1、從一例甲真菌病患者病甲中分離出糠秕孢子菌臨床和實(shí)驗(yàn)研究從一例甲真菌病患者病甲中分離出糠秕孢子菌臨床和實(shí)驗(yàn)研究中華皮膚科雜志 1998年第5期第31卷 論 著作者：冉玉平周光平李薇彭雪梅杜曉平劉德操單位：610041成都，華西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚性病科(冉玉平周光平李薇杜曉平劉德操)；法醫(yī)系電鏡室(彭雪梅)關(guān)鍵詞：甲真菌??；卵形糠秕孢子菌；紅色毛癬菌；顯微鏡，電子【摘要】從一例甲真菌病患者的病甲標(biāo)本中分離出糠秕孢子菌，并進(jìn)行了培養(yǎng)、組織病理、掃描電鏡、溶甲等研究?；颊邽?4歲女性，因指趾甲變色、增厚、粗糙20余年就診。體檢見各指、趾甲增厚變色，表面粗糙不平，指甲前端甲板與甲床分離。指甲培養(yǎng)結(jié)

2、果發(fā)現(xiàn)在沙堡培養(yǎng)基有紅色毛癬菌生長(zhǎng)，在含菜子油培養(yǎng)基有卵形糠秕孢子菌生長(zhǎng)。病理檢查發(fā)現(xiàn)甲組織裂隙中有卵形出芽孢子，掃描電鏡觀察見大量有頸圈樣結(jié)構(gòu)的卵形出芽孢子鑲嵌于甲組織中。20%KOH、56處理1小時(shí)的甲沉淀物涂片經(jīng)Parker墨水染色后鏡下可見與卵形糠秕孢子菌和紅色毛癬菌形態(tài)一致的孢子和菌絲?；颊呓邮芤燎颠蜷g歇沖擊治療，第四療程結(jié)束后12月時(shí)甲顏色明顯光亮，以后未見進(jìn)一步好轉(zhuǎn)。治療結(jié)束后6個(gè)月時(shí)再剪病甲培養(yǎng)又有紅色毛癬菌和卵形糠秕孢子菌生長(zhǎng)。結(jié)論此為國(guó)內(nèi)首次報(bào)道卵形糠秕孢子菌與甲真菌病有關(guān)。復(fù)習(xí)文獻(xiàn)，對(duì)紅色毛癬菌和卵形糠秕孢子菌在發(fā)病中的地位進(jìn)行了討論。Isolation of Pity

3、rosporum ovale from a Patient with Ony chomycosis: Clinical and Laboratory InvestigationRan Yuping*, Zhou Guangping, Li Wei, et al. *De partment of Dermatovenereology, First University Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041【Abstract】ObjectiveTo isolate and observe Pityro

4、sporum yeasts from a patient with onychomy cosis. MethodsThe involved nail specimens were investigated by means of culture, patholog ical and scanning electron microscopic examination and 20% KOH preparation. ResultsPhysical examin ation showed that each finger and toe nail appeared brownish-black,

5、rough and t hick, s ome of the fore part of the nail plate detached from the nail bed. Fingernail sp ecimen's culture results showed that Trichophyton rubrum grew on Sabouraud's dex trose agar and Pityrosporum ovale grew on the medium containing rapeseed oil. Th e pathological examination re

6、vealed P.ovale yeast involvement in the fissure o f the nail plate. Under the scanning electron microscopy, a lot of P.ova le yeast s with characteristic collarette structure inserted in the nail tissue was notic ed. In the 20% KOH preparations of nail incubated at 56for 1h and stained wi th Quink P

7、arker ink, spores and hyphae were identified morphologically with P.ov ale and T.rubrum respectively. The patient received inte rmittent pulse therapy with itraconazole, the color of the nails became much brighter 1 to 2 months a f ter the fourth cycle of therapy, but no further improvement was obse

8、rved aft erward s. P.ovale and T.rubrum grew again 6 months afte r treatment when the clippings of the fi ngernail were cultured. Conclusion This is the first document of onychomycosis related with P.ovale in China.【Key words】OnychomycosisPityrosporum ovaleTr ichoph yton rubrumMicroscope, electron糠秕

9、孢子菌除是花斑癬、糠秕孢子菌毛囊炎的致病菌外，也與間擦疹、脂溢性皮炎、頭屑過多、銀屑病、異位性皮炎有關(guān)1；從80年代中期開始陸續(xù)有由該菌引起系統(tǒng)感染的報(bào)道2。國(guó)外已有4篇文獻(xiàn)報(bào)道從甲標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)糠秕孢子菌36。我們報(bào)道1例從甲真菌病患者病甲中培養(yǎng)出紅色毛癬菌和卵形糠秕孢子菌，用掃描電鏡重點(diǎn)觀察了卵形糠秕孢子菌在病甲的分布和形態(tài)特征。病歷資料患者女，64歲，教師。因指趾甲變色增厚于1996年4月10日就診。20余年前雙手掌起深在性水皰、瘙癢，持續(xù)半月后各指間起水皰、瘙癢，以后右手無名指甲緩慢變色，前端變空，其余指甲及雙足各趾甲也逐漸變色、增厚。15年前曾用“甲癬藥水”數(shù)十天后有部分新甲長(zhǎng)出，但停藥

