1、PAGE PAGE 11超聲引導(dǎo)下微波消融聯(lián)合(linh)自體CIK細(xì)胞治療原發(fā)性肝癌的療效研究周健，劉黎，黃麗雯武漢科技大學(xué)附屬天佑(tin yu)醫(yī)院感染科 430064【摘要(zhiyo)】目的：觀察超聲引導(dǎo)下微波消融(PMCT)聯(lián)合自體CIK細(xì)胞治療原發(fā)性肝癌(HCC)的臨床療效及安全性。方法：62例HCC患者分為兩組，PMCT組(n=30例)僅采用PMCT治療，聯(lián)合組(n=32例)則采用PMCT聯(lián)合自體CIK細(xì)胞，觀察兩組臨床療效，KPS評(píng)分，治療前后T細(xì)胞亞群及AFP變化，在0.5年、1年、2年的復(fù)發(fā)率及生存率以及不良反應(yīng)。結(jié)果：聯(lián)合組治療總有效率(87.5%)和KPS有效率(90

2、.6%)明顯高于PMCT組(70.0%)和(73.3%)(P0.05)，兩組治療后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值均明顯升高(P0.05)，而CD8+及AFP明顯下降(P0.05)，聯(lián)合組升高或下降較PMCT組更為顯著(P0.05)；聯(lián)合組在0.5年、1年、2年的復(fù)發(fā)率及生存率均明顯低于和高于對(duì)照組(P0.05)；兩組治療期間均未出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)。結(jié)論：PMCT聯(lián)合自體CIK細(xì)胞治療HCC療效明顯優(yōu)于單純PMCT，可明顯調(diào)節(jié)患者免疫狀態(tài)，降低復(fù)發(fā)率和提高生存率，安全可靠，值得臨床推廣應(yīng)用。【關(guān)鍵詞】微波消融；CIK細(xì)胞；原發(fā)性肝癌；T細(xì)胞亞群原發(fā)性肝癌(Hepatocellular

3、carcinoma, HCC)是目前最常見的惡性腫瘤之一，由于其發(fā)病隱匿，確診時(shí)常常失去了手術(shù)治療的機(jī)會(huì)，影響預(yù)后，病死率高1,2。對(duì)于無法手術(shù)切除特別是伴有轉(zhuǎn)移的患者，采用非手術(shù)的治療方法以及實(shí)行綜合治療是目前臨床最常用的策略3,4。研究表明，微波消融(percutaneous microwave coagulation therapy, PMCT)治療小肝癌可獲得與手術(shù)切除相近的生存療效5-7。PMCT治療肝癌具有并發(fā)癥發(fā)生率低、恢復(fù)快、住院時(shí)間短等優(yōu)勢，超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮微波消融治療肝癌具有成本低的優(yōu)勢8。PMCT治療后，機(jī)體腫瘤負(fù)荷減輕，腫瘤對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制大大解除，同時(shí)死亡和凋亡的腫瘤細(xì)

4、胞使腫瘤抗原得以釋放和暴露，因而也是激發(fā)機(jī)體特異性抗腫瘤免疫的最佳時(shí)機(jī)。多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine induced killer,CIK 細(xì)胞)過繼性免疫治療能在一定程度上提高腫瘤患者的免疫功能，為預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)、消除患者體內(nèi)殘留的腫瘤細(xì)胞、改善晚期腫瘤患者的生存質(zhì)量提供了新的治療途徑。因此本研究擬觀察觀察超聲引導(dǎo)下微波消融聯(lián)合自體CIK細(xì)胞治療原發(fā)性肝癌的臨床療效及安全性。1 資料與方法1.1 臨床資料62例HCC患者均為本院2011年2月-2013年2月期間住院治療的患者，根據(jù)臨床癥狀體征、實(shí)驗(yàn)室檢查及影像學(xué)檢查(CT或MRI等)均已確診。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：妊娠和哺乳期婦女，吸

