1、革蘭氏染色實驗革蘭氏染色(Gram Staining )是用來鑒別 細(xì)菌的一種方法： 這種染色法利用細(xì)菌細(xì)胞壁上的生物化學(xué)性質(zhì)不同,可將細(xì)菌分 成兩類，即革蘭氏陽性(Gram Positive )與革蘭氏陰性(Gram Negative )。(這種染色法是由一位丹麥醫(yī)生 漢斯克里斯蒂安革 蘭于1884年所發(fā)明)。未經(jīng)染色之細(xì)菌，由于其與周圍環(huán)境折光率差別甚小，故在 顯微鏡下極難觀察。染色后細(xì)菌與環(huán)境形成鮮明對比，可以清楚 地觀察到細(xì)菌的形態(tài)、排列及某些結(jié)構(gòu)特征，而用以分類鑒定。陽性紫色，陰性紅色革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌：革蘭氏陽性菌： 葡萄球菌屬(主要是金黃色葡萄球菌、表皮葡 萄球菌等)、鏈

2、毯菌屬(肺炎鏈球菌、草綠色鏈球菌、腸球菌等)、 白喉桿菌、炭疽桿菌、破傷風(fēng)桿菌、蠟樣芽抱桿菌等，其中，金黃 色葡萄球菌、腸球菌等為臨床重要的病原菌。革蘭氏陰性菌：埃希氏菌屬、枸椽酸菌屬、假單胞菌屬（綠膿桿 菌等）、莫拉菌屬（卡他莫拉菌等）、奈瑟菌屬（淋球菌、腦膜炎 雙球菌等）、不動桿菌屬（鮑曼不動桿菌、羅菲不動桿菌等）、克 雷伯菌屬（主要是肺炎克雷伯桿菌）、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬（痢 疾桿菌等）、黃桿菌屬、變形桿菌屬、軍團(tuán)菌屬、耶爾森菌屬、嗜 血桿菌屬（杜克雷嗜血桿菌、流感嗜血桿菌等）、產(chǎn)氣桿菌屬、霍 亂弧菌、陰溝腸桿菌等。革蘭氏陰性菌在院內(nèi)感染中的細(xì)菌感染中 占了大約65%且大多菌株容易對抗

3、菌藥物耐藥，產(chǎn)生“新德里金 屬酶 （NDM-1的絕大多數(shù)細(xì)菌都是革蘭氏陰性菌（主要是大腸 桿菌、鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯桿菌）。革蘭氏陽性菌和 革蘭氏陰性菌是利用革蘭氏染色法 來鑒別的兩 大類細(xì)菌。大多數(shù)化膿性球菌都屬于革蘭氏陽性菌，它們能產(chǎn)生外毒 素使人致病，而大多數(shù)腸道菌多屬于革蘭氏陰性菌，它們產(chǎn)生內(nèi)毒素， 靠內(nèi)毒素使人致病。細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)包括 細(xì)胞壁和原生質(zhì)體兩部分。原生質(zhì)體位于細(xì) 胞壁內(nèi)，包括細(xì)胞膜（細(xì)胞質(zhì)膜）、細(xì)胞質(zhì)、核質(zhì)和內(nèi)含物。另外細(xì) 胞還含有有些特殊結(jié)構(gòu)，主要有 莢膜、芽抱、鞭毛和菌毛等4種。.細(xì)胞壁革蘭氏染色的機(jī)理主要是抓住了革蘭氏陽性細(xì)菌與陰性細(xì)菌在細(xì) 胞壁的

4、結(jié)構(gòu)與組成上的不同，具體比較見下表：進(jìn)一步的，革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖和包括磷壁酸 的酸性多糖構(gòu)成，細(xì)胞表面整體帶負(fù)電的部分原因就是因為磷壁酸帶 負(fù)電。同時，磷壁酸賦予了革蘭氏陽性細(xì)菌以特異的表面抗原。總的說來，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致了染料吸收的差異，也導(dǎo)致了 很多生理特性的不同。.非細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)性所里蘭HUH性羽靛至蘭陽H歸七帚2-3外空層8導(dǎo)攵生層多丘，下珊仔單位交項, 網(wǎng)融密的單交1加,丁單飛工軍，網(wǎng)站跖桿 格司如帆倬云私不孝平第交組成僻靜也現(xiàn)X+手丁無褓!的圖內(nèi)或完無天海有無而里白屏也酬用無-fl而在非細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中，革蘭氏陽性細(xì)菌和陰性細(xì)菌主要的區(qū)別在于 是否有芽抱和鞭毛與性菌毛

5、的不同上。芽泡是某些細(xì)菌菌體發(fā)育過程中的一個階段，在一定的環(huán)境條件下由于細(xì)胞質(zhì)和核質(zhì)的濃縮凝集形成的一種特殊結(jié)構(gòu)。革蘭氏陰性細(xì)菌中沒有會形成芽抱的菌種，而部分革蘭氏陽性細(xì)菌可以。另外，在鞭毛和性菌毛方面兩者也有不同。鞭毛和性菌毛都是附 屬物。某些細(xì)菌表面伸出的細(xì)長、波曲的附屬物稱為鞭毛。革蘭氏陽 性細(xì)菌的鞭毛上基本著生兩個環(huán)，革蘭氏陰性細(xì)菌則基本著生四個 環(huán)。性菌毛只見于革蘭氏陰性菌，參與細(xì)胞間稱作接合作用的交配過 程。生理特性以下是關(guān)于革蘭氏陽性細(xì)菌和陰性細(xì)菌在生理特性方面的比較。 兩者的不同從本質(zhì)上來說，還是主要是由細(xì)胞結(jié)構(gòu)的不同所決定的。項目革三國回斗細(xì)審革蘭氏附隹物菌割機(jī)怛的抗性播相細(xì)