10、后又復(fù)發(fā)。10年前偶然發(fā)現(xiàn)頭枕部有一雞蛋大面積頭發(fā)脫落，未接受治療；近2年因骨質(zhì)疏松常規(guī)服小劑量女性激素。無糖尿病、花斑癬、頭皮屑多等病史，從未外用過指(趾)甲油，無搔抓頭皮習(xí)慣。體檢見各指、趾甲不同程度增厚，表面粗糙不平，有頂針樣改變，雙側(cè)食指、中指、無名指前端1/3至1/2甲板與甲床分離，污褐色至綠黑色（圖1），未見手、足癬表現(xiàn)，枕部有約5cm×6cm卵圓形脫發(fā)區(qū)，其中有稀疏頭發(fā)長(zhǎng)出。圖1患者手部皮損實(shí)驗(yàn)室研究及結(jié)果（一）培養(yǎng)：刮去病甲表層后取甲屑及剪遠(yuǎn)端病甲，接種于含氯霉素、放線菌酮的沙堡培養(yǎng)基(室溫)和含菜子油沙堡培養(yǎng)基7(37)培養(yǎng)。在沙堡培養(yǎng)基中長(zhǎng)出白色絨毛狀菌落，隨時(shí)間

11、經(jīng)過白色羊毛狀菌絲充滿斜面，菌絲緊貼管壁，邊緣清楚，培養(yǎng)基變?yōu)榧t葡萄酒色。用玻片法做小培養(yǎng)見絲狀菌絲及棒狀側(cè)生小分生孢子，鑒定為紅色毛癬菌（圖2）。在含菜子油沙堡培養(yǎng)基長(zhǎng)出乳酪色酵母樣菌落，在培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)，鏡下觀察為卵形出芽孢子，芽頸較寬，厚壁，鑒定為卵形糠秕孢子菌（圖2）。圖2小培養(yǎng)鑒定為紅色毛癬菌，含菜子油沙堡培養(yǎng)基鑒定為卵形糠秕孢子菌(右上角)（二）組織病理學(xué)觀察：剪取指甲遠(yuǎn)端病甲，經(jīng)10%甲醛固定后置脫鈣液(濃鹽酸20ml，氯化鈉7.5g，蒸餾水1000ml)中脫鈣5天，流水沖洗68小時(shí)后，常規(guī)脫水，石蠟包埋切片(3m)，HE、PAS、氯胺銀染色。發(fā)現(xiàn)甲組織表面有裂隙，其間有大量卵形

12、出芽孢子，PAS染成棕紅色，氯胺銀染成黑色，未見到菌絲。（三）掃描電鏡觀察：將病甲用2.5%戊二醛固定24小時(shí)后用磷酸鹽緩沖液沖洗，用30%100%酒精逐級(jí)脫水(每級(jí)1530分鐘)，醋酸異戊酯置換(1530分鐘)，CO2臨界點(diǎn)干燥、離子濺射，AMRAY1000-B型掃描電鏡下觀察并照像。見甲表面及斷面凹凸不平，甲結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，有很多裂隙及大量不規(guī)則甲組織碎屑，甲組織內(nèi)充滿大量卵形出芽孢子，有典型的頸圈樣結(jié)構(gòu)8，部分或大部分鑲嵌入甲組織內(nèi)（圖36），未見菌絲及不出芽的分生孢子，部分視野見到細(xì)菌。圖36掃描電鏡下觀察病甲組織（四）KOH溶甲觀察：將病甲置于20%KOH中，56水浴1小時(shí)后離心棄上清

13、液，用生理鹽水洗滌2次后將沉淀物涂片，經(jīng)50%Parker墨水染色5分鐘，用蒸溜水洗去多余染料后封片鏡下觀察?？梢姶罅柯研纬鲅挎咦雍洼^多細(xì)長(zhǎng)分隔菌絲，此菌絲與培養(yǎng)生長(zhǎng)的紅色毛癬菌鏡下所見形態(tài)一致。治療及預(yù)后采用伊曲康唑間歇沖擊療法（共4個(gè)療程）：第一療程每日口服200mg共7天，從第二療程開始改為200mg每日2次共7天，每療程間隔3周。服藥3個(gè)療程后從甲根部開始有淡紅色新甲長(zhǎng)出，并逐漸向前推移，到第四療程結(jié)束后12個(gè)月時(shí)各甲與甲床未分離的甲板色澤淡紅，與甲床分離的甲板顏色較治療前明顯變淡，以后病甲未見進(jìn)一步好轉(zhuǎn)，到治療結(jié)束后6個(gè)月時(shí)各甲后部分表面仍不平整，各甲板與甲床分離部分顏色雖較接受治療

