1、腫瘤分子生物學(xué)檢驗(yàn)?zāi)[瘤標(biāo)志物的研究歷史第1階段（1963-1978）：癌胚性抗原1963年 Abelev AFP1965年 Gold & Freeman CEA第2階段（1979-1989）：糖鏈抗原為主1980年 Koprowski CA19-9（1116-NS-19-9）1981年 Bast CA125（OC125）第3階段（1990以后）：基因標(biāo)志腫瘤基因標(biāo)志2一、原癌基因(oncogene，onc)及其表達(dá)產(chǎn)物的作用1、定義： 原癌基因是指人類或其他動(dòng)物細(xì)胞（以及致癌病毒）固有的一類基因，能誘導(dǎo)細(xì)胞正常轉(zhuǎn)化并使之獲得新生物特征的基因總稱。原癌基因包括病毒癌基因（v-onc）和細(xì)胞癌基因

2、（c-onc）兩種，它們在正常情況下以非激活的形式存在，故稱原癌基因。負(fù)責(zé)調(diào)控正常細(xì)胞的生命活動(dòng)，包括細(xì)胞增生、生長因子信號傳遞、細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞存活以及DNA轉(zhuǎn)錄等。一旦這類基因發(fā)生某些錯(cuò)誤或功能喪失時(shí)，極易導(dǎo)致原癌基因轉(zhuǎn)變?yōu)榭墒拐＜?xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤的轉(zhuǎn)化基因或癌基因。342、特點(diǎn)：（1）v-onc是病毒基因組中特殊的核苷酸序列，能 引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化（2）c-onc是存在于正常細(xì)胞基因組中的癌基因， 在正常情況下處于靜止或低表達(dá)的狀態(tài)，不 僅對細(xì)胞無害，而且對維持細(xì)胞正常功能具 有重要作用，但在異常表達(dá)時(shí)，其產(chǎn)物可使 細(xì)胞無限制分裂 5細(xì)胞癌基因與病毒癌基因核酸序列有同源性即它們的DNA序列是相

3、對應(yīng)的，表達(dá)產(chǎn)物也基本相同 細(xì)胞癌基因的作用：通過其表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)來體現(xiàn)的，負(fù)責(zé)調(diào)控正常細(xì)胞的生命活動(dòng)，包括細(xì)胞增生、生長因子信號傳遞、細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞存活以及DNA轉(zhuǎn)錄等。 67二、癌基因定義：原癌基因在進(jìn)化上高度保守，負(fù)責(zé)調(diào)控正常細(xì)胞的生命活動(dòng)，包括細(xì)胞增生、生長因子信號傳遞、細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞存活以及DNA轉(zhuǎn)錄等。一旦這類基因發(fā)生某些錯(cuò)誤或功能喪失時(shí)，極易導(dǎo)致原癌基因轉(zhuǎn)變?yōu)榭墒拐＜?xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤的轉(zhuǎn)化基因或癌基因三、原癌基因的激活機(jī)制 原癌基因具有正常的生理功能，被激活時(shí)又具有致癌能力，因此研究原癌基因如何被激活是很重要的。 現(xiàn)已證實(shí) 射線輻射 化學(xué)致癌劑 病毒感染 8(一)原癌基因點(diǎn)

4、突變(point mutation) 癌基因在編碼順序的特定位置上的某一個(gè)核苷酸發(fā)生突變，使其表達(dá)蛋白質(zhì)中相應(yīng)的氨基酸發(fā)生變化，從而獲得了轉(zhuǎn)化細(xì)胞的活性 9mutation(二)原癌基因獲得外源啟動(dòng)子而激活 腫瘤細(xì)胞中原癌基因的表達(dá)水平可以其轉(zhuǎn)錄的mRNA或翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)的含量來表示 在原癌基因的上游插入外源性啟動(dòng)子或增強(qiáng)子可激活原癌基因，使其表達(dá)產(chǎn)物增多 病毒的增強(qiáng)子常位于5端的長末端重復(fù)序列(1ong terminal repeat，LTR)內(nèi)。如果增強(qiáng)子插入到原癌基因的附近或遠(yuǎn)處，均使之激活，促使癌基因的表達(dá)比正常表達(dá)增高幾十甚至上百倍 10 (三)原癌基因甲基化程度降低而激活 DNA分

