1、兒童傳染性單核細(xì)胞增多癥異型淋巴細(xì)胞及淋巴細(xì)胞亞群的研究摘 要目的： 探討兒童傳染性單核細(xì)胞增多癥異型淋巴細(xì)胞及淋巴細(xì)胞亞群的變化及其意義。方法：選取2016年12月-2017年12月青島大學(xué)附屬醫(yī)院兒科治療的41例傳染性單核細(xì)胞增多癥作為實(shí)驗(yàn)組，同期選取60例健康兒童作為對照組。所有受試者取空腹靜脈血，提取 DNA后采用熒光定量 PCR測定全血EBV的拷貝數(shù)，并進(jìn)行異型淋巴細(xì)胞的比值的測定及血細(xì)胞計(jì)數(shù)分析，采用流式細(xì)胞術(shù)測定淋巴細(xì)胞亞群（CD3+T淋巴細(xì)胞、 CD4+T淋巴細(xì)胞、 CD8+T淋巴細(xì)胞、 NK細(xì)胞、B細(xì)胞等），比較兩組的差異，進(jìn)行異型淋巴細(xì)胞與淋巴細(xì)胞亞群之間的相關(guān)性分析。采用

2、SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料采用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，符合正態(tài)分布及方差齊性的組間計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，不符合者采用非參數(shù)檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用百分?jǐn)?shù)（%）表示；組間計(jì)數(shù)資料采用 x2 檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)。P0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：（1）兩組兒童在性別、年齡、身高和體重上無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（ P0.05），但是實(shí)驗(yàn)組兒童的體溫較對照組兒童顯著升高（ P0.05）。（2）實(shí)驗(yàn)組兒童的異型淋巴細(xì)胞比值為（8.252.35）%，而對照組兒童的異型淋巴細(xì)胞比值為（0.820.25）%， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P0.05）。（3）實(shí)驗(yàn)組兒童 CD3+T

3、淋巴細(xì)胞比例和 CD8+T淋巴細(xì)胞比例較對照組兒童顯著升高（ P0.05）， 而 CD4+T淋巴細(xì)胞比例、 CD4+/ CD8+、 CD56+ CD16+比例較對照組兒童顯著降低（ P0.05）。（4）傳染性單核細(xì)胞增多癥異型淋巴細(xì)胞比例與白細(xì)胞總數(shù)（r=0.524,P=0.015）、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（r=0.661,P=0.01）呈正相關(guān)。（5）異型淋巴細(xì)胞與CD3+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（r=0.497,P=0.036）、CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（r=0.517,P=0.028）及CD56+ CD16+計(jì)數(shù)（r=0.511,P=0.030）呈正相關(guān)，與CD4+/CD8+（r=-0.527,P=0.025

4、）呈負(fù)相關(guān)；與CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（r=-0.449,P=0.061）無相關(guān)；異型淋巴細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞總數(shù)（r=0.627,P=0.009）、活化T細(xì)胞（r=0.612,P=0.007）呈正相關(guān)，與調(diào)節(jié)T細(xì)胞（r=-0.578,P=0.015）呈負(fù)相關(guān)，與活化B細(xì)胞（r=-0.249,P=0.319）無相關(guān)。（6） 實(shí)驗(yàn)組患兒EBV-DNA滴度與異型淋巴細(xì)胞（R=0.190,P=0.239）無相關(guān)。結(jié)論：（1）傳染性單核細(xì)胞增多癥兒童的異型淋巴細(xì)胞比值較正常兒童顯著增加。 （2）傳染性單核細(xì)胞增多癥兒童存在明顯T淋巴細(xì)胞免疫紊亂，CD8+T淋巴細(xì)胞明顯增多，CD4+T淋巴細(xì)胞比例明顯下降，C

5、D3+T淋巴細(xì)胞比例上升。 （3）傳染性單核細(xì)胞增多癥異型淋巴細(xì)胞的比例與外周血白細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞總數(shù)、T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、活化T細(xì)胞呈正相關(guān)，與CD3+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)以及CD4+ /CD8+可能存在相關(guān)。（4）傳染性單核細(xì)胞增多癥兒童外周血異型淋巴細(xì)胞數(shù)量可以提示機(jī)體免疫活化的程度。關(guān)鍵詞：EB病毒；傳染性單核細(xì)胞增多癥；異型淋巴細(xì)胞；淋巴細(xì)胞亞群 Study on atypical lymphocytes and lymphocyte subsets in children with infectious mononucleosisObjective: To expl

6、ore the change of heterosexual lymphocytes and lymphocyte subsets and their clinical value in infectious mononucieosis children.Methods: 41 cases of infectious mononucleosis in the Affiliated Hospital of Qiingdao University, December 2016 -2017 and December were selected as the experimental group, a

7、nd 60 healthy children were selected as the control group at the same time. All the subjects were taken fasting venous blood. After extracting DNA, the number of EBV in whole blood was measured by fluorescence quantitative PCR, and the ratio of the hetero lymphocyte and the blood cell count were mea

8、sured. The lymphocyte subsets (the proportion of CD3+T lymphocyte, the proportion of CD8+T lymphocyte in CD4+T lymphocyte proportion, the proportion of CD8+T lymphocyte in CD4+T) were measured by flow cytometry. CD56+ CD16+ ratio, etc., to compare the differences between the two groups, and to analy

9、ze the correlation between atypical lymphocytes and lymphocyte subsets. SPSS19.0 statistics software package is used for data processing. The measurement data were expressed by mean number of standard deviation (s). T test was used to compare the data between normal distribution and homogeneity of v

10、ariance, and non parameter test was used for the non conforming. Counting data were expressed by percentage (%); the count data between groups were tested by x2 test; correlation analysis was conducted by Spearman correlation test. The difference between P 0.05 was statistically significant.Results:

