發(fā)酵的方式有:

(1)分批發(fā)酵(BatchFermentation)

(2)補料分批發(fā)酵(Fed-batchFermentation)

(3)連續(xù)發(fā)酵(ContinueFermentation)

(4)高密度發(fā)酵(HighDensityFermentation）

(5)工程菌發(fā)酵(EngineeredStrainorRecombinantStrainFermentation)

第七章分批發(fā)酵和補料分批技術

(BatchfermentationandFed-batchfermentation)一.分批發(fā)酵

(一)分批發(fā)酵概況操作工藝

(二)分批發(fā)酵中的菌體生長規(guī)律

1.典型的生長周期

2.多底物培養(yǎng)基的生長

3.線性生長和立方根生長

(三)分批發(fā)酵過程中的代謝變化

(四)分批發(fā)酵過程的最優(yōu)化

(五)分批發(fā)酵的生產(chǎn)率二補料分批發(fā)酵（Fed-batchFermentation）1．補料分批發(fā)酵技術的含義2．補料分批發(fā)酵與分批發(fā)酵，連續(xù)發(fā)酵的區(qū)別？3．補料分批發(fā)酵技術的特點：4．補料分批發(fā)酵技術的類型：5．補料分批發(fā)酵的適用范圍6.流加物料的方式

1）恒定流速補料操作

2）恒定底物濃度操作

3）指數(shù)流速操作7.補料分批發(fā)酵技術的評價一點重要的常識

分批發(fā)酵是指生物反應器的間歇操作,在發(fā)酵過程中,除了不斷進行通氣(好氧發(fā)酵)和為調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH而加入酸堿溶液外,與外界沒有其它物料交換。這種培養(yǎng)方式操作簡單,是一種最為廣泛使用的方式。

分批發(fā)酵的主要特征是所有工藝變量都隨時間而變化。主要的工藝變量是各種物質(zhì)的濃度及其變化速率。(見下表)

一.分批發(fā)酵

（一）

分批操作工藝

分批發(fā)酵目的產(chǎn)物種類雖然不同,但操作工藝基本相同.(見下圖)典型的分批發(fā)酵工藝流程圖1.主要設備

主培養(yǎng)罐(主發(fā)酵罐)和種子培養(yǎng)罐(種子罐),均屬于深層培養(yǎng)裝置。(含有配料,蒸氣滅菌,冷卻,通氣,空氣過慮,攪拌和消泡裝置等)。

種子罐:為主發(fā)酵罐培養(yǎng)基接種所需要的菌體種子。

典型的分批發(fā)酵工藝流程圖(見上頁圖)

搖瓶培養(yǎng)----種子培養(yǎng)----發(fā)酵培養(yǎng)(10倍體積逐級擴大)

2.發(fā)酵生產(chǎn)基本過程

種子罐高壓蒸氣滅菌(空消)------投入培養(yǎng)基再滅菌(實消)------

接入從搖瓶培養(yǎng)得來的種子------培養(yǎng)。同時,準備發(fā)酵罐------空消------連消:利用專門的滅菌裝置對發(fā)酵培養(yǎng)基進行連續(xù)滅菌------投入空消過的發(fā)酵罐。經(jīng)培養(yǎng)種子罐內(nèi)達到一定菌體量時-----發(fā)酵罐------發(fā)酵終點------提取精制。

發(fā)酵周期:每批反應的全過程即加入滅菌的培養(yǎng)基,接種,培養(yǎng)的誘導期,反應過程,放罐,洗罐以及空罐滅菌所需要時間的總合。（二）分批發(fā)酵中的菌體生長規(guī)律

微生物的生長包含兩個含義

即：細胞的生長

微生物群體數(shù)量的增加

1.典型的生長周期

分批培養(yǎng)是一個封閉的系統(tǒng)。接種后,除氧之外,一般都不向系統(tǒng)內(nèi)添加和除去任何物質(zhì)。因此,分批培養(yǎng)系

統(tǒng)只能在一段時間內(nèi)支持微生物的增殖?？梢苑譃槲鍌€時期:

A延遲期

B對數(shù)生長期

C減速期

D靜止期

E衰退期aaa上式下頁有本公式變化式C.減速期D靜止期

因營養(yǎng)物質(zhì)耗盡或有害物質(zhì)的積累,使細胞濃度不再增大,這一階段為靜止期或穩(wěn)定期.在此期內(nèi),細胞濃度達到最大值?

E衰亡期

由于環(huán)境惡化,細胞開始死亡,活細胞濃度不斷下降,這一階段為衰亡期.

