1、第四章第四章 核酸的結構與功能核酸的結構與功能Chapter 4 Structure and Function of Nucleic Acid 主要內(nèi)容 核酸的化學組成核酸的化學組成 核酸的一級結構核酸的一級結構 DNA的空間結構與功能的空間結構與功能 RNA的空間結構與功能的空間結構與功能 核酸的理化性質及其應用核酸的理化性質及其應用 核酸酶核酸酶教學目的教學目的: 1.了解核酸的化學組成了解核酸的化學組成 2.掌握核酸的結構與功能掌握核酸的結構與功能 3.掌握核酸的理化性質及應用掌握核酸的理化性質及應用教學重點難點教學重點難點: DNA的雙螺旋結構的雙螺旋結構;mRNA的結構與功的結構與功

2、能能;DNA的復性與分子雜交的復性與分子雜交教學課時教學課時:8核酸是存在于細胞中的一類大分子酸性物質，核酸是存在于細胞中的一類大分子酸性物質，包括包括 核糖核酸（核糖核酸（ribonucliec acid ,RNARNA） 脫氧核糖核酸（脫氧核糖核酸（deoxyribonucliec acid DNADNA）RNARNA和和DNADNA都是以都是以單核苷酸單核苷酸為基本單位所組成為基本單位所組成的多核苷酸長鏈。的多核苷酸長鏈。RNARNA主要參與遺傳信息的主要參與遺傳信息的表達表達，而，而DNADNA則是遺則是遺傳信息的傳信息的載體載體。 核酸的發(fā)現(xiàn)及發(fā)展 1869年，瑞士外科醫(yī)生Miesc

3、her從傷口繃帶的膿細胞核中分離出酸性很強的物質，稱為核素。 1944年，Avery通過肺炎雙球菌轉化實驗證實了DNA是遺傳的物質基礎。 1953年Watson和Crick提出DNA的雙螺旋結構模型，從此，核酸的研究成了生命科學中最活躍的領域之一。 1944年，年，Avery肺炎雙球菌轉化實驗肺炎雙球菌轉化實驗噬菌體轉化實驗噬菌體轉化實驗1953. Watson & Crick1953. Watson & Crick Right handed B-form DNA Right handed B-form DNA Double helix Model Double helix M

4、odel Sectiom 1 Sectiom 1 核酸的化學組成核酸的化學組成 磷磷酸酸 核核糖糖 核核酸酸核核苷苷酸酸 戊戊糖糖 核核苷苷 脫脫氧氧核核糖糖 嘌嘌呤呤堿堿 含含氮氮堿堿 嘧嘧啶啶堿堿 核酸的水解產(chǎn)物：核酸的水解產(chǎn)物：1. 1. 嘧啶堿嘧啶堿( (Pyrimidine bases ) )： 尿嘧啶尿嘧啶 胞嘧啶胞嘧啶 胸腺嘧啶胸腺嘧啶2. 2. 嘌呤堿嘌呤堿( (Purine bases ) )： 腺嘌呤腺嘌呤 鳥嘌呤鳥嘌呤二、戊糖與核苷二、戊糖與核苷 1 1戊糖戊糖( (pentose ) )： -D-D-核糖核糖 -D-2-D-2-脫氧核糖脫氧核糖2 2核苷：核苷： 核苷核

5、苷是由戊糖與含氮堿基經(jīng)脫水縮合而是由戊糖與含氮堿基經(jīng)脫水縮合而生成的化合物。生成的化合物。 在大多數(shù)情況下，核苷是由核糖或脫氧在大多數(shù)情況下，核苷是由核糖或脫氧核糖的核糖的C1 -C1 -羥基與嘧啶堿羥基與嘧啶堿N1N1或嘌呤或嘌呤堿堿N9N9進行縮合，故生成的化學鍵稱為進行縮合，故生成的化學鍵稱為，N N糖苷鍵糖苷鍵。 腺苷腺苷(AR) 脫氧胞苷脫氧胞苷(dCR)1,N9-糖苷鍵糖苷鍵 1,N1-糖苷鍵糖苷鍵11N9N1 “稀有核苷稀有核苷”是由是由“稀有堿基稀有堿基”所生成的所生成的核苷。核苷。假尿苷（假尿苷（）1,C5-糖苷鍵糖苷鍵1C5三、核苷酸的結構與命名三、核苷酸的結構與命名 核苷

6、酸核苷酸是由核苷與磷酸經(jīng)脫水縮合后生是由核苷與磷酸經(jīng)脫水縮合后生成的磷酸酯類化合物，包括成的磷酸酯類化合物，包括核糖核苷酸核糖核苷酸和和脫氧核糖核苷酸脫氧核糖核苷酸兩大類。兩大類。 由于與磷酸基縮合的位置不同而分別由于與磷酸基縮合的位置不同而分別生成生成2-2-核苷酸、核苷酸、3-3-核苷酸和核苷酸和5-5-核核苷酸。最常見者為苷酸。最常見者為5-5-核苷酸核苷酸（5 5 常常被省略）。被省略）。 核苷酸的分子結構核苷酸的分子結構 5-5-核苷酸又可按其在核苷酸又可按其在55位縮合的磷酸位縮合的磷酸基的多少，分為一磷酸核苷基的多少，分為一磷酸核苷( (NMPNMP) )（核苷（核苷酸）、二磷酸

7、核苷酸）、二磷酸核苷( (NDPNDP) )和三磷酸核苷和三磷酸核苷( (NTPNTP) )。 環(huán)核苷酸的分子結構環(huán)核苷酸的分子結構環(huán)一磷酸腺苷環(huán)一磷酸腺苷 環(huán)一磷酸鳥苷環(huán)一磷酸鳥苷核苷酸的命名及縮寫符號核苷酸的命名及縮寫符號脫氧脫氧堿基堿基磷酸基數(shù)目磷酸基數(shù)目磷酸磷酸dAMPGDTTCUSection 2 Section 2 核酸的一級結構核酸的一級結構 一分子的核苷一分子的核苷酸的酸的3-3-位羥位羥基與另一分子基與另一分子核苷酸的核苷酸的5-5-位磷酸基通過位磷酸基通過脫 水 可 形 成脫 水 可 形 成3,5-3,5-磷酸磷酸二酯鍵二酯鍵，從而，從而將兩分子核苷將兩分子核苷酸連接起來。

