1、一、名詞解釋紫外 -可見分光光度法及其用途 : 是利用物質(zhì)在紫外、可見光區(qū)的分子吸收光譜，對物質(zhì)進 行定性分析、定量分析及結(jié)構(gòu)分析的方法 。電泳及其主要類型 ：蛋白質(zhì)在高于或低于其 pI 的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能 向正極或負極移動。這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動而達到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù) , 稱為電泳。熒光及其用途 : 細胞中的某些物質(zhì) （如葉綠素 ） 經(jīng)紫外線照射后能發(fā)出可見光線， 稱為熒光。薩瑟恩雜交Southern blotting :是體外分析特異DNA序列的方法，操作時先用限 制性內(nèi)切酶將核DNZ或線粒體DN/切成DN片段，經(jīng)凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維 薄膜上，再用探針雜交，

2、通過放射自顯影，即可辨認出與探針互補的特殊核苷序列 諾森雜交 Northern hybridization 等幾種雜交技術(shù)及其用途: northern 雜 交與Southern雜交主要的不同之處在于檢驗物是RNA而不是DNA首先是提取某種生物或組織的總RNA或mRNA然后用含有變性劑（硫氰酸胍、乙二醛）的瓊脂糖凝膠電 泳分離RNA變性劑的作用是防止 RNA自我退火形成局部雙鏈，影響泳動率，干擾實 驗結(jié)果。電泳分離后再將凝膠上的 RNA帶吸印到尼龍膜上，在液相中和標(biāo)記的核酸探 針進行雜交。細胞培養(yǎng) :把來自機體的組織經(jīng)分散成為單個細胞， 放在類似于體內(nèi)的體外環(huán)境中生存， 使 其不斷生長、繁殖或傳

3、代，借以觀察細胞的生長、繁殖、衰老等生命現(xiàn)象。沉降速度法等離心技術(shù): 沉降速度法 : 根據(jù)被分離物質(zhì)的沉降系數(shù)不同來分離物質(zhì)。 梯度中最大的密度要小于樣品中最小顆粒密度。 包括差速離心法和區(qū)帶離心法 （速度 - 區(qū)帶離心法 ） 。鹽析及分段鹽析等蛋白質(zhì)分離技術(shù) :是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶 液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。由于不同的蛋白質(zhì)其溶解度與等電點不同，沉淀時所需的pH值與離子強度也不相同，改變鹽的濃度與溶液的 pH值，可將混合液中的蛋白質(zhì)分批鹽析分開，這種分離蛋白質(zhì)的方法稱 為分段鹽析法 （fractional saltingout）。摩爾吸光

4、系數(shù): 物質(zhì)對某波長的光的吸收能力的量度。 指一定波長時， 溶液的濃度為 1 mol/L ， 光程為1cm時的吸光度值，用 e或EM表示。&越大，表明該溶液吸收光的能力越強，相 應(yīng)的分光度法測定的靈敏度就越高。預(yù)雜交及其作用: 預(yù)雜交 （Prehybridizaiton） 是減低背景染色的一種有效手段。 預(yù)雜交液和 雜交液的區(qū)別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖 （Dextran sulphate） 。將組織切片浸入預(yù)雜交 液中可達到封閉非特異性雜交點的目的，從而減低背景染色。細胞系 （cell line）:原代培養(yǎng)細胞成功傳代即為細胞系。細胞株 （cell strain）:從培養(yǎng)細胞中篩選