有關衰亡期:另外,還有將其分為六個動力學區(qū)域的說法:Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ和

Ⅵ?Fig.六個動力學區(qū)域見下頁圖。3.線性生長和立方根生長

在某些情況下，微生物會表現(xiàn)為線性生長（lineargrowth)。線性生長時的菌體生長速度為一常數(shù)（dX/dt=C），而同菌體量無關。生長的線性特征是存在某種生長限制的表現(xiàn)。造成線性生長的可能原因很多，例如：酶濃度低而只表現(xiàn)恒定的活性；營養(yǎng)物質(zhì)缺乏；外部或內(nèi)部的傳質(zhì)限制等。由于供氧不足引起的線性生長是外部傳質(zhì)限制的典型例子（圖）。增加體積氧傳遞系數(shù)（KLa)就可以消除線性生長。圖：在分批發(fā)酵中，氧傳遞速度（OTR）對微生物生長的影響。提高體積氧傳遞系數(shù)可使微生物由線性生長（1）轉(zhuǎn)變?yōu)橹笖?shù)生長（2)

菌體形態(tài)也會影響微生物的生長速度。絲狀真菌可以以兩種不同的形態(tài)生長：絲狀生長和菌絲球生長。在液體深層發(fā)酵中，絲狀生長可遵循指數(shù)生長規(guī)律，而菌絲球的生長由于受營養(yǎng)物質(zhì)（主要是氧）擴散的限制而表現(xiàn)為立方根生長。（三）分批發(fā)酵過程中的代謝變化

（1）菌體生長階段

亦稱發(fā)酵前期或菌體生長期。發(fā)酵培養(yǎng)基接種后，產(chǎn)生菌在合適的環(huán)境中經(jīng)過短暫的適應，即開始發(fā)育、生長和繁殖，直至達到菌體的臨界濃度。此階段的代謝變化，主要是碳、氮源的分解代謝以及菌體細胞物質(zhì)的合成代謝，二者有機地聯(lián)系在一起。營養(yǎng)物質(zhì)不斷被消耗，新菌體不斷合成，溶解氧水平不斷下降。當營養(yǎng)消耗至一定程度，菌體生長至一定濃度，或者溶氧濃度下降至某一水平，即成為限制因素時，菌體生長速度減慢；同時，由于菌體內(nèi)某些中間代謝產(chǎn)物迅速積累，原有的酶活力下降（或消失）以及出現(xiàn)與產(chǎn)物合成有關的新酶等原因，導致生理階段的轉(zhuǎn)變，即由菌體生長階段轉(zhuǎn)入產(chǎn)物合成階段。（2）產(chǎn)物合成階段

亦稱發(fā)酵中期或產(chǎn)物分泌期。此期以合成產(chǎn)物為主，產(chǎn)物生成速率達到最大，并一直維持到合成能力衰退。在此階段中，菌體重量有所增加，但呼吸強度一般無顯著變化。代謝變化以碳、氮源的分解代謝和產(chǎn)物合成代謝為主，二者有機的聯(lián)系在一起，營養(yǎng)物質(zhì)不斷消耗，產(chǎn)物不斷合成。此外，尚有合成菌體細胞物質(zhì)的代謝存在，但不是主要的。一般在這個階段必須將營養(yǎng)物質(zhì)的濃度控制在一定范圍內(nèi)，以利于產(chǎn)物合成代謝的進行。如果營養(yǎng)物質(zhì)多，則促進菌體生長，抑制產(chǎn)物合成；如果營養(yǎng)物質(zhì)過少，則菌體易衰老，合成能力衰退，對生產(chǎn)不利。此外，發(fā)酵液的pH、溫度、和溶氧濃度都會影響發(fā)酵過程中的代謝變化，從而影響產(chǎn)量，必須予以嚴格控制。(四)分批發(fā)酵過程的最優(yōu)化1.分批發(fā)酵的最優(yōu)目的:以最小的費用獲得最大產(chǎn)量。

生產(chǎn)成本:原料費

+操作費(通氣費+攪拌費)

最優(yōu)化的目標函數(shù):可以取產(chǎn)量(對反應器而言,就是最終產(chǎn)物濃度

P),生產(chǎn)率(單位時間的平均產(chǎn)量

PiV/ti),純利潤等。也可用其中的兩個進行多目標函數(shù)優(yōu)化。

（3）菌體自溶階段亦稱發(fā)酵后期或菌體自溶期。此階段菌體衰老，細胞開始自溶，合成產(chǎn)物能力衰退，生產(chǎn)速率下降，NH2-N增加，pH上升。此時發(fā)酵必須結束，否則不僅會使抗生素受到破壞，還會給發(fā)酵液過濾和提煉帶來困難。