8、酸連接起來。 多核苷酸鏈：多核苷酸鏈：核酸就是由許多核酸就是由許多核苷酸核苷酸單位單位通過通過3,5-3,5-磷酸磷酸二酯鍵連接起來形成的二酯鍵連接起來形成的不含側鏈的長鏈狀化合不含側鏈的長鏈狀化合物。物。核酸是核酸是具有方向性具有方向性的長的長鏈狀化合物，多核苷酸鏈狀化合物，多核苷酸鏈的兩端，一端稱為鏈的兩端，一端稱為5-5-端，另一端稱為端，另一端稱為3-3-端。端。 DNADNA分子主要由分子主要由dAMPdAMP、dGMPdGMP、dCMPdCMP和和dTMPdTMP四種脫氧核糖核苷酸所組成。四種脫氧核糖核苷酸所組成。DNADNA的一級結構的一級結構就是指就是指DNADNA分子中脫氧核

9、糖分子中脫氧核糖核苷酸的排列順序及連接方式。核苷酸的排列順序及連接方式。 RNARNA分子主要由分子主要由AMPAMP，GMPGMP，CMPCMP，UMPUMP四四種核糖核苷酸組成。種核糖核苷酸組成。RNARNA的一級結構的一級結構就就是指是指RNARNA分子中核糖核苷酸的排列順序分子中核糖核苷酸的排列順序及連接方式。及連接方式。 5-AGTCCATG-3 A G T C C P P P P P OH5-AGUCCAUG-3核酸一級結構的表示方法核酸一級結構的表示方法Section 3 DNASection 3 DNA的空間結構與功能的空間結構與功能一、一、DNADNA的二級結構的二級結構雙螺

10、旋結構模型雙螺旋結構模型 DNADNA雙螺旋結構是雙螺旋結構是DNADNA二級結構的一種重二級結構的一種重要形式，它是要形式，它是WatsonWatson和和CrickCrick兩位科學家兩位科學家于于19531953年提出來的一種結構模型。年提出來的一種結構模型。一、一、 DNA分子模型建立分子模型建立 1.Chargaff 堿基組成規(guī)律堿基組成規(guī)律 2.DNA晶體的晶體的X-射線圖譜研究射線圖譜研究 各原子之間的鍵長、鍵角各原子之間的鍵長、鍵角（一）（一）DNADNA雙螺旋結構的研究背景：雙螺旋結構的研究背景： 1950195019531953，ChargaffChargaff研究小組對研

11、究小組對DNADNA的化學的化學組成進行了研究，發(fā)現(xiàn)：組成進行了研究，發(fā)現(xiàn)： DNA DNA堿基組成有物種差異，且物種親緣關系越堿基組成有物種差異，且物種親緣關系越遠，差異越大；遠，差異越大； 相同物種，不同組織器官中相同物種，不同組織器官中DNADNA堿基組成相同，堿基組成相同，而且不因年齡、環(huán)境及營養(yǎng)而改變；而且不因年齡、環(huán)境及營養(yǎng)而改變； DNA DNA分子中四種堿基的摩爾百分比具有一定的分子中四種堿基的摩爾百分比具有一定的規(guī)律性，即規(guī)律性，即A=TA=T、G=CG=C、A+G=T+CA+G=T+C。這一規(guī)律被。這一規(guī)律被稱為稱為ChargaffChargaff原則原則。 1953195

12、3年由年由WilkinsWilkins研究小組完成的研究研究小組完成的研究工作，發(fā)現(xiàn)了工作，發(fā)現(xiàn)了DNADNA晶體的晶體的X X線衍射圖譜中線衍射圖譜中存在兩種周期性反射，并證明存在兩種周期性反射，并證明DNADNA是一是一種螺旋構象。種螺旋構象。 （二）（二）DNADNA雙螺旋結構模型的要點：雙螺旋結構模型的要點：目前已知目前已知DNADNA雙雙螺旋結構可分螺旋結構可分為為A A、B B、C C、D D及及Z Z型等數(shù)種，型等數(shù)種，除除Z Z型為左手雙型為左手雙螺旋外，其余螺旋外，其余均為右手雙螺均為右手雙螺旋。旋。 B B型雙螺旋型雙螺旋DNADNA的結構特征的結構特征 堿基配對及氫鍵形成

13、堿基配對及氫鍵形成B B型雙螺旋型雙螺旋DNADNA的結構特點：的結構特點：1.1.由兩條反向平行的脫氧多核苷酸由兩條反向平行的脫氧多核苷酸（兩條鏈的走向為（兩條鏈的走向為53和和35），圍），圍繞一中心軸（假想軸）構成繞一中心軸（假想軸）構成右手雙螺旋右手雙螺旋結構。結構。2.2.磷酸基與脫氧核糖在外側彼此間以磷酸磷酸基與脫氧核糖在外側彼此間以磷酸二酯鍵相連，構成的骨架二酯鍵相連，構成的骨架主鏈，主鏈，堿基位于內(nèi)側堿基位于內(nèi)側；堿基平面與中心軸垂直，堿基平面與中心軸垂直，各相鄰平面部分重疊各相鄰平面部分重疊;糖環(huán)平面與中心糖環(huán)平面與中心 軸平行。軸平行。3. 3. 兩條鏈間存在兩條鏈間存在堿

14、基互補堿基互補：A A與與T T或或G G與與C C配配對形成氫鍵，稱為堿基互補原則（對形成氫鍵，稱為堿基互補原則（A A與與T T為兩個氫鍵，為兩個氫鍵，G G與與C C為三個氫鍵為三個氫鍵）；）；4. 4. 螺旋的穩(wěn)定因素為螺旋的穩(wěn)定因素為氫鍵和堿基堆砌力氫鍵和堿基堆砌力；5. 5. 螺旋的螺旋的直徑為直徑為2nm2nm, ,沿軸向，每個堿基平沿軸向，每個堿基平面面 的距離為的距離為0.34nm,每圈螺旋含有每圈螺旋含有10對對 核苷酸核苷酸,螺距為螺距為3.4nm3.4nm，二、二、DNADNA的超螺旋結構的超螺旋結構（一）原核生物（一）原核生物DNADNA的三級結構：的三級結構：絕大多