5、子中的甲基化(methylation)對阻抑基因的轉(zhuǎn)錄具有重要作用 11現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸腺癌和小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞中，ras基因的DNA甲基化水平比其鄰近的正常細(xì)胞明顯偏低，提示某些原癌基因是由于甲基化程度降低而激活 12 (四)原癌基因的拷貝數(shù)增加基因擴(kuò)增(amplification)： 某些癌基因通過一些機(jī)制在原來的染色體上復(fù)制多個(gè)拷貝，超出了正常細(xì)胞的癌基因劑量，導(dǎo)致基因產(chǎn)物的增加，從而使細(xì)胞正常功能紊亂 例如： 人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤：N-myc擴(kuò)增了10-200倍，相應(yīng)的mRNA和蛋白質(zhì)產(chǎn)物也都大量增加 13 (五)基因易位或重排使原癌基因激活 基因易位（translocation）基因重排（r

6、earrangemant）： 有些癌基因從其染色體的正常位置轉(zhuǎn)移到另一染色體的某個(gè)位置，由于調(diào)控環(huán)境發(fā)生變化，導(dǎo)致從相對靜止?fàn)顟B(tài)變成激活狀態(tài)，使原癌基因表達(dá)產(chǎn)物顯著增加而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生 14 染色體易位使位于9q34的c-abl基因轉(zhuǎn)移到第22對染色體上，重排形成bcr-abl融合基因，使表達(dá)增高，蛋白質(zhì)產(chǎn)物也由p145變成p210，其酪氨酸蛋白激酶活性大為增加，導(dǎo)致慢性粒細(xì)胞白血病的發(fā)生 15 四、抑癌基因 抑癌基因(suppresser gene)又稱抗癌基因(anti-onc)，是存在于正常細(xì)胞內(nèi)的一類可抑制細(xì)胞生長的基因，并有潛在抑癌作用。當(dāng)這類基因發(fā)生突變、缺失或失活時(shí)，可引起細(xì)胞惡

7、性轉(zhuǎn)化而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生 16（一）抑癌基因及其表達(dá)產(chǎn)物 抑癌基因與調(diào)控細(xì)胞分裂和分化過程相關(guān)，可能與生長因子、某些蛋白激酶類活性密切相關(guān)，只是抑癌基因給予細(xì)胞的信號與原癌基因相反 17（二）抑癌基因失活機(jī)理1、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retino-blastoma，Rb)（1）特點(diǎn)：基因組成：27個(gè)外顯子，3-17外顯子區(qū)域是基 因重組和突變的熱點(diǎn) 編碼：p105的蛋白質(zhì)，其有結(jié)合DNA的活性， 可受多種激酶系統(tǒng)催化而發(fā)生磷酸化 1819 （2）作用： 不同程度磷酸化后，都可使p105活性缺乏或完全消失。非磷酸化的Rb可防止細(xì)胞增殖，當(dāng)DNA腫瘤病毒抗原結(jié)合了非磷酸化的Rb時(shí)，Rb的活性就受到抑制，使

8、細(xì)胞轉(zhuǎn)化為無限增殖狀態(tài)，形成腫瘤 對于大量來自視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的Rb基因序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Rb基因完全或部分發(fā)生缺失；另一些Rb腫瘤中，基因完整，但序列分析顯示有一個(gè)突變，它常發(fā)生于剪接點(diǎn)上，由于這一變異導(dǎo)致Rb mRNA組裝時(shí)有外顯子被漏掉，因而產(chǎn)生異常Rb蛋白質(zhì) 20 抑癌基因又稱為隱性癌基因21 基因1 基因2原癌基因 M W 腫瘤抑癌基因 M W M M 腫瘤（2）p53基因特點(diǎn)：17p13，11個(gè)外顯子，10個(gè)內(nèi)含子編碼：393個(gè)氨基酸，p5322作用：產(chǎn)物能結(jié)合DNA和被磷酸化。（1）抑制腫瘤細(xì)胞停滯在修復(fù)前期不能進(jìn)入S期復(fù)制DNA而促使細(xì)胞凋亡 2324野生型p53的蛋白質(zhì) p53