根據(jù)發(fā)酵過程中C、N、pH、菌體重量和產(chǎn)物濃度等參數(shù)的變化，可以做出發(fā)酵過程中的代謝曲線。代謝曲線能夠很清楚地表明發(fā)酵過程中的代謝變化，并反映C、N的利用和pH、菌體重量及產(chǎn)物濃度等參數(shù)之間的關系。對代謝曲線進行分析研究，有利于掌握代謝變化的規(guī)律及發(fā)現(xiàn)工藝控制中存在的問題，有利于改進工藝，提高產(chǎn)量。1.培養(yǎng)基配方的最優(yōu)化

微生物生長需要許多營養(yǎng)物質(zhì)，這些營養(yǎng)物質(zhì)共同影響著菌體生長和代謝產(chǎn)物的生成。微生物的培養(yǎng)基配方一般是先參考以往的報道或根據(jù)經(jīng)驗確定的。有必要研究所用培養(yǎng)基的各組分含量是否必要或者是否充分利用了。在分批培養(yǎng)中，所有的培養(yǎng)基組分一次投入，不在中途調(diào)節(jié)和控制其濃度，因而底物濃度一直下降，變化幅度很大。無論rx、rs、rp等速率參數(shù)在反應中與底物濃度有怎樣的對應關系，僅根據(jù)化學計量關系確定營養(yǎng)物的初始濃度，也是比較合理的。即預先設定Xst為最大菌體濃度，則可得底物Si的初始濃度為：(8.12)無機離子或生長因子等一旦被細胞吸收，在細胞內(nèi)保持原化學狀態(tài)，且含量恒定不變。這類營養(yǎng)物質(zhì)稱為儲存性底物?？筛鶕?jù)這些物質(zhì)在菌體內(nèi)的實際含量，用類似于式（8.12）的方法確定其需要量。代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量與培養(yǎng)基配方之間的關系很復雜，不能用解析函數(shù)形式表示時，可采用實驗設計法確定最優(yōu)初始濃度。實驗設計法的詳細介紹可參閱有關專著。意義利用最有實驗設計法，即使不能提高產(chǎn)量，也可以探索培養(yǎng)基組分的最小需要量，從而避免不必要的浪費。

2.反應溫度的最有化分批發(fā)酵微生物反應過程中，并非一定要一直保持恒溫，因為微生物生長的最適溫度不一定與代謝產(chǎn)物的最適溫度相同。例如生產(chǎn)青霉素的青霉屬（Penicillium)霉菌的生長速率大約在30℃時最大，而青霉素合成速率卻在較低溫度（15-20℃）時最大。一般在二者之間的中間值（35℃）進行給定值恒溫控制。下面介紹Constantinides等用最優(yōu)化原理進行溫度最優(yōu)化的結果。為了運用最優(yōu)化控制理論，需要建立描述對象系統(tǒng)狀態(tài)特征的數(shù)學模型。若數(shù)學模型不能正確表達系統(tǒng)的特征，得到的最優(yōu)解事不可靠的，因此，數(shù)學模型必須盡可能正確。檢驗模型可靠性的過程稱為模型識辨。必須重視模型辨識。

Constantinides等運用統(tǒng)計學方法比較了青霉素發(fā)酵的集中模型的適用性后，采用了如下模型：青霉素生產(chǎn)菌的增長方程（五）分批發(fā)酵的生產(chǎn)率

體積生產(chǎn)率是以每小時每升產(chǎn)物的克數(shù)來表示的（g產(chǎn)物/L*h）,也是過程綜合性能的變量。在分批發(fā)酵過程中，必須計算全過程的生產(chǎn)率。其時間不僅包括發(fā)酵時間，而且也包括把上一批料液從發(fā)酵罐放盡的時間、罐內(nèi)洗滌以及新鮮培養(yǎng)基放入和消毒所需要的時間。這種時間間隔有長有短，在制備酵母時可短至6h，在抗生素生產(chǎn)中可長達20h。圖8-5表示整個發(fā)酵周期的一種典型剖析。從起點到發(fā)酵重點以直線斜率表示總的生產(chǎn)率，通過原點并與生長曲線相切的相似直線表示最大的生產(chǎn)率，這是發(fā)生在一種細胞或者產(chǎn)物濃度比最大值小的時候?？偞蠼袝r間可以有方程式（8.17）計算;