15、數(shù)原核生物絕大多數(shù)原核生物的的DNADNA都是共價封都是共價封閉的環(huán)狀雙螺旋。閉的環(huán)狀雙螺旋。如果再進一步盤繞如果再進一步盤繞則形成麻花狀的超則形成麻花狀的超螺旋三級結構。螺旋三級結構。 （二）真核生物中的核小體結構：（二）真核生物中的核小體結構：在真核生物中，在真核生物中，雙螺旋的雙螺旋的DNADNA分分子圍繞一蛋白質子圍繞一蛋白質八聚體進行盤繞，八聚體進行盤繞，從而形成特殊的從而形成特殊的串珠狀結構，稱串珠狀結構，稱為為核小體核小體。核小。核小體結構屬于體結構屬于DNADNA的三級結構。的三級結構。三、DNA的功能 DNA的基本功能是作為遺傳信息的載體，為生物遺傳信息復制以及基因信息的轉錄

16、提供模板。 DNA分子中具有特定生物學功能的片段稱為基因（gene）。一個生物體的全部DNA序列稱為基因組（genome）?；蚪M的大小與生物的復雜性有關，如病毒SV40的基因組大小為5.1103bp，大腸桿菌為5.7106bp，人為3109bp。嘌呤Section 4 RNASection 4 RNA的空間結構與功能的空間結構與功能 RNARNA通常以單鏈形式存在，但也可形成通常以單鏈形式存在，但也可形成局局部的雙螺旋部的雙螺旋結構。結構。 RNARNA分子的種類較多，分子大小變化較大，分子的種類較多，分子大小變化較大，功能多樣化。功能多樣化。主要的主要的RNARNA種類有種類有rRNArR

17、NA、mRNAmRNA、tRNAtRNA、HnRNAHnRNA、SnRNASnRNA、SnoRNASnoRNA、ScRNAScRNA等。等。 一、一、mRNAmRNA的結構與功能的結構與功能mRNAmRNA可形成局部雙螺旋結構的二級結構?？尚纬删植侩p螺旋結構的二級結構。mRNAmRNA在真核生物中的初級產(chǎn)物稱為在真核生物中的初級產(chǎn)物稱為HnRNAHnRNA。大多數(shù)真核成熟的大多數(shù)真核成熟的mRNAmRNA分子具有典型的分子具有典型的5-5-端的端的7-7-甲基鳥苷三磷酸（甲基鳥苷三磷酸（m m7 7GTPGTP）帽帽子結構和子結構和3-3-端的端的多聚腺苷酸多聚腺苷酸(polyA)(polyA

18、)尾尾巴結構。巴結構。 真核生物真核生物mRNA 5-mRNA 5-端帽子結構端帽子結構真核生物真核生物mRNA 3-mRNA 3-端的端的polyApolyA結構結構 mRNAmRNA分子中帶有遺傳密碼，其功能分子中帶有遺傳密碼，其功能是為蛋白質的合成提供是為蛋白質的合成提供模板模板。 mRNAmRNA分子中每三個相鄰的核苷酸組分子中每三個相鄰的核苷酸組成一組，在蛋白質翻譯合成時代表一成一組，在蛋白質翻譯合成時代表一個特定的氨基酸，這種核苷酸三聯(lián)體個特定的氨基酸，這種核苷酸三聯(lián)體稱為稱為遺傳密碼遺傳密碼（codencoden） 二、二、tRNAtRNA的結構與功能的結構與功能 tRNAtRN

19、A是分子最小，但含有是分子最小，但含有稀有堿基最多稀有堿基最多的的RNARNA，其稀有堿基的含量可多達，其稀有堿基的含量可多達20%20%。 tRNAtRNA是保守性最強的是保守性最強的RNARNA。 tRNAtRNA是單鏈核酸，但其分子中的某些局是單鏈核酸，但其分子中的某些局部也可形成雙螺旋結構。部也可形成雙螺旋結構。 （一）（一）tRNAtRNA的二級結構：的二級結構： tRNAtRNA的二級結構由于局部雙螺旋的形成的二級結構由于局部雙螺旋的形成而呈現(xiàn)而呈現(xiàn)“三葉草三葉草”形，故稱為形，故稱為“三葉草三葉草”結構。結構。 tRNAtRNA的的“三葉草三葉草”形結構包括：形結構包括：氨基酸氨

20、基酸臂、臂、DHUDHU臂、反密碼臂、可變臂和臂、反密碼臂、可變臂和TCTC臂臂五部分。五部分。氨基酸臂氨基酸臂可變臂可變臂DHU臂臂反密碼臂反密碼臂TC臂臂（二）（二）tRNAtRNA的三級結構：的三級結構：三、三、rRNArRNA的結構與功能的結構與功能 rRNArRNA是細胞中是細胞中含量最多含量最多的的RNARNA，占總量的占總量的80%80%。rRNArRNA與蛋白質一與蛋白質一起構成核蛋白體，作為蛋白質生起構成核蛋白體，作為蛋白質生物合成的場所。物合成的場所。在原核生物中，在原核生物中，rRNArRNA有三種：有三種：5S5S，16S16S，23S23S。其中，。其中，16S16S

21、的的rRNArRNA參與構成核蛋白參與構成核蛋白體的小亞基，而體的小亞基，而5S5S和和23S23S的的rRNArRNA參與構參與構成核蛋白體大亞基。成核蛋白體大亞基。在真核生物中，在真核生物中，rRNArRNA有四種：有四種：5S5S，5.8S5.8S，18S18S，28S28S。其中，。其中，18S18S的的rRNArRNA參與構成參與構成核蛋白體小亞基，其余的核蛋白體小亞基，其余的rRNArRNA參與構成參與構成核蛋白體大亞基。核蛋白體大亞基。大腸桿菌大腸桿菌16S rRNA16S rRNA的二級結構的二級結構四、核酶四、核酶 具有自身催化作用的具有自身催化作用的RNARNA稱為核酶稱為

22、核酶（ribozymeribozyme），核酶通常具有特殊的），核酶通常具有特殊的分子結構，如錘頭結構。分子結構，如錘頭結構。Section 5 DNASection 5 DNA的理化性質及其應用的理化性質及其應用一、核酸的一般理化性質一、核酸的一般理化性質 1 1、性狀：、性狀：RNARNA及其組分核苷酸、核苷、及其組分核苷酸、核苷、嘌呤堿、嘧啶堿的純品都呈白色的粉末或嘌呤堿、嘧啶堿的純品都呈白色的粉末或結晶；結晶；DNADNA則為疏松的石棉一樣的纖維狀固則為疏松的石棉一樣的纖維狀固體體。核酸具有酸性；粘度大；能吸收紫外核酸具有酸性；粘度大；能吸收紫外光，最大吸收峰為光，最大吸收峰為260n