5、出的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細胞群。流式細胞術(shù)（Flow Cytometry, FCM ：利用流式細胞儀對處于快速流動的細胞或生物顆粒進 行多參數(shù)、快速 （每秒可達 1000-10000 個）的定量分析和分選 （純度可達 99%以上 ）的技術(shù)。、問答題1什么是柯勒照明？簡述 柯勒照明的方法與步驟?？吕照彰鳎汗庠唇?jīng)集光器將視場光闌像呈到標(biāo)本平面上，燈絲成像于孔徑光闌。 柯勒照明五步走：1將目鏡屈光度調(diào)節(jié)環(huán)放置零位。2用10X物鏡將標(biāo)本調(diào)焦清晰 。3把燈絲成像于聚光鏡孔徑光闌的下表面上。4收小視場光闌。5通過聚光鏡調(diào)節(jié)旋鈕將視場光闌調(diào)清晰，使用對中旋 鈕將視場光闌對中。6放大視場光闌至外切于視野位置7

6、取下目鏡，檢查物鏡的后焦面處光是否均勻?？s小孔徑光闌，直到其出現(xiàn)在物鏡后焦面上。調(diào)整孔徑光闌，使它的直徑為物鏡后焦面直徑的7 / 8。放回目鏡，檢查成像質(zhì)量。8為了得到合適的對比度及景深，需要調(diào)節(jié)孔徑光闌。8在更換過物鏡以后，需要調(diào)整視場光闌（控制照明區(qū)域），以及孔徑光闌2. 試述一般光學(xué)顯微鏡的基本構(gòu)造。系統(tǒng)構(gòu)成：照明系統(tǒng) 光學(xué)放大系統(tǒng) 機械裝置目鏡倣大物象）鏡筒璉接目鏡與物鏡）轉(zhuǎn)換器（調(diào)換物鏡）粗準(zhǔn)焦螺旋（升降鏡筒）細準(zhǔn)焦螺旋（升降鏡 筒）鏡臂璉接）鏡柱（支持）物鏡（放大物象）載物臺（放置玻片）通光孔（光線通過）壓片夾（固定玻片）反光（反射光線）3. 電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡主要的區(qū)別： 照

7、明源不同。電鏡所用的照明源是電子槍發(fā)出的電子流，而光鏡的照明源是可見光（日光或燈光），由于電子流的波長遠短于光波波長，故電鏡的放大及分辨率顯著地高于光鏡。 透鏡不同。電鏡中起放大作用的物鏡是電磁透鏡（能在中央部位產(chǎn)生磁場的環(huán)形電磁線圈），而光鏡的物鏡則是玻璃磨制而成的光學(xué)透鏡。電鏡中的電磁透鏡共有三組，分別與光 鏡中聚光鏡、物鏡和目鏡的功能相當(dāng)。 成像原理不同。在電鏡中，作用于被檢樣品的電子束經(jīng)電磁透鏡放大后打到熒光屏上成像 或作用于感光膠片成像。而光鏡中樣品的物像以亮度差呈現(xiàn)。 所用標(biāo)本制備方式不同。電鏡觀察所用組織細胞標(biāo)本為超薄切片。而光鏡觀察的標(biāo)本為一般載玻片上，如普通組織切片標(biāo)本、細胞

8、涂片標(biāo)本、組織壓片標(biāo)本和細胞滴片標(biāo)本等。4 .如何在石蠟切片中顯示細胞中的糖類、蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)？糖類：固定t石蠟切片t脫蠟t過碘酸酒精液中氧化t水洗tSchiff試劑染色t亞硫酸水洗t蘇木精染色t自來水分色t脫水t透明t封片t觀察。結(jié)果：動物 細胞中的糖元呈紫色顆粒狀。DNA卡諾固定液t石蠟切片t復(fù)水t Schiff染色t亞硫酸水洗t 1%亮綠復(fù)染t脫水 t二甲苯透明T封片T觀察 ，結(jié)果：DNAH紫紅色，細胞質(zhì)呈綠色。蛋白：取材固定（4 C冷丙酮冰箱中）T石蠟切片T脫蠟T復(fù)水T蛋白作用液 （pH = 5） 1-2hr. T水洗T 2%醋酸T水洗T 1%硫化銨T水洗T脫水T透明T封片T 觀察