(8.17)式中tT、tL和tD

指轉(zhuǎn)移、停滯和擱置（如對培養(yǎng)基分批轉(zhuǎn)料及消毒）的時間，X0和Xt是細胞最初和最終濃度。因此，總生產(chǎn)率P可以用方程式（8.18）來表示：(8.18)從這個方程式可以測定過程變化對總的生產(chǎn)率的影響。種子量較大時，X0增大，過程縮短。轉(zhuǎn)移或擱置時間減少，同樣也縮短周期，如應用一種促進生長的種子培養(yǎng)物可以消除停滯期。倘若發(fā)酵周期較短（如：18-48h),像面包酵母和谷氨酸生產(chǎn)，轉(zhuǎn)移時間對總的生產(chǎn)率來講顯得很重要。另一方面，對于長發(fā)酵周期來說（例如150-200h),如在抗生素生產(chǎn)中，幾小時的差別沒有很大意義。二.補料分批發(fā)酵（Fed-batchFermentation）1．補料分批發(fā)酵技術的含義在微生物分批發(fā)酵中，以某種方式向培養(yǎng)系統(tǒng)中補加一定物料的培養(yǎng)技術。通過向培養(yǎng)系統(tǒng)中補充物料，可以使培養(yǎng)液中的底物濃度較長時間地保持在一定范圍內(nèi)，即保證微生物的生長需要，又不造成不利影響，從而達到提高容量產(chǎn)率，產(chǎn)物濃度和得率的目的。2．補料分批發(fā)酵與分批發(fā)酵，連續(xù)發(fā)酵的區(qū)別？補料分批發(fā)酵是介于分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵之間的發(fā)酵形式；區(qū)別于分批發(fā)酵技術：由于補加物料，補料分批發(fā)酵系統(tǒng)不一再是封閉系統(tǒng)；區(qū)別于連續(xù)發(fā)酵技術：補料分批系統(tǒng)并不是連續(xù)地向外放出發(fā)酵液，罐內(nèi)的培養(yǎng)液體積（V）不再是個常數(shù)，而是隨時間（t）和物料流速（F）而變化的變量（變體積操作）。3．補料分批發(fā)酵技術的特點：由于基質(zhì)的緩慢補入，既滿足了微生物生長和產(chǎn)物合成的持續(xù)需要，又要避免了由于基質(zhì)過量引起的各種調(diào)控反應，從而能使產(chǎn)率獲得很大提高；補料技術本身的提高：少次多量——少量多次——流加——微機控制流加；整個發(fā)酵過程中不斷地調(diào)節(jié)補料率，維持各項物質(zhì)的供需平衡。4．補料分批發(fā)酵技術的類型：據(jù)補入物料的組成：*完全補料培養(yǎng)……補入成分完全的培養(yǎng)基*半分批補料培養(yǎng)……僅補人一種或幾種限制性營養(yǎng)成分據(jù)物料流入（Fin）和流出（Fex）發(fā)酵罐的速率，補料分批分為多種形式：*分批發(fā)酵（Fin=Fex=0）分為五種方式見下頁*……*連續(xù)發(fā)酵（Fin=Fex=0）（恒體積操作）據(jù)操作方式：*近似恒體積操作——讓補料的容量流速似近于蒸發(fā)速率，由于蒸發(fā)速率較慢，要補加高濃度溶液或直接補入液體或固體物料本身，滿足微生物的生長需要。*增加體積操作（Fex=0）——由于發(fā)酵液體積的不斷增大和產(chǎn)物積累造成生長抑制，為保持產(chǎn)量只能延長發(fā)酵時間。*重復循環(huán)操作（Fex=0）——為縮短發(fā)酵時間，定期從發(fā)酵罐中排出一定量的發(fā)酵液，以便能進一步補加物料，連續(xù)發(fā)酵——也是重復循環(huán)補料培養(yǎng)的一種極限情況（Fin=Fex=定值）。1.恒定流速補料；2.延長培養(yǎng)；3.指數(shù)流速補料5．補料分批發(fā)酵的適用范圍