5、毒，精神異常，未控制的感染，全身皮質(zhì)激素治療，自身免疫性疾病，缺血性心臟病或心力衰竭，近6個(gè)月內(nèi)進(jìn)行過化療或放療的患者。上述患者根據(jù)各自治療意愿分為PMCT組(n=30例)和聯(lián)合組(n=32例)，兩組患者在性別、年齡、病程、肝功能Child分級(jí)、病灶數(shù)目、腫瘤最大徑等方面比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1)。本研究已得到患者的知情同意及醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。1.2 治療方法1.2.1 微波消融儀器(yq)及步驟微波設(shè)備為中國(zhn u)南京康友微波能應(yīng)用研究所研制的KY-2000(2450MHz)及KY-2100(915 MHz)微波(wib)消融儀，配用微波天線為15G，硬質(zhì)裂隙水冷天線，最大輸出功率

6、為100 W；隨機(jī)配備組織測溫系統(tǒng)，連接3根21G組織測溫針(南京康友微波能應(yīng)用研究所)。微波治療方案：設(shè)計(jì)為1次消融治療實(shí)現(xiàn)腫瘤完全滅活。治療步驟：常規(guī)腹部超聲檢查后選定體位，超聲引導(dǎo)擇點(diǎn)定位，應(yīng)用2%利多卡因進(jìn)針點(diǎn)局部麻醉，給予動(dòng)態(tài)心電、呼吸、血壓監(jiān)護(hù)。15G微波天線直入預(yù)定部位，根據(jù)腫塊大小及患者情況選擇不同功率、作用時(shí)間和進(jìn)針次數(shù)，同時(shí)觀察腫塊回聲變化。對(duì)5cm的腫瘤采取雙針多部位分段凝固，按先深部后表淺，先周邊后中央的順序進(jìn)行操作，選用功率5060W，作用時(shí)間1520min。PMCT組和聯(lián)合治療組患者均進(jìn)行12次消融治療，使用微波針數(shù)為14針，兩組消融治療次數(shù)和治療針數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意

7、義(P0.05)。1.2.2 自體CIK的制備及治療方法 抽取患者外周血，經(jīng)人淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞(PMBC)，培養(yǎng)當(dāng)天加入重組人IFN-、IL-2，培養(yǎng)第14d時(shí)，抽取培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)菌真菌檢測，回輸當(dāng)天進(jìn)行內(nèi)毒素檢測和細(xì)胞表性分析。聯(lián)合組患者共接受46次自體誘導(dǎo)的CIK 細(xì)胞治療，每周一次，每次回輸后如無不良反應(yīng)則繼續(xù)完成以后的治療。每次回輸?shù)腃IK細(xì)胞不少于11010，回輸時(shí)由專人負(fù)責(zé)，如出現(xiàn)不可耐受的副反應(yīng)則終止治療。1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)治療后3個(gè)月評(píng)價(jià)臨床療效：完全緩解(CR：所有靶病灶消失)；部分緩解(PR：靶病灶最長直徑與基線狀態(tài)比較，至少減少30%)

8、；無變化(SD：靶病灶縮小不到50%或增大不超過25%)；疾病進(jìn)展(PD：靶病灶最長徑之和與治療開始之后所記錄到的最小靶病灶之和比較，增加20%或者出現(xiàn)1個(gè)或多個(gè)病灶)。 治療后KPS評(píng)分的變化，升高：化療結(jié)束后較治療前評(píng)分增加10分；穩(wěn)定：化療前評(píng)分增加或減少不足10分；降低：較化療前評(píng)分減少10分。升高和穩(wěn)定為有效。1.4 外周血淋巴細(xì)胞亞群分析患者治療前后外周血淋巴細(xì)胞表型分析用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。血樣以EDTA抗凝，各檢測管中加入相應(yīng)抗體(CD3-PerCP，CD4-FITC，CD8-FITC，CD 25 PE，CD 28 PE，CD56 PE，Mouse IgG1-FITC，Mous

9、e IgG1-PE，Mouse IgG2a-PE，Becton Dickinson Immunocytometry Systems，BDIS，USA)，混勻，室溫暗處反應(yīng)15 min；加入2 ml FACS Lysing Solution(BDIS，USA)，混勻，室溫暗處放置10 min；3000 r/min，離心5 min，棄上清；洗滌，加入300 l 1%多聚甲醛；28暗處保存，24 h內(nèi)用FACS-Calibur(Becton Dickinson，USA)檢測分析。1.5 觀察(gunch)指標(biāo)1.5.1 檢測治療(zhlio)中和治療后局部或全身毒副反應(yīng)；1.5.2 檢測(jin c