23、m260nm。2 2、溶解性：、溶解性：RNARNA和和DNADNA是極性的化合物都微溶于水不溶于乙醇是極性的化合物都微溶于水不溶于乙醇乙醚、氯仿等有機溶劑。它們的鈉鹽易溶于水。乙醚、氯仿等有機溶劑。它們的鈉鹽易溶于水。 在生物細胞內(nèi)都與蛋白質結合成在生物細胞內(nèi)都與蛋白質結合成核蛋白核蛋白。DNADNA核核蛋白蛋白(DNP)(DNP)與與RNARNA核蛋白核蛋白(RNP)(RNP)的溶解度受溶液的的溶解度受溶液的鹽濃度的影響而不同。鹽濃度的影響而不同。DNPDNP溶于水和濃鹽溶液，在溶于水和濃鹽溶液，在1mol/L1mol/L的的NaClNaCl溶液中溶液中溶解度比純水高溶解度比純水高2 2倍

24、，但在倍，但在0.14mol/L0.14mol/L的的NaClNaCl溶液溶液中溶解度最低，僅為水的中溶解度最低，僅為水的1%1%，幾乎不溶解；，幾乎不溶解；RNPRNP在鹽溶液中其溶解度受鹽濃度的影響較小，在鹽溶液中其溶解度受鹽濃度的影響較小，在在0.14mol/L0.14mol/L的的NaClNaCl溶解度較大。因此，溶解度較大。因此，在核酸在核酸的提取中，常用此法將兩種核蛋白分開，然后用的提取中，常用此法將兩種核蛋白分開，然后用蛋白質變性劑去除蛋白質蛋白質變性劑去除蛋白質。（如用苯酚抽提）。（如用苯酚抽提）3 3、 沉降特性（沉降特性（DNADNA）不同構象的核酸（線形、環(huán)形、超螺旋），

25、浮力不同構象的核酸（線形、環(huán)形、超螺旋），浮力密度和沉降速率不同，用密度和沉降速率不同，用Cs-ClCs-Cl密度梯度離心就可密度梯度離心就可以將它們區(qū)分開來，這一方法常用于質粒以將它們區(qū)分開來，這一方法常用于質粒DNADNA的純的純化?；Ｏ鄬Τ两党?shù)：相對沉降常數(shù)：線型雙螺旋分子線型雙螺旋分子 1.001.00松馳雙鏈閉環(huán)松馳雙鏈閉環(huán) 1.141.14切刻雙鏈環(huán)切刻雙鏈環(huán) 1.141.14單鏈環(huán)單鏈環(huán) 1.141.14線型單鏈線型單鏈 1.301.30正超或負超螺旋雙鏈環(huán)狀正超或負超螺旋雙鏈環(huán)狀 1.411.41離離心心機機結結構構示示意意圖圖轉頭轉頭轉頭腔轉頭腔沉降樣品沉降樣品驅動馬達驅

26、動馬達 真空真空 冷凍冷凍 沉降系數(shù)沉降系數(shù) 生物大分子在單位離心力場作用下的沉降速度生物大分子在單位離心力場作用下的沉降速度稱為沉降系數(shù)。即沉降系數(shù)是微顆粒在離心力場稱為沉降系數(shù)。即沉降系數(shù)是微顆粒在離心力場的作用下，從靜止狀態(tài)到達極限速度所需要的時的作用下，從靜止狀態(tài)到達極限速度所需要的時間。間。數(shù)學定義式為：數(shù)學定義式為： 沉降系數(shù)單位沉降系數(shù)單位：由于蛋白質、核酸、病毒等的沉：由于蛋白質、核酸、病毒等的沉降系數(shù)介于降系數(shù)介于1 11010-13-13到到2002001010-13-13秒的范圍，為方便秒的范圍，為方便起見，把作為沉降系數(shù)的一個單位，用起見，把作為沉降系數(shù)的一個單位，用S

27、vedbergSvedberg單單位，用即位，用即S S表示。表示。沉降系數(shù)（沉降系數(shù)（s s）與相對分子量（）與相對分子量（MrMr）的關系）的關系: :Mr =RTsD(1-)Svedberg方程方程:d /dt 2 s =s =天然天然DNA變性變性DNA核苷酸總吸收值核苷酸總吸收值1232202402602800.10.20.30.4波長（波長（nmnm）光光吸吸收收123二、二、DNADNA的變性的變性 在理化因素作用下，在理化因素作用下，DNADNA雙螺旋的兩條互雙螺旋的兩條互補鏈松散而分開成為單鏈，從而導致補鏈松散而分開成為單鏈，從而導致DNADNA的理化性質及生物學性質發(fā)生改變

28、，這的理化性質及生物學性質發(fā)生改變，這種現(xiàn)象稱為種現(xiàn)象稱為DNADNA的變性的變性。 引起引起DNADNA變性的因素主要有：變性的因素主要有：高溫，高溫，強酸強堿，強酸強堿，有機溶劑等。有機溶劑等。 DNADNA的變性過程的變性過程加熱加熱部分雙螺旋解開部分雙螺旋解開 無規(guī)則線團無規(guī)則線團 鏈內(nèi)堿基配對鏈內(nèi)堿基配對DNADNA變性后的性質改變：變性后的性質改變：增色效應增色效應：指：指DNADNA變性后對變性后對260nm260nm紫外光的光紫外光的光吸收度增加的現(xiàn)象；吸收度增加的現(xiàn)象；旋光性下降；旋光性下降；粘度降低；粘度降低；生物學功能喪失或改變。生物學功能喪失或改變。 DNADNA的變性

29、發(fā)生在一個很窄的溫度的變性發(fā)生在一個很窄的溫度范圍內(nèi)，通常把熱變性過程中范圍內(nèi)，通常把熱變性過程中A260A260達到最大值一半時的溫度稱為該達到最大值一半時的溫度稱為該DNADNA的的熔解溫度，用熔解溫度，用TmTm表示。表示。 Tm的大小與的大小與DNA分子分子中（中（G+C）的百分含量）的百分含量成正比測定成正比測定Tm值可推值可推算核酸堿基組成及判斷算核酸堿基組成及判斷DNA純度純度。影響影響的因素的因素1 1）G+CG+C的含量越高，則的含量越高，則TmTm越高越高。三、三、DNADNA的復性與分子雜交的復性與分子雜交將熱變性后的將熱變性后的DNADNA溶液緩慢冷卻，在低于溶液緩慢冷

