1、SUR1過表達實驗設(shè)計方案一實驗?zāi)康模菏筍UR1基因在植物體內(nèi)超表達二實驗方法：三實驗步驟 RT-PCR將RNA反轉(zhuǎn)錄成CDNARNA提取（-70保存）1. 組織剪碎加入1ml Trizol，冰上勻漿（邊勻漿邊暫停）2. 轉(zhuǎn)入一新EP管中（1.5ml），室溫保存5min3. 加氯仿0.2ml，振蕩混合（手搖劇烈），室溫放置5min4. 10000 rpm 4離心15min5. 轉(zhuǎn)移上層水相（吸70%）到一新EP管中，加異丙醇0.5ml,振蕩混合，室溫保存10min6. 12000rpm 4 離心15min7. 倒掉上清，加1ml 75%無水乙醇（4保存），振蕩混合，10000rpm 4 離心5

2、min8. 倒掉上清，室溫或37放置20min(EP管倒置在濾紙上)使RNA沉淀干燥9. 加20ul DEPC水至EP管中10. 在60孵育3-5min(或手握3-5min),使RNA充分溶解逆轉(zhuǎn)錄以Fernentas試劑盒為例，反應(yīng)體系20ul1. RNA短暫離心2. 將11ul的DEPC水和RNA（1ug）放入EP管內(nèi)，置于冰上，使RNA終濃度為0.5ug/ul,再加入Oligo(dt) 1ul,輕輕混合均勻，短時間離心(RNA=1/總RNA濃度=1/ OD260×6 ；DEPC水=11-RNA)3. 將反應(yīng)液置于65 5min 冰上1min,短時間離心4. 按順序加入：5

3、15;buffer 4ul200ul核糖核苷酸酶抑制劑 1ul 10mm dNTP MIX 2ul M-Mulu逆轉(zhuǎn)錄酶 1ul 輕輕混合均勻，短時間離心5. 將混合物置于42，60min6. 70加熱5min,中止上述反應(yīng)，置于冰上 據(jù)序列設(shè)計引物對CDNA進行PCR擴增在TAIR上查出SUR1的序列1 ATGAGCGAAG AACAACCACA CGCCAATCTA GCGGTTCCCG CGTTTAAAAC 51 TGAGAAAGAG CCCATAACGC AAACACGAAA TGGTCAAAGT AGCGTTTGGC 101 GTTTCGGTGG AAGTGATAAG GCAGCGA

4、AAG CATCCACCGT AACGCTTAGA 151 GGTGTCATCT ACATGCTCTT CGACAACTGC GGCAAAGACG TCAATAAGAC 201 CATTTTACCC CTCGGCCACG GTGACCCTTC CGTCTACCCT TGCTTCCGTA 251 CCTGTATCGA AGCTGAAGAC GCCGTCGTCG ACGTCCTTCG CTCCGGCAAA 301 GGCAATTCTT ACGGTCCCGG AGCTGGGATT CTCCCCGCAA GACGAGCCGT 351 TGCTGATTAT ATGAACCGAG ATCTTCCGCA C

5、AAGTTAACG CCTGAAGATA 401 TTTTTCTGAC CGCTGGATGC AACCAAGGGA TAGAGATCGT GTTCGAATCG 451 TTGGCTCGAC CAAACGCAAA CATCTTGCTC CCACGTCCTG GCTTCCCTCA 501 CTACGACGCT CGTGCTGCTT ACAGTGGTCT CGAGGTTCGC AAGTTTGATC 551 TTCTTCCCGA GAAAGAATGG GAGATTGATC TTGAAGGTAT CGAAGCCATT 601 GCAGACGAGA ACACTGTGGC TATGGTTGTA ATTAAC

6、CCCA ACAATCCCTG 651 TGGAAATGTC TACTCTCACG ACCATCTCAA AAAGGTTGCA GAGACGGCTA 701 GGAAGCTCGG GATAATGGTG ATCTCAGACG AAGTATATGA CCGAACTATA 751 TTCGGAGACA ATCCATTTGT TTCAATGGGG AAGTTTGCTT CGATAGTCCC 801 TGTATTGACA CTAGCAGGCA TATCTAAGGG ATGGGTTGTT CCTGGATGGA 851 AAATTGGCTG GATCGCCTTG AATGATCCCG AGGGCGTTTT