11、(1) there was no significant difference in sex, age, height and weight between the two groups (P 0.05), but the temperature of the children in the experimental group was significantly higher than that in the control group (P 0.05). (2) the ratio of the heterotype lymphocyte in the experimental group

12、 was (8.25 + 2.35)%, while the ratio of the heteromorphic lymphocyte in the control group was (0.82 + 0.25)%, and the difference was statistically significant (P 0.05). (3) the proportion of CD3+T lymphocyte and CD8+T lymphocyte in the experimental group was significantly higher than that in the con

13、trol group (P 0.05), while the proportion of CD4+T lymphocyte, CD4+/ CD8+ and CD56+ CD16+ were significantly lower than those of the control group (P 0.05). (4) the proportion of heterocyst in infectious mononucleosis was positively correlated with the total number of r=0.524 (P=0.015) and the count

14、 of lymphocyte (r=0.661, P=0.01). (5) heteromorphic lymphocytes were positively correlated with CD3+T lymphocyte count (r=0.497, P=0.036), CD8+T lymphocyte count (r=0.517, P=0.028) and CD56+ CD16+ count (r=0.511, P=0.030), and negatively correlated with CD4+/CD8+ (r=-0.527,); heteromorphic lymphatic

15、 finer The cells were positively correlated with the total number of T lymphocytes (r=0.627, P=0.009) and activated T cells (r=0.612, P=0.007), and negatively correlated with the regulation of T cells (r=-0.578, P=0.015), and was not related to the activation of B cells (r=-0.249, P=0.319). (6) ther

16、e was no correlation between EBV-DNA titer and R=0.190 (P=0.239) in the experimental group. Conclusion:(1) The ratio of heterotypic lymphocytes in children infected with infectious mononucleosis was significantly higher than that in normal children.(2) There was obvious T lymphocyte immune disorder

17、in EBV infected children with infectious mononucleosis, the increase of CD8+T lymphocyte, the decrease of CD4+T lymphocyte proportion and the increase of CD3+T lymphocyte proportion.(3) Proportion of infected mononucleosis heterocyst was positively correlated with the total number of peripheral whit

18、e blood cells, the total number of lymphocytes, the count of T lymphocyte, and the activation of T cells, and may be related to the count of CD3+T lymphocyte, the count of CD8+T lymphocyte and the CD4+ /CD8+.(4) The number of atypical lymphocytes in peripheral blood of children with infectious monon

19、ucleosis can indicate the extent of immune activation. Postgraduate student: Zhang Meirong (Pediatric Hematology)Directed by Professor Li XuerongKey words: Epstein-Barr Vires; Infectious Mononucleosis; Heterotypic Lymphocytes; Lymphocyte Subsets目 錄TOC o 1-3 h u HYPERLINK l _Toc14910 引 言 PAGEREF _Toc

20、14910 1第一章 研究對象與方法 HYPERLINK l _Toc31589 PAGEREF _Toc31589 3 HYPERLINK l _Toc13800 1.1 研究對象 PAGEREF _Toc13800 31. HYPERLINK l _Toc6374 2 診斷標(biāo)準(zhǔn) PAGEREF _Toc6374 31.2. HYPERLINK l _Toc21257 1 兒童傳染性單核細(xì)胞增多癥診斷要點(diǎn)： PAGEREF _Toc21257 31. HYPERLINK l _Toc27453 3 主要試劑及設(shè)備 PAGEREF _Toc27453 41. HYPERLINK l _Toc1

21、6119 3.1 主要試劑 PAGEREF _Toc16119 41. HYPERLINK l _Toc24120 3.2 主要設(shè)備 PAGEREF _Toc24120 41. HYPERLINK l _Toc22742 4 EBV-DNA的測定 PAGEREF _Toc22742 5 HYPERLINK l _Toc10878 1.4.1 血樣的處理 PAGEREF _Toc10878 5 HYPERLINK l _Toc7405 1.5 異型淋巴細(xì)胞的測定 PAGEREF _Toc7405 5 HYPERLINK l _Toc2077 1.6 淋巴細(xì)胞亞型的測定 PAGEREF _Toc2

22、077 61. HYPERLINK l _Toc21765 7 質(zhì)量控制 PAGEREF _Toc21765 61. HYPERLINK l _Toc274 8 統(tǒng)計(jì)處理 PAGEREF _Toc274 6第二章 HYPERLINK l _Toc18963 結(jié)果 PAGEREF _Toc18963 7 HYPERLINK l _Toc18421 2.1 實(shí)驗(yàn)組和對照組兒童一般臨床資料的比較 PAGEREF _Toc18421 7 HYPERLINK l _Toc14908 2.2 實(shí)驗(yàn)組和對照組兒童異型淋巴細(xì)胞比值的比較 PAGEREF _Toc14908 7 HYPERLINK l _Toc

23、11998 2.3 IM組和對照組兒童T淋巴細(xì)胞亞群的比較 PAGEREF _Toc11998 7 HYPERLINK l _Toc1351 2.4 實(shí)驗(yàn)組兒童異型淋巴細(xì)胞與白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的相關(guān)性分析 PAGEREF _Toc1351 8 HYPERLINK l _Toc24850 2.5 實(shí)驗(yàn)組異型淋巴細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)、T淋巴細(xì)胞總數(shù)、活化T細(xì)胞、活化B細(xì)胞的相關(guān)性分析 PAGEREF _Toc24850 8 HYPERLINK l _Toc31951 2.6 實(shí)驗(yàn)組EBV病毒DNA滴度與異型淋巴細(xì)胞的相關(guān)性分析 PAGEREF _Toc31951 9 HYPERLINK