10、)治療前后(1年內(nèi))外周血AFP濃度；1.5.3 觀察患者無瘤生存率和1年，3年生存率。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法采用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理。組間計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，組內(nèi)計(jì)量資料比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；率和構(gòu)成比的比較采用2檢驗(yàn)，生存率分析用Kaplan-Meier法，生存時(shí)間比較采用Log-rank檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.05。2 結(jié)果2.1 兩組臨床資料比較 兩組患者在性別、年齡、病程、肝功能Child 分級(jí)、病灶數(shù)目、腫瘤最大徑等方面比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)，見表1。表1 兩組臨床資料比較組別例數(shù)性別(男/女)年齡(歲)病程(d)病灶數(shù)(個(gè))病灶最大徑(mm)肝功能Ch

11、ild分級(jí)ABCPMCT組3025/552.211.638.527.96.718102聯(lián)合組3226/653.512.1 0.527.27.116113注：兩組比較，P0.05。2.2 兩組臨床療效及KPS評(píng)分比較 聯(lián)合組治療總有效率(87.5%)和KPS有效率(90.6%)明顯高于PMCT組(70.0%)和(73.3%)(P0.05)；見表2及表3。表2 兩組療效比較組別例數(shù)CRPRSDPD治療總有效率PMCT組304176370.0%聯(lián)合組3282031 87.5%*注：與PMCT組比較，*P0.05。表3 兩組KPS評(píng)分比較組別例數(shù)升高穩(wěn)定降低總

12、有效率PMCT組30715873.3%聯(lián)合組3215143 90.6%*注：與PMCT組比較，*P0.05)，兩組治療后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值均明顯升高(P0.05)，而CD8+及AFP明顯下降(P0.05)，聯(lián)合組升高或下降較PMCT組更為顯著(P0.05)，見表4。表4 兩組治療前后T細(xì)胞亞群及AFP變化 組別例數(shù)CD3+(%)CD4+(%)CD8+(%)CD4+/CD8+ AFP(ug/mL)PMCT組 治療前 治療后303063.522.71 65.233.13*32.221.43 33.721.58*30.312.74 27.552.25*1.050.57 1.2

13、70.62*472.41140.23 147.2525.47*聯(lián)合組 治療前 治療后323263.852.8770.424.21*#32.141.6534.921.44*#30.762.8425.432.07*#1.070.55 1.540.62*#481.07133.48 51.0427.12*#注：與治療(zhlio)前比較，*P0.05；與PMCT組治療(zhlio)后比較，#P0.05。2.4 兩組患者(hunzh)復(fù)發(fā)率及生存率比較 聯(lián)合組在0.5年、1年、2年的復(fù)發(fā)率及生存率均明顯低于和高于對(duì)照組(P0.05)，見表5。表5 兩組患者復(fù)發(fā)率及生存率比較(%)組別例數(shù)復(fù)發(fā)率生存率0.

14、5年1年2年0.5年1年2年P(guān)MCT組 308(26.7)15(50.0)20(66.7)23(76.7)17(56.7)13(43.3) 聯(lián)合組 32 4(12.5)* 10(31.3)*13(40.6)*29(90.6)* 24(75.0)*20(62.5)*注：與PMCT組比較，*P0.05。2.5 兩組治療不良反應(yīng) PMCT組及聯(lián)合組CIK細(xì)胞回輸治療均未出現(xiàn)或級(jí)嚴(yán)重不良反應(yīng)，治療后主要的不良反應(yīng)為穿刺部位滲血、肝區(qū)隱痛、發(fā)熱及輕微乏力，經(jīng)對(duì)癥處理，上述癥狀均消失。臨床觀察未發(fā)現(xiàn)有明顯肝腎心肺、血液系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)毒性作用，亦無明顯自身免疫疾病臨床表現(xiàn)。3 討論 目前，治療肝癌的有效方法