30、卻，在低于變性溫度約變性溫度約25253030的條件下保溫一段的條件下保溫一段時間（時間（退火退火），則變性的兩條單鏈），則變性的兩條單鏈DNADNA可可以重新互補而形成原來的雙螺旋結構并以重新互補而形成原來的雙螺旋結構并恢復原有的性質?；謴驮械男再|。將變性將變性DNADNA經(jīng)退火處理，使其重新形成雙經(jīng)退火處理，使其重新形成雙螺旋結構的過程，稱為螺旋結構的過程，稱為DNADNA的復性的復性。 DNADNA的復性不僅受溫度影響，還受的復性不僅受溫度影響，還受DNADNA自身特性等其它因素的影響：自身特性等其它因素的影響：A A、溫度和時間、溫度和時間：一般認為比：一般認為比TmTm低低2525

31、左左右的溫度是復性的最佳條件，越遠離此溫右的溫度是復性的最佳條件，越遠離此溫度，復性速度就越慢。復性時溫度下降必度，復性速度就越慢。復性時溫度下降必須是一緩慢過程，若在超過須是一緩慢過程，若在超過TmTm的溫度下迅的溫度下迅速冷卻至低溫速冷卻至低溫( (如如44以下以下) )，復性幾乎是，復性幾乎是不可能的，核酸實驗中經(jīng)常以此方式保持不可能的，核酸實驗中經(jīng)常以此方式保持DNADNA的變性的變性( (單鏈單鏈) )狀態(tài)。這說明降溫時間狀態(tài)。這說明降溫時間太短以及溫差大均不利于復性。太短以及溫差大均不利于復性。B B、DNADNA濃度：濃度：溶液中溶液中DNADNA分子越多，相互分子越多，相互碰撞

32、結合的機會越大，有利于復性。碰撞結合的機會越大，有利于復性。 兩條來源不同的單鏈核酸（兩條來源不同的單鏈核酸（DNADNA或或RNARNA），只要它們有大致相同的互補堿），只要它們有大致相同的互補堿基順序，經(jīng)退火處理即可復性，形成基順序，經(jīng)退火處理即可復性，形成新的雜種雙螺旋，這一現(xiàn)象稱為新的雜種雙螺旋，這一現(xiàn)象稱為核酸核酸的分子雜交的分子雜交。 核酸雜交可以是核酸雜交可以是DNA-DNADNA-DNA，也可以是，也可以是DNA-RNADNA-RNA雜交。雜交。 不同來源的，具有大致相同互補堿基不同來源的，具有大致相同互補堿基順序的核酸片段稱為順序的核酸片段稱為同源順序同源順序。 利用核酸的分

33、子雜交，可以確定或尋找利用核酸的分子雜交，可以確定或尋找不同物種中具有同源順序的不同物種中具有同源順序的DNADNA或或RNARNA片片段。段。 常用的核酸分子雜交技術有：常用的核酸分子雜交技術有：原位雜交、原位雜交、斑點雜交、斑點雜交、SouthernSouthern雜交及雜交及NorthernNorthern雜雜交交等。等。在核酸雜交分析過程中，常將已知順序在核酸雜交分析過程中，常將已知順序的核酸片段用放射性同位素或生物素進的核酸片段用放射性同位素或生物素進行標記。這種帶有一定標記的已知順序行標記。這種帶有一定標記的已知順序的核酸片段稱為的核酸片段稱為探針探針。 核酸的變性、復性和雜交核酸

34、的變性、復性和雜交變性（加熱）變性（加熱）探針探針雜交（緩慢冷卻）雜交（緩慢冷卻）復性（緩慢冷卻）復性（緩慢冷卻） 復 性復 性 ：在 一 定 條在 一 定 條件 下 ， 變件 下 ， 變性性DNA DNA 單單鏈 間 堿 基鏈 間 堿 基重 新 配 對重 新 配 對恢 復 雙 螺恢 復 雙 螺旋 結 構 ，旋 結 構 ，伴有伴有A A260260減減小 （ 減 色小 （ 減 色效應效應）,DNA的功的功能恢復。能恢復。分子雜交的方法分子雜交的方法基本步驟基本步驟先將兩種生物的先將兩種生物的DNADNA分子從細胞中提取出來分子從細胞中提取出來, ,通過加熱或提高通過加熱或提高pHpH的方法的方

35、法, ,將雙鏈將雙鏈DNADNA分子分離成分子分離成為單鏈為單鏈, ,這個過程稱為變性。這個過程稱為變性。將兩種生物的將兩種生物的DNADNA單鏈放在一起雜交單鏈放在一起雜交, ,其中一種生其中一種生物的物的DNADNA單鏈事先用同位素進行標記（探針）。如果單鏈事先用同位素進行標記（探針）。如果兩種生物兩種生物DNADNA分子之間存在互補的部分分子之間存在互補的部分, ,就能形成雙就能形成雙鏈區(qū)。鏈區(qū)。 檢測：由于同位素被檢出的靈敏度高檢測：由于同位素被檢出的靈敏度高, ,即使兩種生即使兩種生物物DNADNA分子之間形成百萬分之一的雙鏈區(qū)分子之間形成百萬分之一的雙鏈區(qū), ,也能夠被也能夠被檢出

36、。檢出。主要方法：菌落原位雜交、斑點雜交、狹縫雜交、主要方法：菌落原位雜交、斑點雜交、狹縫雜交、SouthernSouthern印跡雜交、印跡雜交、NorthernNorthern印跡雜交、組織原位印跡雜交、組織原位雜交和夾心雜交等。雜交和夾心雜交等。實例：實例：southernsouthern印跡印跡法法（顯著特點是硝酸纖維（顯著特點是硝酸纖維素濾膜能與單股素濾膜能與單股DNADNA強力結合）強力結合）將將DNADNA標本用標本用限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶消化，消化，經(jīng)經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段，分離各酶解片段，然后經(jīng)然后經(jīng)堿變性堿變性，TrisTris緩沖液中和，高鹽下通過