24、l _Toc30632 第三章 討論10第四章 HYPERLINK l _Toc19103 結(jié)論 PAGEREF _Toc19103 14 HYPERLINK l _Toc15910 參考文獻(xiàn) PAGEREF _Toc15910 15 HYPERLINK l _Toc14713 綜 述 PAGEREF _Toc14713 18綜述 HYPERLINK l _Toc2699 參考文獻(xiàn) PAGEREF _Toc2699 26 HYPERLINK l _Toc12512 攻讀學(xué)位期間的研究成果 PAGEREF _Toc12512 29 HYPERLINK l _Toc19536 附錄或縮略詞表30

25、HYPERLINK l _Toc6502 致 謝31 HYPERLINK l _Toc20037 學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明 PAGEREF _Toc20037 32 HYPERLINK l _Toc4802 學(xué)位論文知識產(chǎn)權(quán)權(quán)屬聲明 PAGEREF _Toc4802 32引 言EB病毒（Epstein-Barr Vires，EBV）是一種嗜人類淋巴細(xì)胞的雙鏈DNA病毒，屬于皰疹病毒亞科，與大量惡性腫瘤有關(guān)聯(lián)，其潛伏和轉(zhuǎn)化的特征在疾病的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要的作用1。人類是EBV唯一的自然宿主，EB病毒DNA可存在于宿主細(xì)胞DNA內(nèi)外，前者以線狀DNA形式，而后者則以環(huán)狀游離體的形式。90%以上的人建立

26、了EBV終生潛伏狀態(tài)感染2。EBV主要通過唾液傳播，也可通過輸血和性傳播，被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)歸為I類致癌物質(zhì)。EBV有5種抗原成分，均能產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，其中VCA-IgM抗體出現(xiàn)較早，在數(shù)月內(nèi)消失，可作為近期感染的指標(biāo)，而VCA-IgG的出現(xiàn)晚于前者，可長期或者終身存在于機(jī)體中，因此不具有特異性。既往流行病學(xué)研究指出： 35歲兒童血清EBV陽性轉(zhuǎn)化率為80.7%100.0%；在青春期時(shí)血清EBV陽性轉(zhuǎn)化率可達(dá)100%。隨著時(shí)代的遷移，我國兒童原發(fā)性 EBV感染的年齡較20世紀(jì)后葉有所推后，但青少年的血清 EBV抗體陽性轉(zhuǎn)化率仍達(dá)90%3。EB病毒感染性疾病是國內(nèi)常見的感染病，主要侵犯兒童和青少

27、年。原發(fā)性EBV感染可引起所有臟器和系統(tǒng)的相關(guān)疾病，從而發(fā)生相應(yīng)的臨床癥狀。原發(fā)性 EBV感染的病情程度不一，0-3歲兒童多以隱性感染的形式存在，臨床表現(xiàn)不典型，而在學(xué)齡期及以上兒童或呈現(xiàn)為傳染性單核細(xì)胞增多癥（ Infectious mononucieosis IM）甚至某些危重性疾病，相關(guān)文獻(xiàn)指出EBV相關(guān)性噬血細(xì)胞綜合征（ EBV associated hemophagocytic lymphohistiocy- tosis， EBV- AHLH）、鼻咽癌等的發(fā)生都與EB病毒有密切的聯(lián)系。IM是一種感染EBV后出現(xiàn)的急性感染性疾病，是兒科常見的一種病毒性疾病，臨床癥狀復(fù)雜，主要侵犯兒童和

28、青少年4。目前認(rèn)為其發(fā)病的主要機(jī)制是EBV進(jìn)入口腔及咽部后，侵犯具有CD21受體的細(xì)胞，主要包括口腔上皮細(xì)胞、B、T淋巴細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞。B淋巴細(xì)胞受病毒感染后，其原有表面抗原遭到破壞、變性，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞的強(qiáng)烈免疫應(yīng)答，進(jìn)而轉(zhuǎn)變成細(xì)胞毒性T細(xì)胞（以CD8+T細(xì)胞為主，TCL）。TCL細(xì)胞是導(dǎo)致免疫病理損傷的重要角色，它可以殺傷感染的 B細(xì)胞，亦可侵犯許多組織器官而產(chǎn)生一系列 IM的各種臨床表現(xiàn)。因EBV自身的特點(diǎn)，外周血中可出現(xiàn)淋巴細(xì)胞增多及異型淋巴細(xì)胞（簡稱異淋），除此之外，臨床上尚可出現(xiàn)發(fā)熱、咽痛、淋巴結(jié)及肝臟、脾臟腫大等非特異性表現(xiàn)。隨年齡的不同，可表現(xiàn)有皮疹、腹痛、眼瞼浮腫等不同的

29、臨床表現(xiàn)形式，且多合并有多臟器損傷。因其表現(xiàn)形式的多樣及疾病的變異性，為臨床診斷造成一定的困難。傳染性單核細(xì)胞增多癥的診斷主要依據(jù)流行情況、典型臨床表現(xiàn)（發(fā)熱、咽痛、肝脾及淋巴結(jié)腫大）、實(shí)驗(yàn)室檢查主要有淋巴細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)升高及異淋、嗜異性凝集試驗(yàn)、EB病毒特異抗體（包括VCA-IgM、EA-TgG）和EBV-DNA檢測，其中異淋10%，其他檢驗(yàn)指標(biāo)陽性可作為臨床診斷的指標(biāo)。然而異淋并非該病所專有的表現(xiàn)，然而較于其他病原體感染，IM所致異淋升高程度更明顯。尤其是VCA-IgM陽性或急性期及恢復(fù)期雙份血清VCA-IgG抗體效價(jià)呈4倍以上增高是確診EBV急性感染最特異和最有診斷性的血清學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。EBV感