9、。結(jié) 果：依其在細胞中的含量多少呈現(xiàn)黃棕色至棕黑色不等。5. 冰凍蝕刻技術(shù)制備電子顯微鏡標(biāo)本的基本過程。標(biāo)本置于干冰或液氮中冰凍T升溫至-100 C T切割T升溫T斷面噴涂鉑 -碳膜T鉑-碳膜（復(fù)型膜）T銅網(wǎng)T觀察。優(yōu)點：不經(jīng)固定、脫水、包埋，有利于保持天然特征。尤其適于顯示各類膜結(jié)構(gòu)。分辨力強，反差好。圖像立體感強。樣品可長期保存缺點：易產(chǎn)生冰晶，技術(shù)難度大。6. 試述CO臨界點干燥法的基本原理及簡單流程。就是利用物質(zhì)在臨界狀態(tài)下液體表面張力被消除的特性，克服樣品干燥過程中的變形，保持 樣品原狀，達到干燥的目的。利用液態(tài)C02與氣態(tài)交換出現(xiàn)臨界點狀態(tài)時表面張力為零的現(xiàn) 象(31.1 C ,

10、72.9大氣壓)，保持臨界溫度，緩慢排氣，當(dāng) C02氣體排完時，樣品即干燥。流程：樣品整理(3-5mm)宀2-3%戊二醛固定1-2 hr.(或 與1-3%四氧化鋨(鋨酸)雙固定1-2 hr.) t磷酸緩沖液或超聲清洗t丙酮梯度脫水t 100%乙酸戊酯2次各10-20min宀高壓容 器中加液態(tài)C02進行臨界干燥。7. 試比較沉降速度法和沉降平衡法，各有何特點？各有哪些類型？分別用于哪些物質(zhì)的分 離？沉降速度法 : 根據(jù)被分離物質(zhì)的沉降系數(shù)不同來分離物質(zhì)。梯度中最大的密度要小于樣品中 最小顆粒密度。包括差速離心法和區(qū)帶離心法。沉降平衡法 : 根據(jù)被分離物質(zhì)的密度不同來分離物質(zhì)。梯度中最大的密度要大

11、于樣品中最大 顆粒密度。包括：差速離心，速度區(qū)帶 (或速度梯度 )離心，沉降平衡離心。8. 如何利用聯(lián)苯胺反應(yīng)對樣品中的過氧化酶進行定位 ？ 原理：細胞內(nèi)的過氧化物酶能把聯(lián)苯胺氧化為藍色或者棕色絡(luò)合物，根據(jù)藍色或者棕色的 出現(xiàn)位置來顯示細胞內(nèi)過氧化物酶的存在。(1) 把洋蔥根尖徒手切成 20-40卩m的薄片，再用鑷子撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮一小塊；(2) 把上面兩個材料浸在含有 0.1 %鉬酸銨的0.85 %鹽水溶液10ml中5min(鉬酸銨的作用 是催化劑 )；(3) 浸在 10ml 聯(lián)苯胺溶液內(nèi) 5min 以上，直到切片出現(xiàn)藍色；(4) 用 0.85%鹽水 10ml 清洗 3次，每次 5min；

12、(5) 將樣品置于載波片上展開，蓋上蓋玻片，顯微鏡觀察9. 如何利用間接免疫熒光技術(shù)顯示胞質(zhì)微管？用對應(yīng)于細胞內(nèi)的微管蛋白抗原的特異抗體，與體外培養(yǎng)細胞一起溫育，使抗體與 微管特異地結(jié)合。 然后用異硫氰酸熒光素 (FITC) 標(biāo)記在抗球蛋白抗體上， 溫育樣品， 使兩種抗體結(jié)合，使微管間接地標(biāo)記上熒光素。在熒光顯微鏡下即可看到胞質(zhì)內(nèi)的 微管網(wǎng)絡(luò)。細胞培養(yǎng)t PBS漂洗t -20 C甲醇固定t冷丙酮提脂T第一抗體T溫育tPBS T第二抗體T溫育T PBS-甘油封片T觀察 結(jié)果：熒光顯微鏡下，藍光激發(fā)，微管網(wǎng)絡(luò)呈亮黃色。10. 常用的蛋白質(zhì)分離技術(shù)有哪些？ 1根據(jù)溶解度不同的分離純化方法：鹽析、有機

