1、組員：季宗德 郭秋香 張羨媛 趙琪 激活沉默基因以獲取新型微生物次級代謝產(chǎn)物的策略研究1 根據(jù)2007 年的統(tǒng)計，19812006 年間國際上所有批準(zhǔn)的藥物中，超過 50%來源于天然產(chǎn)物、天然產(chǎn)物的衍生物或模擬天然產(chǎn)物藥效基團(tuán)的合成化合物。 尤其是，目前臨床上使用的 60%的抗癌藥物和 70%的抗生素是天然產(chǎn)物或者基于天然產(chǎn)物研發(fā)的藥物。 從微生物中發(fā)現(xiàn)和分離新型化合物是發(fā)展新型藥物的主要方向之一. 一直以來，天然產(chǎn)物在人類疾病的治療過程中發(fā)揮著重要作用。2非常值得思考的問題： 隨著大量微生物次級代謝產(chǎn)物的分離,從自然界直接分離具有新結(jié)構(gòu)、新活性化合物變得越來越困難。 臨床上病原微生物的耐藥性

2、日益嚴(yán)重，艾滋病、禽流感等新型疾病不斷出現(xiàn)，我們亟需新的研發(fā)策略發(fā)現(xiàn)新型天然藥物。3 隨著基因組測序技術(shù)的飛速發(fā)展和微生物基因組大規(guī)模測序的廣泛開展，目前已測定了超過580個微生物的全基因組序列。中國科學(xué)家更是于 2009 年發(fā)起了“萬種微生物基因組”計劃，預(yù)計在3年內(nèi)完成1萬種微生物物種全基因組序列圖譜的構(gòu)建。4 在常規(guī)培養(yǎng)條件下，大多數(shù)生物合成基因簇不表達(dá)或以極低水平表達(dá)并在特定條件下被激活而表達(dá)活性產(chǎn)物，這些DNA序列稱為沉默生物合成基因簇。 沉默生物合成基因簇包含了多種結(jié)構(gòu)類型的微生物次級代謝產(chǎn)物編碼信息, 提供了豐富的合成生物學(xué)天然元件或模塊, 并為未來設(shè)計和構(gòu)建新型微生物次級代謝產(chǎn)

3、物生物合成途徑提供豐富的物質(zhì)基礎(chǔ)。 因此，如何利用現(xiàn)有的研究成果和技術(shù)手段進(jìn)行激活沉默基因以獲取新型微生物天然產(chǎn)物已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急.5天然生產(chǎn)菌表達(dá)水平低遺傳操作困難不容易規(guī)模培養(yǎng) 不能應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)生長緩慢沉默基因簇的異源表達(dá) 17 所謂基因的異源表達(dá)，就是將整個沉默合成基因簇克隆至質(zhì)粒、黏?；蛘呒?xì)菌人工染色體上利用異源宿主對其進(jìn)行表達(dá)，然后利用相關(guān)的分析技術(shù)對含有該克隆的表達(dá)宿主以及對照宿主的發(fā)酵液上清或者提取物進(jìn)行分析，最終對該代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定。8良好的異源表達(dá)宿主：鏈霉菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、假單胞菌和黃色粘球菌遺傳途徑的轉(zhuǎn)移功能基因表達(dá)蛋白活性對宿主細(xì)胞的影響

4、實現(xiàn)天然產(chǎn)物異源表達(dá)生物合成必須要解決以下幾個問題。10正調(diào)節(jié)基因進(jìn)行組成型表達(dá)負(fù)調(diào)節(jié)基因的中斷啟動子的替換轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控策略轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控策略 211正調(diào)節(jié)基因進(jìn)行組成型表達(dá)和負(fù)調(diào)節(jié)基因的中斷沉默基因簇中含有的正調(diào)節(jié)基因和負(fù)調(diào)節(jié)基因，控制次級代謝產(chǎn)物生物合成的開關(guān)。對正調(diào)節(jié)基因進(jìn)行組成型表達(dá)或?qū)ω?fù)調(diào)節(jié)基因進(jìn)行阻斷, 可以激活沉默基因簇, 獲得微生物新型次級代謝產(chǎn)物。Laureti 等對生二素鏈霉菌的不轉(zhuǎn)錄表達(dá)的途徑特異性正調(diào)節(jié)基因samR0484進(jìn)行組成型表達(dá)后，激活了沉默基因簇, 最終得到新型天然產(chǎn)物stambomycins，并可能成為抗腫瘤藥物開發(fā)的先導(dǎo)化合物。余貞等中斷變鉛青鏈霉菌的負(fù)調(diào)控

5、基因nsdA，最終合成放線紫紅素。12 通過染色體中DNA 序列不改變DNA 甲基化組蛋白修飾染色體重塑非編碼 RNA通過表觀遺傳調(diào)控策略 3將相關(guān)的染色質(zhì)構(gòu)型改變，激活沉默基因的表達(dá)1417 Henrikson JC,Hoover AR,Joyner PM,Cichewicz RH. A chemical epigenetics approach for engineering the in situ biosynthesis of a cryptic natural product from AspergillusnigerJ.Organic Biomolecular Chemistry,

6、2009,7(3):435-438.組蛋白去乙?；附M蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶nygeroneA155.核糖體工程策略24 Xu J, Wang Y, Xie SJ, et al. Streptomyces xiamenensis sp.nov., a novel actinomycete isolated from a mangrove sediment sampleJ.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2009, 59: 472- 476.夫西地酸抗性突變鏈霉素抗性突變利福平抗性突變new micr

7、eobial metabolites17激活沉默基因簇有時還需要宿主細(xì)胞提供合適的環(huán)境因素, 因此對宿主細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾改造也是必要的對一些模式微生物的基因組 DNA 進(jìn)行規(guī)?；瘎h減, 獲得適用于合成生物學(xué)等研究的、含最小基因組或縮減基因組的宿主細(xì)胞。例如5宿主細(xì)胞的遺傳修飾改造27 Chou WK, Fanizza I, Uchiyama T, et al. Genome mining in Streptomyces avermitilis: cloning and characterization of SAV_76, the synthase for a new sesquiterpen

8、e, avermitilol J.J Am Chem Soc, 2010, 132: 88508851.18 單菌多次級代謝產(chǎn)物（one strain-many compounds，OSMAC）策略，是通過改變培養(yǎng)培養(yǎng)基成分、通氣量及添加重金屬和酶抑制劑等發(fā)酵條件來獲取更多新型的次級代謝產(chǎn)物的方法缺點(diǎn)：OSMAC策略雖然有效，但是其工作量大，且最終能否獲得新的有活性的次級代謝產(chǎn)物并不確定6單菌多次級代謝產(chǎn)物策略21 Banskota AH,McAlpine JB,Srensen D,et al.Isolation and identification of three new 5-Alkenyl-3,3 (2H) - furanones from two streptomyces species using a genomic screening approachJ.The Journal of Antibiotics,2006,59(3):168