30、染亦可引發(fā)EB病毒相關(guān)性噬血細(xì)胞性淋巴組織細(xì)胞綜合征（EBV associated hemophagocytic lymphohistiocytosis， EBV- AHLH）。潛在的 EBV感染可使自然殺傷細(xì)胞及CTL的細(xì)胞毒作用降低，致使淋巴組織過度增生或進(jìn)展成重度慢性 EBV感染，進(jìn)而出現(xiàn)EBV- AHLH。EBV- AHLH預(yù)后不佳，病死率大大增加。同時(shí)EBV還是一種重要的腫瘤相關(guān)病毒。 EBV在所有重要的淋巴瘤中均有存在5，如 Burkitt淋巴瘤、經(jīng)典霍奇金淋巴瘤、 T淋巴細(xì)胞/自然殺傷細(xì)胞（NaturalKiller Cell， NKC）淋巴瘤、移植后淋巴組織增生性疾病（Post

31、 Transplant Lymphoproliferative Disorders， PTLD）等6。鼻咽癌（ Nasopharynx Cancer， NPC）是鼻咽腔頂部和側(cè)壁的非良性及交界性腫瘤，在我國較為高發(fā)，具有遺傳易感性，多發(fā)生于某些少數(shù)特定人群， EBV感染是 NPC的主要致病因素7。然而NPC 患者的正常鼻咽上皮細(xì)胞中幾乎無法檢測到EBV感染標(biāo)識，分析非成熟的唾液腺可能是 EBV 更有利的“溫床”8。 在胃淋巴上皮癌中可檢測出 EBV，在亞洲，EBV 相關(guān)胃癌（EBV associated GastricCarcinoma，EBVaGC）約占所有胃癌患者的近10%。有研究證實(shí)幾乎

32、所有的EBVaGC中EBER均呈陽性表現(xiàn)，表明 EBV 在GC的早期階段有重要意義。EBVaGC占所有 EBV 相關(guān)腫瘤死亡人數(shù)的 90%以上9。 EBV相關(guān)腫瘤的流行可影響世界1%的人口10。隨著對免疫學(xué)的研究進(jìn)展，EB病毒對機(jī)體免疫功能的影響成為大家熱議的話題。現(xiàn)有研究闡明，不論在控制原發(fā)性還是持續(xù)性感染中，細(xì)胞免疫都發(fā)揮了不可或缺的作用。 特別是EBV感染導(dǎo)致的細(xì)胞免疫功能不足及缺乏是發(fā)生腫瘤的首要原因 11，12。細(xì)胞免疫在 EB病毒感染中起關(guān)鍵性作用，該功能下降將導(dǎo)致 EB病毒活化。本課題通過測定 EBV感染傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒的外周血異型淋巴細(xì)胞和淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)值及其之間的關(guān)

33、系，以探討 EB病毒感染傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒異型淋巴細(xì)胞及淋巴細(xì)胞亞群的變化及其參考價(jià)值、臨床意義。研究對象與方法1.1 研究對象選取2016年12月-2017年12月青島大學(xué)附屬醫(yī)院兒科治療的41例EB 病毒感染兒童（傳染性單核細(xì)胞增多癥）作為實(shí)驗(yàn)組。其中男童24（58.54%）例、女童17例（41.46%）；男女比例為1.4:1；年齡114歲，平均年齡（5.223.34）歲；身高81165 cm，平均身高（113.2418.42）cm，體重941kg，平均體重為（21.3512.84）kg；診斷時(shí)病程26天，平均病程（3.270.52）天；入院時(shí)體溫38.440.3，平均入院溫度（39

34、.620.76）。同期選取青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院健康體檢中心60例健康兒童作為對照組，其中男童36（60.00%）例、女童24（40.00%）例；年齡114歲，平均年齡（4.972.84）歲；身高85168 cm，平均身高（115.4721.35）cm，體重1042kg，平均體重為（22.4113.32）kg；體溫35.837.2，平均溫度（36.850.32）。1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)1.2.1 兒童傳染性單核細(xì)胞增多癥診斷要點(diǎn)：兒童傳染性單核細(xì)胞增多癥診斷標(biāo)準(zhǔn)13如下：（1）.臨床診斷病例：滿足下列I中的任意3項(xiàng)及中第4條（2）.實(shí)驗(yàn)室確診病例：滿足下列I中的任意3項(xiàng)及中第1-3條中任意一條I臨床

35、癥狀：1.發(fā)熱； 2. 咽峽炎；3. 頸部淋巴結(jié)腫大；4. 肝臟腫大；5脾臟腫大；6眼瞼水腫.實(shí)驗(yàn)室檢查抗CA-IgM和抗CA-IgG抗體陽性，且抗NA-IgG陰性；抗CA-IgM陰性，但抗CA-IgG抗體陽性，且為低親和力抗體；雙份血清抗CA-IgG抗體滴度4倍以上升高；外周血異型淋巴細(xì)胞比例10%。1.3 主要試劑及設(shè)備1.3.1 主要試劑試劑名稱生產(chǎn)廠家淋巴細(xì)胞分離液瑞典Amersham Bioseiences公司瑞氏-姬姆薩染色試劑上海貝萊生物技術(shù)有限公司DNA 提取液生工生物工程（上海）股份有限公司實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒大連TaKaRa 公司紅細(xì)胞裂解液OptiLyse C美國Be

36、ckman Coulter公司FITC-CD3+鼠抗人單克隆抗體法國IMMUNOTECH 公司FITC-CD4+鼠抗人單克隆抗體法國IMMUNOTECH 公司FITC-CD8+鼠抗人單克隆抗體法國IMMUNOTECH 公司FITC-CD16+/ CD56+鼠抗人單克隆抗體法國IMMUNOTECH 公司1.3.2 主要設(shè)備設(shè)備名稱生產(chǎn)廠家-20低溫冰箱日本西門子公司FC500MCL定量PCR儀美國Bekerman Counter公司BX30 高分辨顯微鏡美國Olympus公司FC 500 MCL流式細(xì)胞分析儀Beckerman Counter公司CFX96定量PCR儀美國BIORAD公司5415