13、溶劑沉淀、等電點沉淀 2根據(jù)分子大小不同的分離純化方法：透析、超濾、凝膠層析、離心 3據(jù)電離性質(zhì)不同的分離純化方法：電泳、離子交換層析 4根據(jù)配體不同的分離純化方法：親和層析11. 簡述植物細胞培養(yǎng)的主要類型及特點外植體培養(yǎng) : 誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織。 用于研究植物的生長發(fā)育、 分化和變異； 進行無性 繁殖；制取代謝產(chǎn)物。懸浮細胞培養(yǎng) : 適合于進行產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模細胞培養(yǎng)，制取植物代謝產(chǎn)物。原生質(zhì)體培養(yǎng) : 培養(yǎng)脫壁后的細胞，特點 : 比較容易攝取外來的遺傳物質(zhì)，如DNA 便于進行細胞融合，形成雜交細胞； 適宜條件下可產(chǎn)生細胞壁，經(jīng)誘導(dǎo)分化成完整植株。單倍體培養(yǎng)：通過花藥或花粉培養(yǎng)可獲得單倍體植株。

14、12. 光學(xué)顯微鏡按光學(xué)原理和所用光源可分為哪些主要類型？各有何特點和功能？適用于何種研究工作？普通光學(xué)顯微鏡特點：物體的光線通過物鏡后在目鏡焦點稍內(nèi)方形成一個倒立的放大實像（BA）。一般的低倍物的觀察熒光顯微鏡特點及功能：光源為短波光；有兩個特殊的濾光片； 照明方式通常為落射式是利用一定波長的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光，通過物鏡和目鏡系統(tǒng)放大以觀察標(biāo)本的熒光圖像用途：用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。激光共聚焦掃描顯微鏡特點：用激光作掃描光源，逐點、逐行、逐面快速掃描成像。借助計算機分析和模擬，能顯示細胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。用途：用于觀察細胞形態(tài)，也可以用于細胞內(nèi)生化成分的定

15、量分析、光密度統(tǒng)計以及細胞形態(tài)的測量。暗視野顯微鏡特點： 采用特殊的中央有擋光片的聚光鏡，斜射照明。視野背景是黑的，被標(biāo)本反射和衍射的光線進入物鏡，物體邊緣是亮的用途：適用于觀察活細胞的結(jié)構(gòu)與細胞內(nèi)微粒的運動相差顯微鏡特點：把透過標(biāo)本的可見光的光程 （波長）差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。用途：用環(huán)狀光闌代替可變光闌，用帶相板的物鏡（通常標(biāo)有PH的標(biāo)記）代替普通物鏡，并帶有一個合軸用的望遠鏡。偏光顯微鏡特點：光源前有偏振片（起偏器），進入顯微鏡的光線為偏振光，鏡筒中有檢偏器（與起偏器方向垂直的偏振片 ）。載物臺可以旋轉(zhuǎn)。用途：用于檢測具有雙折射性的物質(zhì)，如纖

16、維絲、紡錘體、膠原、染色體等。微分干涉差顯微鏡特點：利用兩組平面偏振光的干涉，加強影像的明暗效果， 能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影。標(biāo)本可略厚一點，折射率差別更大，故影像的立體感更強。倒置顯微鏡特點：物鏡與照明系統(tǒng)顛倒；物鏡工作距離較長。用途：用于觀察容器培養(yǎng)的活細胞，三、論述與實驗設(shè)計題1. 設(shè)計一個研究方案利用光學(xué)顯微鏡觀察細胞中的骨架系統(tǒng)即微管系統(tǒng)。將材料3S于製冇PH&8磷繼緩沖液的燒杯中便其下沉。吸2；磷隈緩沖«JUl%TritonX-100 社円30 H'l' J： TricnX-100. 皿緩沖液沖 矢蒔次10彷鐘Q.2% 川氏略R250 染也30分鐘