37、緩沖液中和，高鹽下通過毛吸作用將毛吸作用將DNADNA從凝膠中從凝膠中轉印轉印至硝酸纖維素濾膜上至硝酸纖維素濾膜上將硝酸纖維素濾膜將硝酸纖維素濾膜烘干烘干固定。凝膠中固定。凝膠中DNADNA片段的片段的相對位置在轉移到濾膜的過程中保持不變相對位置在轉移到濾膜的過程中保持不變附著在濾膜上的附著在濾膜上的DNADNA與與3232P P標記的探針雜交標記的探針雜交利用利用放射自顯影術放射自顯影術確定探針互補的每條確定探針互補的每條DNADNA帶的帶的位置位置，從而可以確定在眾多酶解產(chǎn)物中含某一，從而可以確定在眾多酶解產(chǎn)物中含某一特特定序列的定序列的DNADNA片段的位置和大小片段的位置和大小。 So

38、uthern印跡法印跡法DNA分子分子限制片段限制片段限制性酶切割限制性酶切割瓊脂糖電泳瓊脂糖電泳轉移至硝酸纖維素膜上轉移至硝酸纖維素膜上與放射性標記與放射性標記DNA探針雜交探針雜交放射自顯影放射自顯影帶有帶有DNA片段片段的凝膠的凝膠凝膠凝膠濾膜濾膜用緩沖液轉用緩沖液轉移移DNA吸附有吸附有DNA片段的膜片段的膜堿變性堿變性Section 6 Section 6 核酸的水解核酸的水解（一）酸、堿水解（一）酸、堿水解 核酸分子中的磷酸二酯鍵可在酸或堿性條件下水解核酸分子中的磷酸二酯鍵可在酸或堿性條件下水解切斷。切斷。 1.1.酸水解酸水解: : C-N C-N糖苷鍵對酸不穩(wěn)定糖苷鍵對酸不穩(wěn)定

39、, ,常溫下稀酸溶液中常溫下稀酸溶液中, ,嘌呤嘌呤堿基首先被水解下來堿基首先被水解下來, ,產(chǎn)物稱產(chǎn)物稱“無嘌呤核酸無嘌呤核酸”。如。如果提高溫度或酸的濃度，可使果提高溫度或酸的濃度，可使DNADNA和和RNARNA全部水解，全部水解，得到堿基、戊糖、磷酸三種產(chǎn)物。得到堿基、戊糖、磷酸三種產(chǎn)物。 2.2.堿水解：堿水解： DNADNA對堿穩(wěn)定，不易被水解。對堿穩(wěn)定，不易被水解。 RNARNA對堿不穩(wěn)定，易被水解。對堿不穩(wěn)定，易被水解。例如，在例如，在0.1 mol/L NaOH0.1 mol/L NaOH溶液中，溶液中，RNARNA幾乎可以幾乎可以完全水解，生成完全水解，生成2-2-或或3-

40、3-磷酸核苷；磷酸核苷；DNADNA在在同樣條件下則不受影響。同樣條件下則不受影響。這種水解性能上的差別，與這種水解性能上的差別，與RNARNA核糖基上核糖基上2-2-OHOH參與作用參與作用有關。在有關。在RNARNA水解時，水解時，2-OH2-OH首先首先進攻磷酸基，在斷開磷酯鍵的同時形成進攻磷酸基，在斷開磷酯鍵的同時形成環(huán)狀磷環(huán)狀磷酸二酯，酸二酯，再在堿的作用形成水解產(chǎn)物。再在堿的作用形成水解產(chǎn)物。在克隆上的應用：在克隆上的應用：mRNAmRNA 逆轉錄逆轉錄 mRNAmRNAcDNAcDNA 堿水解堿水解cDNAcDNA 復制復制（二）酶水解（二）酶水解A A 定義：定義：生物體內(nèi)存在

41、多種核酸水解酶。這些酶生物體內(nèi)存在多種核酸水解酶。這些酶可以催化水解多聚核苷酸鏈中的磷酸二酯鍵稱為可以催化水解多聚核苷酸鏈中的磷酸二酯鍵稱為核酸酶核酸酶。 B B 分類：分類：以底物分類：以底物分類： a.a.以以DNADNA為底物的為底物的DNADNA水解酶（水解酶（DNasesDNases） b.b.以以RNARNA為底物的為底物的RNARNA水解酶（水解酶（RNasesRNases）根據(jù)作用方式又分作兩類：根據(jù)作用方式又分作兩類： a.a.核酸外切酶核酸外切酶基因工程中最常用的工具酶之一基因工程中最常用的工具酶之一 基因基因工程的工程的手術刀手術刀沒有限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和應用，就很難沒有

42、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和應用，就很難有今天分子生物學與基因工程的快速發(fā)展。有今天分子生物學與基因工程的快速發(fā)展。功能：功能：根據(jù)需要在特定的位點精確切割雙鏈根據(jù)需要在特定的位點精確切割雙鏈DNADNA分分子子Section 7Section 7 核酸的研究方法核酸的研究方法 核酸分離純化核酸分離純化 核酸凝膠電泳核酸凝膠電泳 DNA序列分析序列分析 DNA合成（合成探針、引物、基因）合成（合成探針、引物、基因）一一. .核酸的分離、提純核酸的分離、提純要求要求:防止核酸的降解和變性盡可能保持其防止核酸的降解和變性盡可能保持其天然態(tài)；條件溫和天然態(tài)；條件溫和,防止過酸過堿防止過酸過堿.避免劇避免劇烈

43、攪拌烈攪拌,防止核酸酶作用。防止核酸酶作用。（一）（一） DNA分離純化分離純化真核真核DNA以核蛋白（以核蛋白（DNP）形式存在，）形式存在，DNP溶于水和濃鹽（溶于水和濃鹽（1mol/L）,但不溶于但不溶于0.14mol/L NaCl中中,利用此性質利用此性質,可將可將DNP與與RNA核蛋白分開核蛋白分開,提取出提取出DNP。DNP可用水飽和的酚抽提，去除蛋白質。可用水飽和的酚抽提，去除蛋白質。還可用氯仿異戊醇去除蛋白質還可用氯仿異戊醇去除蛋白質（二）（二） RNA分離純化分離純化 用用0.14mol/L NaCl使使DNP沉淀，上沉淀，上清中即為清中即為RNA核蛋白（核蛋白（RNP）。）