37、D常溫離心機(jī)德國Eppendorf公司移液槍德國Eppendorf公司邁瑞-BC-5500血細(xì)胞分析儀深圳邁瑞生物醫(yī)療電子有限公司研究對象與方法1.4 EBV-DNA的測定所有受試者取空腹靜脈抗凝血提取白細(xì)胞，提取DNA后采用熒光PCR測定EBV的拷貝數(shù)。1.4.1 血樣的處理 使用無菌注射器采集清晨空腹外周靜脈血2 mL，抗凝劑混合液與生理鹽水進(jìn)行混合搖勻，采用熒光定量 PCR方法，將采集的血樣，按照生產(chǎn)廠家的操作指南書嚴(yán)格進(jìn)行處理和 DNA提取，并加入26 L的 DNA檢測體系中，將反應(yīng)管入樣品槽中，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增、檢測：50預(yù)反應(yīng)2 min，94預(yù)變性5 min，每個(gè)循環(huán)包括9410

38、s，6040 s，共進(jìn)行50個(gè)循環(huán)，待離心結(jié)束后在保存?zhèn)溆茫洵h(huán)境溫度要求為零下20。擴(kuò)增參考范圍為病毒拷貝數(shù)01000拷貝數(shù)/ ml，拷貝數(shù)0.05），但是實(shí)驗(yàn)組兒童的體溫較對照組兒童顯著升高（P0.05）。具體結(jié)果見表2.。表2. 實(shí)驗(yàn)組和對照組兒童一般臨床資料的比較臨床資料實(shí)驗(yàn)組（n=41）對照組（n=60）t/ x2值P值性別（n/%） 男 24（58.54）36（60.00）0.1350.714 女 17（41.46）24（40.00）年齡（y）5.223.344.972.840.1000.921身高（cm）113.2418.42115.4721.350.6130.543體重（kg）

39、21.3512.8422.4113.320.4440.659體溫（）39.620.7636.850.3226.0200.0002.2 實(shí)驗(yàn)組和對照組兒童異型淋巴細(xì)胞比值的比較實(shí)驗(yàn)組兒童的異型淋巴細(xì)胞比值為（8.252.35）%，而對照組兒童的異型淋巴細(xì)胞比值為（0.820.25）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=21.075，P0.001）。對照組中所有兒童的異型淋巴細(xì)胞比值均2%，實(shí)驗(yàn)組兒童的異型淋巴細(xì)胞比值10 %有19（46.34%）例。2.3 IM組和對照組兒童T淋巴細(xì)胞亞群的比較實(shí)驗(yàn)組兒童和對照組兒童CD3+T淋巴細(xì)胞、CD4+ T淋巴細(xì)胞、CD8+ T淋巴細(xì)胞、CD4+/CD8+、NK細(xì)

40、胞差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01），與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組兒童CD3+ T淋巴細(xì)胞和CD8+ T淋巴細(xì)胞明顯增高（P0.01），而CD4+ T淋巴細(xì)胞、CD4+/CD8+、NK細(xì)胞明顯降低（P0.01）。如表3所示。表3. 實(shí)驗(yàn)組和對照組兒童T淋巴細(xì)胞亞群的比較T淋巴細(xì)胞亞群IM組（n=41）對照組（n=60）t值P值CD3+ T淋巴細(xì)胞（%）75.2111.2767.518.594.2090.01CD4+ T淋巴細(xì)胞（%）29.367.1538.486.257.4390.01CD8+ T淋巴細(xì)胞（%）42.757.8224.676.7213.5820.01CD4+ / CD8+0.670.2

41、51.540.2817.9530.01NK細(xì)胞（%）6.722.2713.323.1213.2500.012.4 實(shí)驗(yàn)組兒童異型淋巴細(xì)胞與白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的相關(guān)性分析 實(shí)驗(yàn)組異型淋巴細(xì)胞與白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)相關(guān)性分析如下：異型淋巴細(xì)胞與白細(xì)胞計(jì)數(shù)（r=0.524,P=0.015）及淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（r=0.661,P=0.001）呈正相關(guān)，如表4所示。表4. 實(shí)驗(yàn)組兒童異型淋巴細(xì)胞與白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的相關(guān)性分析白細(xì)胞數(shù)/淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)回歸系數(shù)（r）P值白細(xì)胞計(jì)數(shù)0.5240.015淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)0.6610.0012.5 實(shí)驗(yàn)組異型淋巴細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)、T淋巴細(xì)胞總數(shù)、活

42、化T細(xì)胞、活化B細(xì)胞的相關(guān)性分析 結(jié)果顯示，異型淋巴細(xì)胞與CD3+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（r=0.497,P=0.036）、CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（r=0.517,P=0.028）及NK細(xì)胞計(jì)數(shù)（r=0.511,P=0.030）呈正相關(guān)，與CD4+/CD8+（r=-0.527,P=0.025）呈負(fù)相關(guān)；與CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（r=-0.449,P=0.061）無相關(guān)；異型淋巴細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞總數(shù)（r=0.627,P=0.009）、活化T細(xì)胞（r=0.612,P=0.007）呈正相關(guān)，與調(diào)節(jié)T細(xì)胞（r=-0.578,P=0.015）呈負(fù)相關(guān)，與活化B細(xì)胞（r=-0.249,P=0.319）無相關(guān)。如表