17、用彌水洗1*2 a.展平置于戦玻片上.加盃璇片，于普通光學(xué)顯徹鏡下觀 瓠 選取杵架形態(tài)雅晰“典型的細胞或細胞群，在適當(dāng)放大倍JR下攝2. 試述聚丙烯酰胺凝膠電泳體系組成及其三種效應(yīng)。聚丙烯酰胺凝膠電泳體系組成：1 不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。2. 濃縮膠是由AP崔化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HC13. 分離膠是由AP崔化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9 Tris-HC1 。4電極緩沖液是pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液。5.2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主

18、要因素。三種效應(yīng)：1)樣品濃縮效應(yīng)(a)凝膠孔徑不連續(xù)性：(b)緩沖體系離子成分及pH直的不連續(xù)性(c)電位梯 度的不連續(xù)性：(2) 分子篩效應(yīng) : 由于分子篩表面積的 95位于孔徑內(nèi)需要通過篩選來甄別鄰近分 子的大小只有小分子才能通過晶體的孔徑開口進入分子篩的內(nèi)吸附表面這種有選擇 的吸附現(xiàn)象被稱為分子篩效應(yīng)(3) 電荷效應(yīng)：各種酶蛋白按其所帶電荷的種類及數(shù)量，在電場作用下向一定電極， 以一定速度泳動。3. 試設(shè)計去壁低滲法制備植物染色體標(biāo)本的實驗方案。實驗原理低滲法原為人類和哺乳動物染色體標(biāo)本的制備方法，后引用于植物。植物根尖分生 組織細胞，經(jīng)果膠酶和纖維素酶處理后，其中膠層的果膠質(zhì)及纖維素

19、構(gòu)成的細胞壁 被消化，成為游離的原生質(zhì)體。然后用低滲溶液處理，使細胞核中的染色體，向細 胞質(zhì)中自然擴散，經(jīng)固定、火焰干燥、染色，即可制備出染色體長度適中、集中而 不重迭、各部分形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰的優(yōu)良染色體標(biāo)本。避免了壓片法的缺點，特別適于 染色體小且多的植物。實驗方法和步驟1. 材料培養(yǎng)種子在恒溫條件下發(fā)芽培養(yǎng)，待根尖長至0.51厘米時進行前處理。2. 前處理 切取0.5厘米長的根尖，用 0 .2 秋水仙素處理 2小時，或用 0.002M 8- 羥 基喹啉處理 2 4小時。3. 前低滲 吸干預(yù)處理液，滴入 0.075M KCL溶液，在室溫下處理30分鐘，其中更換低 滲液兩次。4. 去壁 吸干低滲液，用蒸餾水洗一次，滴入 2.5 果膠酶和纖維素酶混合液，以全 部材料浸沒為度，加蓋，在 30 C條件下處理25小時，其中將材料瓶輕輕搖動數(shù)次， 促使酶反應(yīng)充分。5. 后低滲 吸干酶液 (將酶液放到另一棕瓶置冰箱內(nèi)保存，可反復(fù)使用 ) ，用蒸餾水慢慢洗 2次，然后在蒸餾水中靜止 10 20分鐘，進行后低滲。6. 固定 吸干蒸餾水，加入新配制的甲醇 :冰醋酸 (3:1) 固定液 3毫升。7. 制片 取根尖 1 3個，放在清潔的載片上，加一滴固定液，用鑷子將根尖挾碎，如 太干，可再滴一滴固定液再行挾碎，去掉殘渣。8. 火焰干燥 將載片在酒精燈焰火上微微烘