1）高菌體濃度培養(yǎng)（高密度培養(yǎng)）系統(tǒng)；2）存在高濃度底物抑制的系統(tǒng)；如苯酚等，通過流加底物降低抑制。3）存在Crabtree效應的系統(tǒng)（酵母培養(yǎng)中，初糖過高，即使溶氧充足，也會產(chǎn)生乙醇，影響菌體得率）；4）受異化代謝物阻遏的系統(tǒng)（葡萄糖作碳源時，分解代謝物抑制異化代謝有關的酶合成）；5）利用營養(yǎng)突變體的系統(tǒng)；6）希望延長反應時間或補充損失水分的系統(tǒng)。Note:Crabtree效應：在酵母培養(yǎng)中，糖濃度過高，即使溶解氧很充足，也由糖生成乙醇，從而使菌體得率下降的現(xiàn)象。細菌Crabtree效應：細菌需氧培養(yǎng)中糖濃度過高生成副產(chǎn)物如醋酸等有機酸，抑制菌體生長。異化代謝物阻遏：指利用葡萄糖等容易被利用的碳源分批培養(yǎng)時，某種酶尤其是與異化代謝有關的酶的生物合成抑制的現(xiàn)象。也稱為分解代謝物抑制作用。6.流加物料的方式連續(xù)補料工藝中，有三種流加方式，1）恒定流速補料操作由于補料速度是定值，操作簡便，設備簡單，是最常用的流加方式，發(fā)酵液體積呈線性增長。由于在指數(shù)生長期，微生物的底物消耗也呈指數(shù)增加，恒定流速補料不能維持底物濃度不變。底物濃度會隨時間延長而逐步降低。2）恒定底物濃度操作恒定底物濃度補料操作又稱延長培養(yǎng)，是指用一定的方式連續(xù)補料，維持限制性底物濃度恒定的一種操作。3）指數(shù)流速操作指數(shù)流速補料操作能在短時間內(nèi)獲得最大量細胞，還可通過變更流速指數(shù)來控制比生長速率。7.補料分批發(fā)酵技術的評價補料分批培養(yǎng)是介于分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)之間的一種微生物細胞培養(yǎng)方式，它兼有兩種培養(yǎng)方式的優(yōu)點，并在某種程度克服了它們所存在的缺點。（見下頁表）二.補料分批發(fā)酵（Fed-batchFermentation）1．補料分批發(fā)酵技術的含義2．補料分批發(fā)酵與分批發(fā)酵，連續(xù)發(fā)酵的區(qū)別？3．補料分批發(fā)酵技術的特點：4．補料分批發(fā)酵技術的類型：5．補料分批發(fā)酵的適用范圍6.流加物料的方式

1）恒定流速補料操作

2）恒定底物濃度操作

3）指數(shù)流速操作7.補料分批發(fā)酵技術的評價8.補料的目的及其意義a.維持菌體正常代謝，推遲自溶期；b.延長產(chǎn)物合成期；c.可以維持較高的產(chǎn)物增長幅度；d.增加發(fā)酵液總體積；e.糾正異常發(fā)酵，控制pH，代謝方向。如：四環(huán)素發(fā)酵生產(chǎn)時：不補糖，周期72~96h，產(chǎn)率：5.5~7kU/ml

補糖時，周期120~130h，產(chǎn)率：10~12kU/ml9.補料的控制1）無反饋控制操作恒定流速補料和指數(shù)流速補料屬于此類，無反饋控制操作是補料流速不隨培養(yǎng)液變化而變化，人為地預先設定好。2）反饋控制操作恒定底物濃度操作屬于此類，反饋控制操作是通過傳感器直接測量培養(yǎng)物生長的特定參數(shù)，進而根據(jù)參數(shù)的變化來調(diào)節(jié)物料向培養(yǎng)物中補加的速率，使培養(yǎng)物參數(shù)保持恒值或最優(yōu)值。**反饋控制分為：直接法和間接法；a.直接法：以限制性底物（C，N，C/N）濃度為反饋控制參數(shù)；b.間接法：以DO，pH，呼吸商，排氣中CO2分壓，代謝產(chǎn)物濃度為反饋參數(shù)。**反饋控制系統(tǒng)的組成：傳感器，控制器，驅(qū)動器，補料系統(tǒng)等；10.不同培養(yǎng)基組成采用各種自動流加控制指標：工業(yè)上所用的培養(yǎng)基組成是各種各樣的，見下頁表。（二）補料分批發(fā)酵動力學1.補料分批發(fā)酵通常用下列方程式來定量地表示連續(xù)補料工藝的參數(shù)變化：線性補料：Fin(t)=α1t+β1

指數(shù)補料：Fin(t)=α2eβ2t

培養(yǎng)液體積：V（t）=V0+Fin·t

dV/dt=Fin(t)------------------------------------------(H1)α和β是常數(shù)，當用恒定物速補料時，α1=0，V0為起始培養(yǎng)液體積。如果：連續(xù)補料系統(tǒng)具有以下特征：（1）充分混合的反應器；（2）單一限制性底物；（3）平衡生長（4）恒定的得率系統(tǒng)（Y）；（5）符合Monod動力學方程。那么：菌體總量的瞬時變化可表示為：

d(VX)/dt=(dV/dt)X+(dX/dt)V=μXV--------------------(H2)從H1和H2可得到：

dX/dt=μX–(Fin/V)X=[(μ