44、。去蛋白：鹽酸胍、苯酚等。必須防去蛋白：鹽酸胍、苯酚等。必須防止止RNA酶對酶對RNA的破壞。的破壞。（三）（三） 核酸含量的測定核酸含量的測定1.1.紫外分光光度法紫外分光光度法2.2.定磷法：定磷法：鉬藍比色法：先用濃硫酸或過氯酸水解有機鉬藍比色法：先用濃硫酸或過氯酸水解有機磷成無機磷，在酸性條件下正磷酸與鉬酸作磷成無機磷，在酸性條件下正磷酸與鉬酸作用生成磷鉬酸，被還原劑還原成鉬藍，在用生成磷鉬酸，被還原劑還原成鉬藍，在660nm660nm處有最大吸收峰處有最大吸收峰3.3.定糖法定糖法RNARNA與鹽酸共熱核糖轉變成糠醛，與甲基苯二與鹽酸共熱核糖轉變成糠醛，與甲基苯二酚反應呈鮮綠色最大吸

45、收峰酚反應呈鮮綠色最大吸收峰670nm670nmDNADNA在酸性溶液中與二苯胺共熱，脫氧核糖參在酸性溶液中與二苯胺共熱，脫氧核糖參與反應生成藍色化合物，最大吸收峰與反應生成藍色化合物，最大吸收峰595nm595nm二二 核酸凝膠電泳核酸凝膠電泳（一）（一） 瓊脂糖電泳瓊脂糖電泳 1.核酸分子的大?。哼w移率與分子量的對數(shù)核酸分子的大?。哼w移率與分子量的對數(shù)成反比。成反比。 2.凝膠濃度：遷移率與凝膠濃度成反比。凝膠濃度：遷移率與凝膠濃度成反比。 3. DNA的構象：超螺旋最快，線形其次，開的構象：超螺旋最快，線形其次，開環(huán)形最慢。環(huán)形最慢。 4. 電流：不大于電流：不大于5V/cm。遷移率與電

46、壓大小。遷移率與電壓大小成正比成正比 5.分析分析RNA時需加時需加蛋白質變性劑蛋白質變性劑如甲醛（避如甲醛（避免免的影響）的影響）DNA用用溴化乙錠溴化乙錠染色，在紫外光下呈染色，在紫外光下呈紅紅-橙橙色可見熒光色可見熒光 （二）（二） PAGE電泳電泳孔徑較瓊脂糖小，用于分析相對分子孔徑較瓊脂糖小，用于分析相對分子1000bp的的DNA和和RNA片段，一般不含片段，一般不含RNase，RNA常用常用亞甲藍或熒染亞甲藍或熒染PAGE強度好，常用垂直板。強度好，常用垂直板。三、三、 DNA堿基序列測定堿基序列測定 DNA堿基序列測定即堿基序列測定即DNA一級結構的測定，一級結構的測定，測定未知

47、序列測定未知序列確定重組確定重組DNA的方向與結構的方向與結構對突變進行定位和鑒定對突變進行定位和鑒定比較研究比較研究70年代末，年代末，Walter Gilbert發(fā)明化學法發(fā)明化學法 Frederick Sanger發(fā)明雙脫氧終止法發(fā)明雙脫氧終止法 手動測序，同位素標記手動測序，同位素標記80年代中期，出現(xiàn)自動測序儀（應用雙年代中期，出現(xiàn)自動測序儀（應用雙脫氧終止法原理）脫氧終止法原理） 熒光代替同位素，計算機圖象識別熒光代替同位素，計算機圖象識別90年代中期，測序儀重大改進年代中期，測序儀重大改進 集束化的毛細管電泳代替凝膠電泳集束化的毛細管電泳代替凝膠電泳2001年完成人類基因組框架圖

48、年完成人類基因組框架圖3.雙脫氧終止法測序原理雙脫氧終止法測序原理利用利用DNA聚合酶的酶促特點聚合酶的酶促特點 以單鏈為模板合成以單鏈為模板合成DNA的互補鏈的互補鏈 利用利用2,3雙脫氧核苷三磷酸作底物，使雙脫氧核苷三磷酸作底物，使之連接在之連接在DNA鏈的鏈的3末段，終止鏈的延末段，終止鏈的延長。長。雙脫氧末端終止法的主要操作步驟雙脫氧末端終止法的主要操作步驟有：有：1獲得待測獲得待測DNA片段的單鏈模板：片段的單鏈模板：一般采用基因工程的方法以獲取一定數(shù)一般采用基因工程的方法以獲取一定數(shù)量的單鏈待測量的單鏈待測DNA模板。可將待測模板。可將待測DNA片段與噬菌體片段與噬菌體M13DNA

49、進行重組，然后將進行重組，然后將其導入大腸桿菌進行增殖，其導入大腸桿菌進行增殖，M13噬菌體噬菌體一一般以單鏈般以單鏈DNA形式透出細胞再感染新的形式透出細胞再感染新的細菌，故此可獲得單鏈細菌，故此可獲得單鏈DNA模板。模板。 2合成寡核苷酸引物：合成寡核苷酸引物：在待測在待測DNA片段的片段的3-端合成一段互補的端合成一段互補的寡核苷酸引物，其順序可為待測寡核苷酸引物，其順序可為待測DNA片片段段3-端的一段已知順序，也可為一段端的一段已知順序，也可為一段M13噬菌體的順序。可利用噬菌體的順序?？衫肈NA合成儀自動合成儀自動合成。合成。3模板模板-引物雜交：引物雜交：將待測單鏈將待測單鏈D

50、NA模板與寡核苷酸引物混模板與寡核苷酸引物混合，并在適當溫度條件下進行保溫處理，合，并在適當溫度條件下進行保溫處理，使引物與使引物與DNA單鏈模板的單鏈模板的3-端進行雜交。端進行雜交。 4互補鏈的延長和終止：互補鏈的延長和終止：將上述雜交混合液分為四份，每份混合液中將上述雜交混合液分為四份，每份混合液中均加入均加入DNA聚合酶聚合酶，四種四種dNTP，一種帶，一種帶放射放射性同位素標記的脫氧核糖核酸性同位素標記的脫氧核糖核酸（如（如-32P-dATP）。此外還需分別加入一種）。此外還需分別加入一種雙脫氧核糖雙脫氧核糖核酸（核酸（ddATP，ddGTP，ddCTP或或ddTTP）。然后在適當溫