7、CGAGACCACC 901 AAGGTGTTAC AATCCATCAA ACAGAATCTT GACGTAACTC CTGACCCTGC 951 CACAATAATT CAGGCTGCAC TTCCAGCGAT CCTGGAGAAA GCGGACAAAA1001 ACTTCTTTGC AAAGAAGAAC AAGATACTCA AACATAATGT TGATTTGGTG1051 TGTGATAGGC TCAAGGACAT CCCCTGTGTC GTCTGTCCCA AGAAACCTGA1101 GTCTTGCACT TACTTATTGA CAAAGTTGGA GCTGTCATTG ATGGA

8、TAATA1151 TCAAGGACGA TATAGATTTT TGCGTAAAAC TGGCCAGAGA GGAGAATCTC1201 GTGTTTCTAC CAGGGGATGC TCTGGGTTTG AAGAACTGGA TGAGGATAAC1251 CATCGGAGTC GAAGCTCATA TGCTTGAGGA TGCACTTGAG AGACTGAAGG1301 GTTTCTGTAC ACGTCATGCC AAGAAGACAG AGACAGAAAC TGAGTCACTT1351 CAAGCTTTGA AACTGAGTGA TAATAATCTC GAAATGTAA根據(jù)引物設(shè)計原則，利用軟

9、件Primer premier 5.0設(shè)計上下游引物進行PCR擴增得到目的基因SUR1 載體的構(gòu)建圖1：過表達載體User載體的連接User酶：1ul載體：1ulPCR產(chǎn)物：10ul將混勻的產(chǎn)物于37放置25min,再25放置25min，完成后加入感受態(tài)大腸桿菌中。大腸桿菌感受態(tài)轉(zhuǎn)化LB培養(yǎng)基（1L）：蛋白胨10g 酵母提取物（Yest）5g NaCl5g固體LB：0.75g瓊脂/50ml高壓滅菌14min感受態(tài)轉(zhuǎn)化：1. -70取感受態(tài)，冰上融化在超凈臺中加入載體2. 冰上靜止30min，42水浴熱激90s，冰置90s,42水浴30s3. 在超凈臺中加入800ul液體LB，37，100r/m

10、1h，活化菌4. 準備涂菌用的平板，融化固體LB，不燙手時加入選擇抗生素，迅速搖勻并倒平板，冷卻至凝固5. 將活化后的菌4000r/m離心沉淀，其大部分上清，剩約100ul重懸，用移液槍吹起菌體，轉(zhuǎn)移到平板上6. 燒涂布棒，前端放在平板蓋內(nèi)側(cè)冷卻后，將菌液均勻涂布在平板上，封上封口膜7. 培養(yǎng)箱37倒置培養(yǎng)1216h8. 菌落PCR鑒定（50mlLB中加入50ul卡那霉素） 測序測序與已知序列一致進行下一步 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌重組表達載體導(dǎo)人農(nóng)桿菌。用電轉(zhuǎn)化法將重組表達載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中，電轉(zhuǎn)化參數(shù)為：電壓2 500 kVem；電容25 F；電阻500 Q。電擊35 ms后，取出電擊杯，迅速加

11、入800 L的LB液體培養(yǎng)基，混勻并轉(zhuǎn)移至15 mL的EP管中，在28震蕩培養(yǎng)3 h；取100,L菌液涂布于含Gen(50,gmL)和Kan(50,gmL)的LB平板中28培養(yǎng)24 h，即可長出陽性克隆。陽性克隆的菌落PCR與酶切鑒定。隨機挑取單菌落，在裝有1 mL的LB和15 mL的抗生素的離心管中28培養(yǎng)12 h左右。取5O L培養(yǎng)物，煮沸5 rain，5 000 rrain離心2 min，取12,L上清進行PCR擴增后電泳檢測。選取菌落PCR驗證后的菌液抽提質(zhì)粒，并用BstE 1I和Bgl 1I雙酶切后，電泳檢測。農(nóng)桿菌浸染法侵染擬南芥前期準備：取150ml 含相應(yīng)抗生素的液體LB培養(yǎng)基