9、下調(diào)bcl-2而上調(diào)bax，促進(jìn)細(xì)胞凋亡過程。向丟失p53等位基因的腫瘤細(xì)胞中導(dǎo)入野生型p53就會(huì)使腫瘤細(xì)胞凋亡25 正常細(xì)胞的生長增殖由兩大基因調(diào)控 正調(diào)控信號：促進(jìn)細(xì)胞生長和增殖，并且阻止 其發(fā)生終末分化癌基因 負(fù)調(diào)控信號：促進(jìn)細(xì)胞成熟，向終末分化，最 后凋亡（apoptosis）抑癌基因 兩種信號保持著動(dòng)態(tài)平衡，對正常細(xì)胞的生長、增殖、死亡精確地調(diào)控，當(dāng)平衡被破壞，正調(diào)控信號基因功能過盛或負(fù)調(diào)控信號基因失活，導(dǎo)致細(xì)胞增殖調(diào)控的混亂而使細(xì)胞惡變 原癌基因的激活1、ras基因的變異2myc基因的變異26抑癌基因的失活1、Rb基因的失活2、p53基因的失活 3、其他： BRCA1和BRCA2：

10、與遺傳性高發(fā)乳腺癌相關(guān)的基因，與卵巢癌的發(fā)生也緊密相關(guān) 五、檢測方法：1、PCRASO探針法(PCR-allele-specific oligonucleotide） 被檢基因片段經(jīng)PCR擴(kuò)增并經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移到膜上，分別與經(jīng)標(biāo)記的野生型和突變型靶基因序列的寡核苷酸探針雜交。由于長度為20個(gè)堿基左右的探針中僅1個(gè)堿基的差異便會(huì)使其Tm值下降5.07.5，因此通過嚴(yán)格控制雜交條件，可以使PCR產(chǎn)物與完全互補(bǔ)的探針進(jìn)行雜交，也即野生型序列的產(chǎn)物僅與野生型探針雜交，含突變序列的產(chǎn)物僅與突變探針雜交。根據(jù)有無雜交信號可判斷被檢擴(kuò)增片段中是否帶有突變點(diǎn)。 272、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析聚合

11、酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)限制性片段長度多態(tài)（PCR RFLP）分析技術(shù)是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。DNA堿基置換正好發(fā)生在某種限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)上，使酶切位點(diǎn)增加或者消失，利用這一酶切性質(zhì)的改變，PCR特異擴(kuò)增包含堿基置換的這段DNA，經(jīng)某一限制酶切割，再利用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，與正常比較來確定是否變異。應(yīng)用PCR RFLP，可檢測某一致病基因已知的點(diǎn)突變，進(jìn)行直接基因診斷，也可以此為遺傳標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析進(jìn)行間接基因診斷。28293、PCR-SSCP、測序等單鏈DNA分子具有特定的二級空間構(gòu)象，取決于該分子本身的堿基組成突變DNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)變性后產(chǎn)生與正常DNA空間構(gòu)象不同的兩條單鏈在非變

12、性聚丙烯酰胺凝膠電泳中時(shí)，不同構(gòu)象的單鏈片段具有不同的電泳遷移率，從而能區(qū)別正常與突變的DNA304、變性梯度凝膠電泳 (DGGE)在設(shè)計(jì)引物時(shí)應(yīng)使被擴(kuò)增的靶基因片段的兩端含有不同的Tm值，一端較高，另一端相對較低。將PCR產(chǎn)物在含有梯度濃度變性劑的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行分離，當(dāng)泳動(dòng)至變性劑相應(yīng)濃度的位置時(shí)，產(chǎn)物片段中Tm值較低一端的雙鏈被部分變性而解鏈，這種部分解鏈的構(gòu)象致使該片段的電泳遷移率大大降低。由于野生序列與突變序列的PCR產(chǎn)物片段的Tm不同，它們在電泳過程中被部分解鏈的先后不同，經(jīng)過一定時(shí)間的電泳，可以發(fā)現(xiàn)這些產(chǎn)物片段在凝膠中所處的位置也不同，據(jù)此，可以區(qū)別野生序列片段還是突變序列片段。315、Southern Blot具有一定同源性的兩