1、表達(dá)載體的構(gòu)建方法及步驟一、載體的選擇及如何閱讀質(zhì)粒圖譜目前，載體主要有病毒和非病毒兩大類，其中質(zhì)粒DNA是一種新的非病毒轉(zhuǎn)基因載體。一個(gè)合格質(zhì)粒的組成要素：(1)復(fù)制起始位點(diǎn)Ori即控制復(fù)制起始的位點(diǎn)。原核生物DNA分子中只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)。而真核生物DNA分子有多個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)。(2)抗生素抗性基因可以便于加以檢測(cè)，如Amp+,Kan+(3)多克隆位點(diǎn)MCS克隆攜帶外源基因片段(4) P/E啟動(dòng)子/增強(qiáng)子(5) Terms終止信號(hào)(6)加poly(A)信號(hào)可以起到穩(wěn)定mRNA作用選擇載體主要依據(jù)構(gòu)建的目的，同時(shí)要考慮載體中應(yīng)有合適的限制酶切位點(diǎn)。如果構(gòu)建的目的是要表達(dá)一個(gè)特定的基因，則要選

2、擇合適的表達(dá)載體。載體選擇主要考慮下述3點(diǎn)：11構(gòu)建DNA重組體的目的，克隆擴(kuò)增/基因表達(dá)，選擇合適的克隆載體/表達(dá)載體?！?】.載體的類型：(1)克隆載體的克隆能力據(jù)克隆片段大小(大選大，小選小)。如<10kb選質(zhì)粒。(2)表達(dá)載體據(jù)受體細(xì)胞類型原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體。(3)對(duì)原核表達(dá)載體應(yīng)該注意：選擇合適的啟動(dòng)子及相應(yīng)的受體菌，用于表達(dá)真核蛋白質(zhì)時(shí)注意克服4個(gè)困難和閱讀框錯(cuò)位；表達(dá)天然蛋白質(zhì)或融合蛋白作為相應(yīng)載體的參考?！?】載體MCS中的酶切位點(diǎn)數(shù)與組成方向因載體不同而異，適應(yīng)目的基因與載體易于鏈接，不能產(chǎn)生閱讀框架錯(cuò)位。綜上所述，選用質(zhì)粒(最常用)做載

3、體的5點(diǎn)要求：(1)選分子量小的質(zhì)粒，即小載體(11.5kb)-不易損壞，在細(xì)菌里面拷貝數(shù)也多(也有大載體)；(2)一般使用松弛型質(zhì)粒在細(xì)菌里擴(kuò)增不受約束，一般10個(gè)以上的拷貝，而嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒10個(gè)。(3)必需具備一個(gè)以上的酶切位點(diǎn)，有選擇的余地；(4)必需有易檢測(cè)的標(biāo)記，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr(試一試)。(5)滿足自己的實(shí)驗(yàn)需求，是否需要包裝病毒，是否需要加入熒光標(biāo)記，是否需要加入標(biāo)簽蛋白，是否需要真核抗性(如Puro、G418)等等。無(wú)論選用哪種載體，首先都要獲得載體分子，然后采用適當(dāng)?shù)南拗泼笇⑤d體DNA進(jìn)行切割，獲得線性載體分子，以便于與目的基因片段進(jìn)行連接。如何閱讀質(zhì)粒

4、圖譜第一步：首先看Ori的位置，了解質(zhì)粒的類型(原核/真核/穿梭質(zhì)粒)第二步：再看篩選標(biāo)記，如抗性，決定使用什么篩選標(biāo)記。(1) Ampr水解B內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨葦?shù)亩拘浴?2) tetr可以阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。(3) camr生成氯霉素羥乙?；苌?，使之失去毒性。(4) neor(kanr)氨基糖甘磷酸轉(zhuǎn)移酶使G418(長(zhǎng)那霉素衍生物)失活(5) hygr使潮霉素B失活。第三步：看多克隆位點(diǎn)(MCS)o它具有多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn)。便于外源基因的插入。如果在這些酶切位點(diǎn)以外有外源基因的插入，會(huì)導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失活，而便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。第四步：再看外源DNA插

5、入片段大小。質(zhì)粒一般只能容納小于10Kb的外源DNA片段。一般來(lái)說(shuō)，外源DNA片段越長(zhǎng)，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。第五步：是否含有表達(dá)系統(tǒng)元件，即啟動(dòng)子-核糖體結(jié)合位點(diǎn)-克隆位點(diǎn)-轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。這是用來(lái)區(qū)別克隆載體與表達(dá)載體?？寺≥d體中加入一些與表達(dá)調(diào)控有關(guān)的元件即成為表達(dá)載體。選用那種載體，還是要以實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑闇?zhǔn)繩。第六步：?jiǎn)?dòng)子-核糖體結(jié)合位點(diǎn)-克隆位點(diǎn)-轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)(1)啟動(dòng)子促進(jìn)DNA轉(zhuǎn)錄的DNA序列，這個(gè)DNA區(qū)域常在基因或操縱子編碼序列的上游，是DNA分子上可以與RNApol特異性結(jié)合并使之開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的部位，但啟動(dòng)子本身不被轉(zhuǎn)錄。(2)增強(qiáng)子/沉默子-為真核基因組(包括真核病毒