43、5所示。 表5. 異型淋巴細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)、T淋巴細(xì)胞總數(shù)、活化T細(xì)胞、活化B細(xì)胞的相關(guān)性分析淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)/T淋巴細(xì)胞總數(shù)回歸系數(shù)（r）P值CD3+計(jì)數(shù)0.4970.036CD4+計(jì)數(shù)-0.4490.061CD8+計(jì)數(shù)0.5170.028CD4+/ CD8+-0.5270.025NK細(xì)胞計(jì)數(shù)0.5110.030T淋巴細(xì)胞總數(shù)0.6270.009活化T細(xì)胞0.6120.007調(diào)節(jié)T細(xì)胞-0.5780.015活化B細(xì)胞-0.2490.3192.6 實(shí)驗(yàn)組EBV病毒DNA滴度與異型淋巴細(xì)胞的相關(guān)性分析數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組患兒EBV-DNA滴度與異型淋巴細(xì)胞（R=0.190,P=0.239

44、）無相關(guān)。如圖1所示。圖1 實(shí)驗(yàn)組EB病毒DNA滴度與異型淋巴細(xì)胞的相關(guān)性 討 論EBV為一種雙鏈DNA病毒，屬于皰疹病毒gama亞科，具有潛伏和轉(zhuǎn)化的特征，病毒大量存在于唾液腺及唾液中，因此口-口傳播是重要的傳播途徑，亦不能除外飛沫傳播及經(jīng)輸血傳播。 EBV在人群的感染率超過95%。 EBV感染可引起機(jī)體多臟器和組織的相關(guān)疾病或臨床表現(xiàn)。相關(guān)研究指出，EBV還是一種重要的腫瘤相關(guān)病毒，與Burkittlympoma(伯基特淋巴瘤)、鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤、 T/自然殺傷（ NK）細(xì)胞淋巴瘤14等的發(fā)生相關(guān)， EBV相關(guān)腫瘤的流行可影響世界1%的人口15。伴隨經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會(huì)的進(jìn)步，我國兒童原發(fā)性

45、 EBV感染的年齡較20世紀(jì)后葉已有所推后，但年長兒的血清 EBV抗體陽性轉(zhuǎn)化率仍高達(dá)90%16，可直接導(dǎo)致傳染性單核細(xì)胞增多癥的發(fā)生，繼續(xù)進(jìn)展還可導(dǎo)致惡性疾??；相關(guān)文獻(xiàn)指出，EBV感染與某些自身免疫性疾病有關(guān)聯(lián)17。EB病毒是一種嗜淋巴細(xì)胞病毒，近4/5的傳染性單核細(xì)胞增多癥患者血清淋巴細(xì)胞絕對值增多，且伴隨著異型淋巴細(xì)胞數(shù)目的增多。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，異型淋巴細(xì)胞與白細(xì)胞計(jì)數(shù)（r=0.524,P=0.015）及淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（r=0.661,P=0.001）呈正相關(guān)，亦證實(shí)了這一觀點(diǎn)。急性傳染性單核細(xì)胞增多癥除了常有發(fā)熱、咽痛、淋巴結(jié)腫大等典型臨床表現(xiàn)外，常伴隨異型淋巴細(xì)胞的升高。有研究證實(shí)，血

46、清異型淋巴細(xì)胞的高低可間接評估病情的嚴(yán)重程度，因其大部分是免疫過程中被激活的 T細(xì)胞18，19，因異型淋巴細(xì)胞在某種情況下映射出機(jī)體與病毒的抗?fàn)幥闆r。本實(shí)驗(yàn)研究表明，實(shí)驗(yàn)組兒童的異型淋巴細(xì)胞比值為（8.252.35）%，較對照組兒童顯著升高（ P0.05），因IM早期臨床癥狀與急性上呼吸道感染及其他傳染病早期癥狀相似，易造成漏診或誤診，給臨床診斷造成一定困難，因此異型淋巴細(xì)胞的檢測是實(shí)驗(yàn)室輔助診斷IM重要方法，同時(shí)鑒于淋巴細(xì)胞及異型淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)簡單易行，低廉快捷，適用于廣大的基層醫(yī)院，可作為初步快速診斷EB病毒感染的輔助性檢測指標(biāo)。此外，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)小兒其他病毒感染如柯薩奇病毒、巨細(xì)胞病毒等

47、其他病原體,也會(huì)出現(xiàn)外周異型淋巴細(xì)胞增高20，有的藥物也會(huì)引發(fā)淋巴細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)，由此可見，異型淋巴細(xì)胞增高尚不能作為 EBV感染的特異指標(biāo)。隨著不典型IM病例增多，異型淋巴細(xì)胞檢查也并非都是增高的。本研究結(jié)果顯示，41例IM患兒中，異型淋巴細(xì)胞10%的比例占總體的46%，而異型淋巴細(xì)胞10%的比例超過總體的50%，其中以6%-10%為多，說明并非所有IM患兒的異型淋巴細(xì)胞比值都大于10%， 進(jìn)一步佐證了上述觀點(diǎn)，這為臨床相關(guān)疾病特別是傳染性單核細(xì)胞增多癥的診斷提供一定的支持，減小了誤診、漏診的可能性。異型淋巴細(xì)胞并非是傳染性單核細(xì)胞增多癥所特有的表現(xiàn)，但較于其他病原體感染，EB病毒感染者升高

48、程度更明顯21。異型淋巴細(xì)胞的升高具有時(shí)間依賴性，一般在發(fā)病初期出現(xiàn)，1周后逐漸增多，第14-20天達(dá)到極值，以后逐漸下降，持續(xù)約1-2月。有研究證實(shí)，就同一個(gè)體而言，異型淋巴細(xì)胞比率居高不下，可作為評估病情險(xiǎn)惡程度的指征之一，有繼發(fā)淋巴細(xì)胞白血病或惡性組織增生癥的可能22。有資料23顯示，除外個(gè)體差異，EBV復(fù)制水平與異型淋巴細(xì)胞的比值成高度正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒EBV-DNA載量與異型淋巴細(xì)胞比例無相關(guān)（R=0.190,P=0.239），與上述結(jié)論不同，可能與實(shí)驗(yàn)中異型淋巴細(xì)胞檢測時(shí)易出現(xiàn)人工誤差、準(zhǔn)確率低以及選取樣本量太小等因素有關(guān)。而熒光定量PCR檢測EBV-