12、，接入2-3ml準備好的農(nóng)桿菌菌液，大搖過夜至培養(yǎng)基由紅色轉(zhuǎn)為黃色。將培養(yǎng)后的150ul農(nóng)桿菌菌液導(dǎo)入滅過菌的50ml離心管中，4，3000rmp離心15min棄上清，加入50ml 12 MS，將菌泥攪起。用于侵染的12 MS配方：（每150 ml菌液加50 ml 12 MS液）MS大量 5 ml蔗糖 10 g水 95 ml表面活性劑 20 ul常用12 MS配方（1L）：10X大量元素 50 ml100X微量元素 5 ml100X鐵鹽 5 ml蔗糖（1%） 10 g瓊脂粉 8 g擬南芥生長土壤：腐殖土：蛭石=1:1混勻，裝雙層袋子，高壓121滅菌40分鐘注意：滅完菌后要加適量水將土和濕，不能

13、太濕，然后土裝入缽里壓實，將缽放入裝有水的底盤中，一個小時左右缽中土壤浸濕后便能種苗。種子消毒：30%H2O2+85%乙醇 1:4混合取250微升混合液加入種子種用槍頭吹打40S，放在濾紙上晾干，然后鋪在12 MS平板上。4冰箱中放置春花1-5天，一般新種子春花時間長點。168 光周期，待真葉長出時，用鑷子將苗從平板移植到土壤中。后續(xù)操作 1 種植健康的擬南芥直到開花。在種子種下后澆水蓋膜，蓋膜的目的是為了保持水分。移栽擬南芥后還需要蓋3到4天的膜。 2 初次開花時將花蕾剪掉以促進更多花枝的增生，修剪后越4至5天可使用，這樣優(yōu)化后的植物含有很多未成熟的花序并沒有很多受精的角果，以保證大多數(shù)植物

14、被成功的轉(zhuǎn)化。 3準備攜帶目的基因在雙元載體（雙元載體有兩套篩選引子，菌體中用一種，植物中用一種）里的農(nóng)桿菌菌株。養(yǎng)殖在一個大的液體LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基帶有抗生素，以為篩選二元質(zhì)粒。 4 搖床搖農(nóng)桿菌，用5%的蔗糖溶液（蔗糖溶液中加入表明活性劑，達到濃度0.05%）混懸到OD600 = 0.8（左右）把100ml的5的蔗糖懸浮的菌液倒入大皿內(nèi)，然后把擬南芥的花序浸入進去侵染2分鐘，侵染的過程要轉(zhuǎn)動缽子，（侵染之前一晚上最好給缽子里澆些水，以免第二天侵染后缽子里的土容易掉出來），侵染后用濾紙擦干。5 侵染后的擬南芥用黑色塑料袋或者薄膜覆蓋，暗培養(yǎng)24小時后繼續(xù)光照。侵染后悉心照料，保持水分充足。

15、一周后可再侵染一次，這是由于擬南芥的盛花期較長，一般要侵染23次。6 澆水松土正常養(yǎng)殖，種子成熟后停止?jié)菜? 角果自然開裂后收獲干燥的種子，獨立分裝備用。篩選Basta篩選轉(zhuǎn)基因擬南芥收獲后的干燥種子經(jīng)表面消毒，放于4冰箱，春化4天后，播種于培養(yǎng)土中，待長出2片真葉后，噴灑1：1 000的Basta除草劑進行篩選。設(shè)計特性引物，采用RT_PcR方法對具有Basta抗性的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株進行鑒定。 分子檢測收獲種子進行自交，在T2或T3代進行分子檢測采用半定量PCR的方法6.1總RNA的提?。和谝徊?.2基因組DNA的去除RNA樣品中痕量的基因組DNA的去除方法參照DNase I(RNase

16、 Free)試劑說明書進行。對除去基因組DNA的總RNA樣品稀釋后測定DD260nm和0D280nm，計算RNA的濃度。對初提及去除基因組DNA的總RNA樣品各取5l，2瓊脂糖凝膠，110v電壓，l0min電泳后拍照。6.3 第一條鏈cDNA合成冰上按以下次序配置體系Total RNA        0.1ng-5gPrimer(random hexamer primer)        1LWater,nuclease-free        合計  &

17、#160;     12L將體系輕柔混合短暫離心后，在PCR儀進行以下程序：65，5min后4，5min；順次加5×Reaction buffer        4LRnase inhibitor(20u/L)        1L10Mm dNTP Mix        2LReverse Transcriptase(200 u/L)        1L將體系輕柔混合短暫離心,在PCR儀進行以下程序：25，5min；42，60min；70，5min。6.4.內(nèi)參基因和目的基因引物設(shè)計內(nèi)參基因需是看家基因，目的基因要求PCR產(chǎn)物在350-800bp之間，且退火溫度和內(nèi)參基因引物的退火溫度保持一致。