6、胞壁寬串隹酶弱（駟）行巨感*對青霧春、描腹就感不歇度時如索、羸客素、四環(huán)素不動感薇感對曬性鑼笛捫茵,乍用強(qiáng)淵封因商子去刀劑敏感敏感不勘盛對干Jft所牲強(qiáng)施的3.細(xì)粕壁最外屋的脂嬖雕阻礙濟(jì)茵修、抗生拿一染料,去有劑等域大分子迸入步驟：革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個步驟 ，具體操作方法是：（1）制片。取菌種培養(yǎng)物常規(guī)涂片、干燥、固定。要用活躍生長期的幼培養(yǎng)物 作革蘭氏染色；涂片不宜過厚，以 免脫色不完全造成假陽性；火焰固定不宜過熱（以玻片不燙手為宜）(2)初染。滴加結(jié)晶紫(以剛好將菌膜覆蓋為宜)染色 1-2min,水洗(3)媒染。用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋約 1min,水洗。(

7、4)脫色。用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用滴 管流加95%勺乙醇脫色，直至流出的乙醇無紫色時，立即水洗。乙醇脫色是革蘭氏染色操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)：脫色不足，陰性菌被 誤染成陽性菌；脫色過度，陽性菌被誤染成陰性菌。因而脫色時間一 般為 20-30S。(5)復(fù)染。用番紅液復(fù)染約2min,水洗。(6)鏡檢。干燥后，用油鏡觀察。菌體被染成 藍(lán)紫色的是革蘭氏陽性菌， 被染成紅色的為革蘭氏陰性菌。率駕糖科海芾色舞香匕在紅這在a笈 e*4L用塞色染制汨1r或三原理:通過結(jié)晶紫初染和碘液媒染 后,在細(xì)胞壁內(nèi)形成了不溶于水的 結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物，再用95叱醇脫色。革蘭氏 陽性菌由于其細(xì)胞壁較厚、肽

8、聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致 密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時， 因失水反而使網(wǎng)孔縮小，再加上它 不含類脂，故乙醇處理不會出現(xiàn)縫隙，因此能把結(jié)晶紫與碘復(fù)合物牢 牢留在壁內(nèi)，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰 性菌因其細(xì)胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層 薄且交聯(lián)度差，在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解， 薄而松 散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結(jié)晶紫與碘復(fù)合物的溶出， 因此通過乙醇脫色 后仍呈無色，再經(jīng)沙黃等紅色染料復(fù)染，就使革蘭氏陰性菌呈 紅色 1。染色的差異主要是陰性與陽性細(xì)菌細(xì)胞壁的差異所引起的。革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁G吆田菌細(xì)胞壁具有較厚（20-80nm）而致密的肽聚糖層，多達(dá) 50層，占細(xì)胞壁成分的40%-95

9、%它同細(xì)胞膜的外層緊密相連（圖 2-9）。有的G+H菌細(xì)胞壁中含有磷壁酸（teichoic-acid ）,也稱 胞壁質(zhì)（murein）,它是甘油和核糖醇的聚合物，磷壁酸通常以糖或 氨基酸的酯而存在。由于磷壁酸帶負(fù)電荷，它在細(xì)胞表面能調(diào)節(jié)陽離 子濃度。磷壁酸與細(xì)胞生長有關(guān)，細(xì)胞生長中有自溶素（autolysins ） 酶類起作用，磷壁酸對自溶素有調(diào)節(jié)功能，阻止胞壁過度降解和壁溶。如果細(xì)胞壁的肽聚糖層被消溶，G吆田胞成為原生質(zhì)體 (protoplasts ),細(xì)胞壁不復(fù)存在，而只存留細(xì)胞膜。除鏈球菌外， 大多數(shù)G吆田菌細(xì)胞壁中含極少蛋白質(zhì)。革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁G一細(xì)菌細(xì)胞壁比G吆田菌細(xì)胞壁薄(1

10、520nm而結(jié)構(gòu)較復(fù)雜， 分外膜(outer membrane)和肽聚糖層(23nn)(圖2-10)。在 細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜之間有一個明顯的空間，稱為壁膜間隙(periplasmic space )。外膜G細(xì)菌細(xì)胞壁外膜的基本成分是脂 多糖(lipopolysaccharide,LPS),它同細(xì)胞質(zhì)膜相同之處也是雙層類脂，但除磷脂外還含有多糖和蛋白質(zhì)。LPS的多糖部分包括核心多糖和。片寺異多糖。O4寺異多糖由重 復(fù)分支的碳水化合物分子組成，含有已糖(葡萄糖、半乳糖和鼠李糖) 和二脫氧已糖。由于糖的種類不同，使各種G-細(xì)胞具有不同特性的LPS核心多糖(core polysaccharide )的主要組分是酮脫氧辛酸 (ketodeoxyoctonate, KDO )。外膜中還含有幾種蛋白，如脂蛋白、通透蛋白。有些蛋白具有 通孔作用(porin ),調(diào)控外界分子進(jìn)入細(xì)胞；有的蛋白分子可以作 為噬菌體的受體；許多G-細(xì)菌對高等生物有致病性是由LPS的成分 決定的，它的毒性組分常稱為內(nèi)毒素(endotoxins )。肽聚糖層G細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖層很薄，在大腸桿菌和其它 細(xì)菌中僅有單層。肽聚糖層和外膜的內(nèi)層之間通過脂蛋白連接起來。壁膜間隙G細(xì)菌細(xì)胞壁的外膜與細(xì)胞質(zhì)膜之間存在明顯的壁膜間隙，