6、基因組)中的一種具有增強(qiáng)鄰近基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程的調(diào)控順序。其作用與增強(qiáng)子所在的位置或方向無(wú)關(guān)。即在所調(diào)控基因上游或下游均可發(fā)揮作用。/沉默子一負(fù)增強(qiáng)子，負(fù)調(diào)控序列。(3)核糖體結(jié)合位點(diǎn)/起始密碼/SD序列(Rbs/AGU/SDs):mRNA有核糖體的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)于原核而言是AUG(起始密碼)和SD序列。(4)轉(zhuǎn)錄終止序列(終止子)/翻譯終止密碼子：結(jié)構(gòu)基因的最后一個(gè)外顯子中有一個(gè)AATAAA的保守序列，此位點(diǎn)down-stream有一段GT或T富豐區(qū)，這2部分共同構(gòu)成poly(A)加尾信號(hào)。結(jié)構(gòu)基因的最后一個(gè)外顯子中有一個(gè)AATAAA的保守序列，此位點(diǎn)down-stream有一段GT或T富豐區(qū)，

7、這2部分共同構(gòu)成poly(A)加尾信號(hào)。質(zhì)粒圖譜上有的箭頭順時(shí)針有的箭頭逆時(shí)針，那其實(shí)是代表兩條DNA鏈，即質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈DNA,它的啟動(dòng)子等在其中一條鏈上，而它的抗性基因在另一條鏈上.根據(jù)表達(dá)宿主不同，構(gòu)建時(shí)所選擇的載體也會(huì)不同。二、目的基因的獲得一般來(lái)說(shuō)，目的基因的獲得有三種途徑：調(diào)取基因：根據(jù)目的基因的序列，設(shè)計(jì)引物從含有目的基因的cDNA中通過(guò)PCR的方法調(diào)取目的基因，鏈接到克隆載體挑取單克隆進(jìn)行測(cè)序，以獲得想要的基因片段，這種方法相對(duì)成本較低，但是調(diào)取到的基因往往含有突變，還有不同基因的表達(dá)豐度不同，轉(zhuǎn)錄本比較復(fù)雜，或是基因片段很長(zhǎng)，這些情況都很難調(diào)取到目的基因。全基因合成：根據(jù)目的

8、基因的DNA序列，直接設(shè)計(jì)合成目的基因。此方法準(zhǔn)確性高，相對(duì)成本會(huì)高一些，個(gè)人操作比較困難，需要專業(yè)的合成公司完成。優(yōu)點(diǎn)是可以合成難調(diào)取及人工改造的任何基因序列，同時(shí)可以進(jìn)行密碼子優(yōu)化，提高目的基因在宿主內(nèi)的表達(dá)量。三、克隆構(gòu)建目前，克隆構(gòu)建的方法多種多樣，除了應(yīng)用廣泛的酶切鏈接以外，現(xiàn)在還有很多不依賴酶切位點(diǎn)的克隆構(gòu)建方式。下面具體說(shuō)一下雙酶切方法構(gòu)建載體的步驟。實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)試劑試劑名稱生產(chǎn)廠家載體pCDNA3.1Transheep大腸桿菌菌株DH5aTiangen限制性內(nèi)切酶FermentasT4連接酶Fermentas質(zhì)粒DNA小，大量抽提試劑盒Axygen凝膠回收試劑盒Axygen瓊脂

9、糖BiowestDNAladderFermentas(2)X基因慢病毒載體的構(gòu)建PUC57中。X基因基因由Transheep全基因合成，構(gòu)建于載體PUC57-X基因EcoRI/BamHI酶切結(jié)果：酶切完成后進(jìn)行膠回收2.載體用pCDNA3.1雙酶切，酶切體系如下。20ul酶切體系37度3小時(shí)4ulpCDNA3.1載體(500ng/ul)1ulBamHI1ulEcoRI2ul10xbuffer12ulH2O酶切完成后膠回收(見(jiàn)附錄)處理好的目的片段與載體連接反應(yīng)體系：6ulPCR酶切回收片段(約50ng/ul)1ul酶切好的載體（約50ng/ul）2ulligasebuffer1ulT4ligase10ulH2O以上連接液在16c過(guò)夜。轉(zhuǎn)化（感受態(tài)