2,或tBoc）時便不會發(fā)生。進一步：由于高反應性，混合Ｃarboｎiｃ酐傾向5(4Ｈ）－ｏｘagｏｌomｅs，Urｅrbaｎesdｉacyimide，酯的形成，并易失調.?促進這些副反應的條件是高溫，延長激活時間（即，混合酐形成后，加到alkyｌchlｏrocarbonａt(yī)e和aｍinｅ成份的時間，ａmine組成的空間占位，平共處和混合酐的不完整形成。幸運的是，大多這些副反應，除形成啞唑酮和脲烷外,可通過低溫進行反應(～－1５℃)，大為減少,并且縮短活化時間（~1－2分鐘)。為了使啞唑酮和尿烷形成最少，要實行如下措施：1)必要性須用無水有機溶劑,乙酸，四氫喃，t-butaｎd，或acetonitrｉle;2)應使用tｅrtiary堿和N—meｔhｇlmｏrpholiｎe；3)必須用Cｂ2或tBoｃN-α保護氨基酸。?雖然用iｓoｂuｔｙl-和etｈylcｈlorocaｒbonatｅ常用來形成羰酐，但確有別的連接試劑，例如,EEQD和IIＱD用來與ＣａrｂoｘaＰ成份反應形成ｅrｈyl－或ｉsobutylcarｂonaｔe衍生物.不同于傳統(tǒng)酐程序，ＥEQD和ＩIQＤ不要求堿,也不要求低溫，通常要求一種有機溶劑(有許多也用）中0。1－0．４MＨPＬC分析和純化

分析ＨＰLC使用柱子和泵系統(tǒng)，可以經(jīng)受傳遞高壓，這樣可以用極細的微粒(3-１0μｍ）做填料.由此多肽要在幾分鐘內高度被分析。?HPLＣ分兩類:離子交換和反相。離子交換HPLＣ依靠多肽和固相間的直接電荷相互作用.柱子在一定PH范圍帶有特定電荷衍變成一種離子體,而多肽或多肽混合物,由其氨基酸組成表現(xiàn)出相反電荷。分離是一種電荷相互作用,通過可變ＰH,離子強度，或兩者洗脫出多肽，通常，先用低離子強度的溶液，以后逐漸加強或一步一步加強，直到多肽火柱中洗脫出。離子交換分離的一個例子使用強陽離子交換柱.如sulfoethylasｐaｒｔiｍide通過酸性PH中帶正電來分離。?反相HPLC條件與正常層析正相反。多肽通過疏水作用連到柱上,用降低離子強度洗脫，如增加洗脫劑的疏水性。通常柱子由共價吸附到硅上的碳氫烷鏈構成，這種鏈長度為G4—G8碳原子.由于洗脫是一種疏水作用。長鏈柱比短鏈對小的，高帶電肽好。另一方面大的疏水肽用短鏈柱洗脫好.然而，總體實踐中,這兩類柱互變無多少顯著差別，別類載體由碳水化合物構成,比如苯基。

典型的操作常由兩綬沖劑組成,0。1%TFA—H2o和８０%aceｔoｎｉtrｉle0.1％TFA-－H2o稀ａｃetonitriｌｅ。用線型梯變以每分鐘0。5％到１．０％改變的速度混合。常見分析和純化用柱為