49、DNA可用于傳染性單核細(xì)胞增多癥早期診斷，EBV-DNA拷貝數(shù)檢測可反映體內(nèi)病毒復(fù)制情況，有利于病情評估，對傳染性單核細(xì)胞增多癥的防治具有重要臨床意義。鑒于此，對臨床上早期出現(xiàn)發(fā)熱、肝脾腫大的患兒在常規(guī)進(jìn)行異型淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、血細(xì)胞計(jì)數(shù)分析的同時(shí)， 測定EB病毒DNA載量，可能利于早期發(fā)現(xiàn)EB病毒感染，從而進(jìn)行早期治療，避免誤診，給病人造成不必要的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。EBV感染機(jī)體后首先感染 B淋巴細(xì)胞，在其感染的 B細(xì)胞內(nèi)大量增殖，進(jìn)而造成全身淋巴組織及含淋巴細(xì)胞的組織受累，誘導(dǎo)T細(xì)胞的活化、增殖，可引起機(jī)體免疫應(yīng)答功能紊亂。而本研究結(jié)果顯示，異型淋巴細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞總數(shù)（r=0.627,P=0.

50、009）、活化T細(xì)胞（r=0.612,P=0.007）呈正相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)了該觀點(diǎn)。 CD4+ T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生輔助細(xì)胞1型（ Th1）的細(xì)胞因子，進(jìn)而引起 NK細(xì)胞和 CD8+ T淋巴細(xì)胞的活化，誘導(dǎo) EB病毒特異性細(xì)胞毒 T淋巴細(xì)胞(主要是CD8+T細(xì)胞，TCL)的產(chǎn)生，受到感染的B細(xì)胞刺激后CD8+T 細(xì)胞的進(jìn)行性增殖，這是異型淋巴細(xì)胞比例增加的主要因素。異型淋巴細(xì)胞是CD8+的T淋巴細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞既可作為細(xì)胞毒性T細(xì)胞（Tc），對特定的目標(biāo)細(xì)胞發(fā)揮殺傷的作用，也可作為抑制性T細(xì)胞（TS），抑制相關(guān)目標(biāo)細(xì)胞作用的發(fā)揮。上述兩種T細(xì)胞在對機(jī)體起著相互制約和相互調(diào)整的作用，機(jī)體的免疫效應(yīng)

51、，可能是二者相對活性的綜合體現(xiàn)。研究提示24IM患兒存在免疫調(diào)節(jié)功能紊亂，這樣會(huì)大大降低機(jī)體抗病毒能力，因此IM患兒病情容易加重或出現(xiàn)惡化。在機(jī)體維持免疫自穩(wěn)、防止自身免疫發(fā)生過程中有一種細(xì)胞起著決定性作用，它就是調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞（又稱Treg細(xì)胞）。 近年來相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道： CD4 CD25 CDl27 是Treg細(xì)胞的新標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒異型淋巴細(xì)胞與活化T細(xì)胞（r=0.612,P=0.007）呈正相關(guān)，與調(diào)節(jié)T細(xì)胞（r=-0.578,P=0.015）呈負(fù)相關(guān)，與活化B細(xì)胞（r=-0.249,P=0.319）無相關(guān)，與上述觀點(diǎn)一致。調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞的降低提示機(jī)體維持免

52、疫自穩(wěn)、防止自身免疫的功能降低，異型淋巴細(xì)胞代表著T淋巴細(xì)胞的活化，而異型淋巴細(xì)胞的數(shù)量可提示機(jī)體免疫活化及免疫紊亂的程度。T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量及 B細(xì)胞數(shù)量始終保持一定的正常比例是人體健康的重要評估標(biāo)準(zhǔn)。人體感染后，特別是病毒感染， 淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量和比例易受到影響，出現(xiàn)明顯減低或增高，引起患者的免疫調(diào)節(jié)功能紊亂。IM是EB病毒感染性疾病，因此淋巴細(xì)胞亞群的檢測在IM患兒中具有重要臨床意義。在 EBV感染的初期， EBV特異性 CD8 T細(xì)胞數(shù)量及活性迅速增加，且具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒作用，其能快速的吞噬和消滅 EB病毒感染的 B淋巴細(xì)胞，僅剩少量的 EB病毒在永生 B細(xì)胞內(nèi)低水平復(fù)制，因此機(jī)體可

53、以建立終生感染。不僅如此，EB病毒感染者的恢復(fù)，還需要整體的系統(tǒng)調(diào)節(jié)。于此同時(shí)，CD4 T細(xì)胞也參與細(xì)胞免疫反應(yīng)的調(diào)控，其主要是通過分泌多種細(xì)胞因子這一途徑實(shí)現(xiàn)的，B、T細(xì)胞的交互作用致使臨床表現(xiàn)逐漸減輕、甚至消失25。由此來看細(xì)胞免疫在EBV感染中可能發(fā)揮相當(dāng)重要的影響。有臨床研究 26 27指出，EBV感染兒童的CD3 T淋巴細(xì)胞輕度增高，CD4 T淋巴細(xì)胞明顯下降，而CD8 T淋巴細(xì)胞明顯上升，二者比值下降明顯。楊素紅28 及任彥等29也印證了這一觀點(diǎn)，并指出CD4 T淋巴細(xì)胞明顯下降，是造成 CD4+/CD8+T 淋巴細(xì)胞比值降低的原因。本研究結(jié)果顯示，相較于對照組，傳染性單核細(xì)胞增多