51、度條件下延伸互補鏈，就可得然后在適當溫度條件下延伸互補鏈，就可得到四組分別以到四組分別以A、G、C、T、終止的長短不一、終止的長短不一的互補鏈的混合物。因在互補鏈合成時，如的互補鏈的混合物。因在互補鏈合成時，如摻入的是雙脫氧核糖核酸，由于缺乏摻入的是雙脫氧核糖核酸，由于缺乏3-和和2-OH，故可導致互補鏈合成終止。，故可導致互補鏈合成終止。 5電泳分離：電泳分離：將四組含有長短不等的反應混合物在同將四組含有長短不等的反應混合物在同一聚丙烯酰胺凝膠板上進行電泳，即可一聚丙烯酰胺凝膠板上進行電泳，即可將只相差一個核苷酸的寡核苷酸鏈分離將只相差一個核苷酸的寡核苷酸鏈分離開。開。6放射自顯影：放射自顯

52、影：將電泳凝膠與將電泳凝膠與X光膠片壓在一起，于低溫光膠片壓在一起，于低溫下自顯影數(shù)天，即可得到放射自顯圖譜，下自顯影數(shù)天，即可得到放射自顯圖譜，通過該圖譜即可直接讀出核苷酸的排列通過該圖譜即可直接讀出核苷酸的排列順序。順序。 終止法測定終止法測定DNA序列的原理序列的原理近年來，通過采用不同的近年來，通過采用不同的熒光染料熒光染料標記標記四種不同的雙脫氧核糖核苷酸，其反應四種不同的雙脫氧核糖核苷酸，其反應混合物可在同一區(qū)帶上進行電泳分離，混合物可在同一區(qū)帶上進行電泳分離，然后用計算機進行閱讀和分析，可大大然后用計算機進行閱讀和分析，可大大提高測序速度，一個熟練的工作者一天提高測序速度，一個熟

53、練的工作者一天可分析可分析1萬個核苷酸順序。萬個核苷酸順序。 確定四種熒光發(fā)色基團標記確定四種熒光發(fā)色基團標記4種脫氧核糖核酸種脫氧核糖核酸（ddNTP） 即賦予四組即賦予四組DNA以不同的以不同的“顏色顏色”熒光基團選擇標準熒光基團選擇標準標記引物標記引物 特定的熒光標記引物與特定的特定的熒光標記引物與特定的ddNTP保持一致保持一致 管管1 5 + ddATP 管管2 5 + ddCTP 管管3 5 + ddGTP 管管4 5 + ddTTP標記底物標記底物 將熒光素連在將熒光素連在4種種ddNTP ddATP ddCTP ddGTP ddTTP高速自動高速自動DNA測序儀的結構及工作原理

54、測序儀的結構及工作原理待測模板待測模板準備準備DNA模板模板 計算待測模板用量計算待測模板用量 DNA模板的使用量依據(jù)模板的使用量依據(jù)DNA的形式而的形式而定定質粒模板變性質粒模板變性 96，2分鐘，冷卻至室溫后加入其他分鐘，冷卻至室溫后加入其他成分成分(PCR產(chǎn)物不需變性產(chǎn)物不需變性)。四四 PCR技術技術 （一）一）PCR的概念的概念 PCR(polymerase chain reaction)即即聚合酶鏈反應聚合酶鏈反應是體外酶促合成特異是體外酶促合成特異DNA片段的新方法，主要片段的新方法，主要是是利用耐熱利用耐熱DNA聚合酶的反復作用，聚合酶的反復作用，由由高溫變性高溫變性、低溫退火

55、低溫退火和和適溫延伸適溫延伸三個步驟反復的熱循環(huán)構三個步驟反復的熱循環(huán)構成：成： 即在高溫即在高溫（95）下，待擴增的靶下，待擴增的靶DNA雙雙鏈受熱變性成為兩條單鏈鏈受熱變性成為兩條單鏈DNA模板；而后在低溫模板；而后在低溫（3755）情況下，兩條人工合成的寡核苷酸）情況下，兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補的單鏈引物與互補的單鏈DNA模板結合，形成部分雙鏈；模板結合，形成部分雙鏈；在在Taq酶的最適溫度（酶的最適溫度（72）下，以引物）下，以引物3端為端為合成的起點，以單核苷酸為原料，沿模板以合成的起點，以單核苷酸為原料，沿模板以53方向延伸，合成方向延伸，合成DNA新鏈。新鏈。每一雙鏈的每

56、一雙鏈的DNA模板，經(jīng)過一次模板，經(jīng)過一次解鏈、解鏈、退火、延伸退火、延伸三個步驟的熱循環(huán)后就成了三個步驟的熱循環(huán)后就成了兩條雙鏈兩條雙鏈DNA分子。如此反復進行，分子。如此反復進行，在在體外迅速將體外迅速將DNA模板擴增數(shù)百萬倍。模板擴增數(shù)百萬倍。PCR產(chǎn)物得以產(chǎn)物得以2n的批數(shù)形式迅速擴增，的批數(shù)形式迅速擴增，經(jīng)過經(jīng)過2530個循環(huán)后，理論上可使基因個循環(huán)后，理論上可使基因擴增擴增109倍以上，實際上一般可達倍以上，實際上一般可達106107倍。倍。（二）（二）PCR反應系統(tǒng)的組成反應系統(tǒng)的組成 PCR反應系統(tǒng)應包括：反應系統(tǒng)應包括：1耐熱耐熱DNA聚合酶（聚合酶（Taq酶）酶）：這是由耐熱：這是由耐熱細菌體內(nèi)提取的一種細菌體內(nèi)提取的一種DNA聚合酶，可保證聚合酶，可保證在在950C，30分鐘以上不會變性失活。分鐘以上不會變性失活。2模板模板DNA：即待分析的目的即待分析的目的DNA，其長度，其長度不宜大于不宜大于10kb。3兩種引物：兩種引物：為了保證為了保證DNA聚合酶能夠對兩聚合酶能夠對兩條互補鏈均能進行延伸，需要兩種引物，條互補鏈均能進行延伸，需要兩種引物，分別位于兩條互補模板分別位于兩條互補模板DNA鏈的鏈的3-端。端。 4四種脫氧核糖核苷酸四種脫氧核糖核苷酸：用作底物的：用作底物的dNTPS。5緩沖溶液緩沖溶液：保證：保證DNA聚合酶催化時所聚合酶