14、前變淺，但未完全恢復(fù)正常。服藥第三療程起每月剪遠(yuǎn)端病甲做KOH溶甲后涂片未見卵形出芽孢子，但仍可見細(xì)長(zhǎng)分隔菌絲，將病甲分別接種到前述兩種培養(yǎng)基作培養(yǎng)均陰性（共3次）。細(xì)菌培養(yǎng)有革蘭陽(yáng)性桿菌生長(zhǎng)，未做菌種鑒定。伊曲康唑間歇沖擊療法結(jié)束后6個(gè)月時(shí)再剪遠(yuǎn)端病甲分別接種到前述兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)，又有紅色毛癬菌和卵形糠秕孢子菌生長(zhǎng)。討論本例采用普通和含油的沙堡培養(yǎng)基，從同一患者病變指甲同時(shí)培養(yǎng)出紅色毛癬菌和卵形糠秕孢子菌，病理切片和掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)卵形出芽孢子但未見到菌絲，這可能與切片只能看到斷面，掃描只能觀察斷面表面有關(guān)，為彌補(bǔ)方法學(xué)上的不足，將部分病甲置于20%KOH中，經(jīng)56水浴將病甲全部溶解，離心洗

15、滌后的沉淀物涂片，Parker墨水染色后鏡下發(fā)現(xiàn)大量卵形出芽孢子和較多細(xì)長(zhǎng)分隔菌絲，證實(shí)病變甲組織中確實(shí)存在紅色毛癬菌和卵形糠秕孢子菌這兩種形態(tài)的真菌。紅色毛癬菌是甲真菌病最常見的病原菌，該菌分泌的蛋白酶可分解角蛋白，在菌體侵入甲組織過程中起重要作用9?？凤蹑咦泳募?xì)胞壁/膜有脂酶活性10，可將脂質(zhì)分解為脂肪酸以利菌生長(zhǎng)繁殖?？凤蹑咦泳置诘鞍酌傅募僭O(shè)至今尚未被證實(shí)。Dion等3首先注意到甲組織中存在糠秕孢子菌，但并不認(rèn)為是甲病變的病原菌；Civila等4認(rèn)為它是引起甲床炎的病因；將糠秕孢子菌與甲真菌病聯(lián)系在一起的是Crozier等5，他們報(bào)道了10例，受累部位有手指甲6例、腳趾甲4例。表現(xiàn)為

16、甲下角化過度、甲分離，甲遠(yuǎn)端及側(cè)緣白黃色或棕褐色。鏡檢見大量圓形或卵形酵母細(xì)胞但未發(fā)現(xiàn)菌絲。7例分離出卵形、3例分離出圓形糠秕孢子菌，1例合并白念珠菌。局部抗真菌治療均有效。認(rèn)為在某些促發(fā)因素作用下糠秕孢子菌定植在甲表面，進(jìn)而侵犯甲組織，最終發(fā)展為甲真菌病。Silva等6對(duì)370例病甲標(biāo)本的鏡檢和培養(yǎng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)14例（3.78%）有糠秕孢子菌，其中2例合并白念珠菌、1例合并紅色毛癬菌。促發(fā)因素包括患銀屑病、糖尿病、脂溢性皮炎、接觸性皮炎、甲外傷及長(zhǎng)期接觸植物油等。內(nèi)服或外用咪唑類藥物治療有效。本文報(bào)道了在病甲組織中有卵形糠秕孢子菌存在，該發(fā)現(xiàn)有助于擴(kuò)大對(duì)糠秕孢子菌致病譜的認(rèn)識(shí)和加深對(duì)甲真菌病多病

17、原性的理解。本例病甲中紅色毛癬菌和卵形糠秕孢子菌何種為原發(fā)感染，何種為繼發(fā)，或兩菌協(xié)同致病，尚不能定論。掃描電鏡所見卵形出芽孢子以鑲嵌方式存在于病甲組織內(nèi)，表明該菌已侵入到甲組織內(nèi)并生長(zhǎng)繁殖，而不是簡(jiǎn)單地附著在病甲表面。分析本例治療反應(yīng)過程，伊曲康唑間歇沖擊療法未能徹底治愈可能與以下因素有關(guān)：患者為老年，甲生長(zhǎng)代謝緩慢；因部分甲板與甲床分離，藥物不能通過甲床彌散到甲板以達(dá)到足夠的濃度；同時(shí)合并細(xì)菌感染（文獻(xiàn)報(bào)道綠膿桿菌可使甲板變?yōu)槟G色）；同時(shí)服小劑量女性激素。對(duì)此特殊病例尚需探索更加有效的治療方案。中華醫(yī)學(xué)會(huì)皮膚科學(xué)會(huì)科研基金資助課題參考文獻(xiàn)1冉玉平,羅漢超.花斑癬發(fā)病機(jī)理的研究進(jìn)展.臨床皮

18、膚科雜志,1987,1626-28.2 Redline RW, Redline SS, Boxerbaum B, et al. Systemic Ma lasezzia furfur infections in patients receiving intralipid therapy. Hum Pathol, 1985,16815-8 22.3 Dion WM, Kapica L. Isolation of dermatophytic,candida species a nd systemic fungi from dermatophytic specimens in Montreal, 1963 to 1073. Can Med Assoc J, 1975,1 12712-716.4 Civila ES, Conti-Diaz IA, Vignale RA, et al. Onychia