15、有手術(shù)切除、局部消融和經(jīng)肝動(dòng)脈栓塞等，均能極大地減少腫瘤負(fù)荷，取得顯著的階段性臨床療效。然而，腫瘤常常在治療后1年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)。研究顯示，惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體的免疫功能失調(diào)密切相關(guān)，免疫系統(tǒng)無法識(shí)別和清除惡變和突變的細(xì)胞致使腫瘤細(xì)胞逃逸機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和清除，因此對(duì)于影像學(xué)上肉眼無法分辨的微小病灶，最終需要?jiǎng)訂T機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別和清除惡變腫瘤細(xì)胞才能徹底清除9,10。 PMCT治療不僅直接使腫瘤細(xì)胞凝固壞死，原位徹底滅活肝癌組織，而且還能提高免疫細(xì)胞數(shù)量及其抗腫瘤功能，而手術(shù)切除腫瘤有可能直接或間接地抑制細(xì)胞免疫11。PMCT能提高機(jī)體免疫功能，其機(jī)制為12,13： PMCT減輕了患者的腫瘤

16、負(fù)荷及相應(yīng)的免疫抑制因子； PMCT在腫瘤局部造成了炎性環(huán)境，有利于抗原提呈細(xì)胞提取、加工腫瘤抗原，誘發(fā)抗腫瘤免疫； PMCT降低了免疫抑制因子的水平，腫瘤細(xì)胞分泌的可溶性IL-2 受體能中和活化T 淋巴細(xì)胞分泌IL-2，使肝癌患者IL-2水平降低； PMCT可刺激淋巴細(xì)胞活化，釋放細(xì)胞因子，通過細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)作用，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力。Schueller 等14研究發(fā)現(xiàn)，熱療通過加強(qiáng)肝癌細(xì)胞HSP70和HSP90 的表達(dá)，能增加對(duì)肝細(xì)胞癌的免疫能力；AFP具有免疫抑制作用，PMCT后患者AFP明顯下降，進(jìn)一步解除了機(jī)體的免疫抑制。但近些年研究發(fā)現(xiàn)，雖然PMCT治療可刺激局部免疫反應(yīng)，但持續(xù)時(shí)間

17、較短，提示微波治療后有必要進(jìn)行免疫治療，進(jìn)一步鞏固和擴(kuò)大微波治療后減滅瘤負(fù)荷的成果，達(dá)到降低和延緩腫瘤復(fù)發(fā)的目的15。 CIK是一群增值率高并具有抗腫瘤活性的異質(zhì)(y zh)細(xì)胞，通過(tnggu)穿孔素/顆粒酶殺傷腫瘤(zhngli)細(xì)胞16。CIK抗腫瘤已經(jīng)被批準(zhǔn)臨床試驗(yàn)，許多病人已經(jīng)由此獲得良好的治療效果17-19。與傳統(tǒng)的肝癌切除相比，免疫治療具有副作用少、減少腫瘤免疫逃避及避免免疫耐受的優(yōu)點(diǎn)。CIK細(xì)胞主要通過3種途徑發(fā)揮抗癌作用20： CIK在體內(nèi)通過LFA/ICMA-1 等粘附因子粘附并穿過內(nèi)皮細(xì)胞，直接識(shí)別并定位到血管外的腫瘤組織，分泌含大量BLT 酯酶的顆粒進(jìn)而裂解殺傷腫瘤細(xì)

18、胞； 分泌IL-2、IL-6、TNF-及GM-CSF等細(xì)胞因子，改造機(jī)體的內(nèi)免疫環(huán)境，在DC 細(xì)胞的存在下激活體液免疫并起到協(xié)同作用，提高機(jī)體免疫功能，抑制腫瘤細(xì)胞生長； 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡從而抑制肝癌發(fā)展 本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合組治療總有效率和KPS有效率明顯高于PMCT組；兩組治療后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值均明顯升高，而CD8+及AFP明顯下降，聯(lián)合組升高或下降較PMCT組更為顯著；聯(lián)合組在0.5年、1年、2年的復(fù)發(fā)率及生存率均明顯低于和高于對(duì)照組(P0.05)；治療期間均未出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)。由此可知，PMCT聯(lián)合自體CIK細(xì)胞治療HCC療效明顯優(yōu)于單純PMCT，可明顯調(diào)節(jié)患

19、者免疫狀態(tài)，降低復(fù)發(fā)率和提高生存率，安全可靠，值得臨床推廣應(yīng)用。參考文獻(xiàn)：Cazejust J. MR features after radiofrequency ablation (RFA)J. Clinics and research in hepatology and gastroenterology,2011,35(2):81-82.Napoletano C, Taurino F, Biffoni M, et al. RFA strongly modulates the immune system and anti-tumor immune responses in metastati

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