54、癥患兒CD3+ T淋巴細(xì)胞和CD8+ T淋巴細(xì)胞明顯升高（P0.01），而CD4+ T淋巴細(xì)胞、CD4+/CD8+、NK細(xì)胞則顯著降低（P0.01），表明傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒存在機(jī)體免疫功能的失衡，與上述研究結(jié)果基本一致。大量研究顯示，免疫水平的高低可以作為判斷疾病嚴(yán)重程度和評價(jià)治療效果的參考指標(biāo)30,31,32。近期研究顯示，在機(jī)體抗腫瘤免疫過程中， T淋巴細(xì)胞起到關(guān)鍵作用，一方面 T淋巴細(xì)胞亞群可代表機(jī)體細(xì)胞免疫狀態(tài)， 而另一方面機(jī)體的免疫功能水平可由淋巴細(xì)胞的數(shù)量體現(xiàn)，促進(jìn)效應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮免疫作用的是 CD4， CD8升高代表免疫抑制作用強(qiáng)，臨床上細(xì)胞免疫指標(biāo)可由 CD4/ CD8的水平

55、來指示33,34。因此，加強(qiáng)傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒細(xì)胞免疫功能的監(jiān)測、進(jìn)行異型淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)及淋巴細(xì)胞亞群的檢測方便患兒早期診斷，以及對疾病嚴(yán)重程度、治療效果作出更好的評估，對患兒改善預(yù)后提供很大的幫助。有文獻(xiàn)指出，異型淋巴細(xì)胞的增高可提示免疫功能的變化35-38。當(dāng)CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞異常表達(dá)時(shí)，CD4+/CD8+比值顯著降低，亦可導(dǎo)致機(jī)體中免疫球蛋白的濃度的減少39，其比例的降低與免疫系統(tǒng)損傷的程度相關(guān) 40。一般認(rèn)為比值下降或小于1提示機(jī)體的細(xì)胞免疫功能調(diào)節(jié)異常41。本實(shí)驗(yàn)顯示，傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒異型淋巴細(xì)胞比例增高，且異型淋巴細(xì)胞與CD3+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（r=0

56、.497,P=0.036）、CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（r=0.517,P=0.028）及NK細(xì)胞計(jì)數(shù)（r=0.511,P=0.030）呈正相關(guān)，與CD4+/CD8+（r=-0.527,P=0.025）呈負(fù)相關(guān)；與CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（r=-0.449,P=0.061）無相關(guān)，異型淋巴細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞總數(shù)呈正相關(guān)（r=0.627,P=0.009）。由此可以看出，當(dāng)異型淋巴細(xì)胞比例出現(xiàn)增多時(shí), 患者的T淋巴細(xì)胞亞群檢測表明了其T淋巴細(xì)胞免疫功能會(huì)出現(xiàn)不足或缺乏, 說明傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒存在機(jī)體免疫功能的紊亂，因此檢測異型淋巴細(xì)胞及淋巴細(xì)胞亞群為疾病診斷、治療和評估提供了強(qiáng)有力的依據(jù)，在臨床工

57、作中,對于傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒的治療，除了積極控制病毒感染外,聯(lián)合使用免疫調(diào)節(jié)藥物，應(yīng)可利于患兒病情恢復(fù)。這些數(shù)據(jù)表明傳染性單核細(xì)胞患兒細(xì)胞免疫的明顯降低可能與異型淋巴細(xì)胞水平存在某種相關(guān)性，異型淋巴細(xì)胞的數(shù)量可提示機(jī)體免疫活化的程度。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)闡述了傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒異型淋巴細(xì)胞與淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性，證實(shí)了異型淋巴細(xì)胞及淋巴細(xì)胞亞群的檢測在傳染性單核細(xì)胞增多癥診斷中的價(jià)值，以及傳染性單核細(xì)胞增多癥兒童外周血異型淋巴細(xì)胞數(shù)量可以提示機(jī)體免疫活化的程度。并進(jìn)一步證實(shí)了EBV感染傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒存在嚴(yán)重的細(xì)胞免疫功能紊亂，具有一定的實(shí)用性及創(chuàng)新性。這為臨床更好的診斷傳染性

58、單核細(xì)胞增多癥提供了重要的輔助檢測指標(biāo)，對檢測淋巴細(xì)胞亞群以評估機(jī)體免疫功能狀況、疾病嚴(yán)重度及預(yù)后判斷提供更有力的支持。結(jié) 論（1）傳染性單核細(xì)胞增多癥兒童的異型淋巴細(xì)胞比值較正常兒童顯著增加。 （2）傳染性單核細(xì)胞增多癥兒童存在明顯T淋巴細(xì)胞免疫紊亂，CD8+T淋巴細(xì)胞明顯增多，CD4+T淋巴細(xì)胞比例明顯下降，CD3+T淋巴細(xì)胞比例上升。（3） 傳染性單核細(xì)胞增多癥異型淋巴細(xì)胞的比例與外周血白細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞總數(shù)、T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、活化T細(xì)胞呈正相關(guān)，與CD3+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)以及CD4+ /CD8+可能存在相關(guān)。（4）傳染性單核細(xì)胞增多癥兒童外周血異型淋巴細(xì)胞數(shù)量可以

59、提示機(jī)體免疫活化的程度。參考文獻(xiàn)Yamamoto M，Baha H，Toh Y，et al. Pentoned lavage CEA/CA125 prognostic factor for gastric cancer patientsJ. J Cancer Res Clin，2007，133（7）：471-473. Macsween KF，Cranford DH. Epstein-Barr Virus-recent advancesJ. Lancet Infect Dis，2003，3（3）：131-140. Gulley ML，Tang W. Laboratory assays for E

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