1、ELISA 原理與分類1. ELISA 的原理 ELISA 的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性， 又保留酶的活性。在測定時，受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很

2、高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達(dá)到很高的敏感度。2. ELISA 的類型 ELISA 可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑：（1） 固相的抗菌素原或抗體，即"免疫吸附劑"（immunosorbent）；（2） 酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為"結(jié)合物"（conjugate）；（3） 酶反應(yīng)的底物。根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的情況以及檢測的具體條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測方法。用于臨床檢驗(yàn)的 ELISA 主要有以下幾種類型：2.2.1體夾心法測抗原體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：1） 將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)

3、，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。2） 加受檢標(biāo)本，保溫反應(yīng)。標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。3） 加酶標(biāo)抗體，保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān)。4） 加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過比色，測知標(biāo)本中抗原的量。在臨床檢驗(yàn)中，此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大抗原，例如 HBsAg、HBeAg、AFP、hCG 等。只要獲得受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和酶結(jié)合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標(biāo)用的抗體最好分別取自不同種屬的

4、動物。如應(yīng)用單克隆抗體，一般選擇兩個抗原上不同決定簇的單抗，分別用于包被固相載體和酶結(jié)合物。這種雙位點(diǎn)夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體一起保溫反應(yīng)，作一步檢測。 在一步法測定中，當(dāng)標(biāo)本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成"夾心復(fù)合物"。類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后帶現(xiàn)象，此時反應(yīng)后顯色的吸光值（位于抗原過剩帶上）與標(biāo)準(zhǔn)曲線（位于抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同（參見 1.3.2，圖 1-4），如按測讀，所得結(jié)果將低于實(shí)際的含量，這種現(xiàn)象被稱為鉤狀效應(yīng)（hook effect），因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)曲線到達(dá)后呈鉤狀彎落。鉤狀效

5、應(yīng)嚴(yán)重時，反應(yīng)甚至可不顯色而出現(xiàn)假結(jié)果。因此在使用一步法試劑測定標(biāo)本中含量可異常增高的物質(zhì)（例如血清中 HBsAg、AFP 和尿液 hCG 等）時，應(yīng)注意可測范圍的最高值。用和力的單克隆抗體此類試劑可削弱鉤狀效應(yīng)。 假使在被測的不同位點(diǎn)上含有多個相同的決定簇，例如 HBsAg 的 a 決定簇，也可用此決定的同一單抗分別包被固相和酶結(jié)合物。但在 HBsAg 的檢測中應(yīng)注意亞型問題，HBsAg 有 adr、adw、ayr、ayw4 個亞型，雖然每種亞型均有相同的 a 決定簇的反應(yīng)性，這也是用單抗作夾心法應(yīng)注意的問題。體夾心法測抗原的另一是類風(fēng)濕因子（RF）的干擾。RF 是一種自身抗體，多為 IgM

6、型，能和多種動物 IgG 的 Fc 段結(jié)合。用作體夾心法檢測的血清標(biāo)本中如含有 RF，它可充當(dāng)抗原成份，同時與固相抗體和酶標(biāo)抗體結(jié)合，表現(xiàn)出假陽性反應(yīng)。采用 F（ab'）或 Fab片段作酶結(jié)合物的試劑，由于去除了 Fc 段，從而消除 RF 的干擾。體夾心法 ELISA 試劑是否受 RF 的影響，已被列為這類試劑的一項(xiàng)指標(biāo)（參見 6.2）。體夾心法適用于測定二價或二價以上的大抗原，但不適用于測定半抗原及小成兩位點(diǎn)夾心。單價抗其不能形2.2.2原夾心法測抗體 反應(yīng)模式與體夾心法類似。用特異性抗原進(jìn)行包被和酶結(jié)合物，以檢測相應(yīng)的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體。此法中

7、受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。標(biāo)志物中抗 HBs 的檢測常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的適的標(biāo)記方法。，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合2.2.3 間接法測抗體間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法（見圖 2-3）。操作步驟如下：1） 將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。2） 加稀釋的受檢血清，保溫反應(yīng)。血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去。3）加酶標(biāo)抗抗體。

8、可用酶標(biāo)抗人 Ig 以檢測總抗體，但一般多用酶標(biāo)抗人 IgG 檢測 IgG 抗體。固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗體抗體結(jié)合，從而間接地標(biāo)記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢抗體的量正相關(guān)。4）加底物顯色 本法主要用于對病原體抗體的檢測而進(jìn)行傳染病的。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測相應(yīng)抗體的方法。 間接法的關(guān)鍵在于抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實(shí)際有效的結(jié)果，但應(yīng)盡可能予以純化，以提高試驗(yàn)的特異性。特別應(yīng)注意除去能與一般健康人血清發(fā)生反應(yīng)的雜質(zhì)，例如以 E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有 E.Coli 成份，很可能與受過 E.Coli者血

9、甭中的抗E.Coli 抗體發(fā)生反應(yīng)。抗原中也不能含有與酶標(biāo)抗人 Ig 反應(yīng)的物質(zhì)，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的 Ig 去除，試驗(yàn)中也發(fā)生假陽性反應(yīng)。另外如抗原中含有無關(guān)蛋白，也會因竟?fàn)幬蕉绊懓恍Ч?間接法中另一種干擾因正常血清中所含的高濃度的非特異人血清中受檢的特異性 IgG 只占總 IgG 中的一小部分。IgG 的吸附性很強(qiáng)，非特異 IgG 可直接吸附到固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被后一般用無關(guān)蛋白質(zhì)（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空余間隙。另外，在檢測過程中標(biāo)本稀釋（1:401:200），以避免過高

10、的本底影響結(jié)果的。2.2.4 競爭法測抗體 當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競爭與固相抗原結(jié)合。標(biāo)本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體，因此陽性反應(yīng)呈色淺于反應(yīng)。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質(zhì)，直接包被不易，可采用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應(yīng)的抗體，然后加入抗成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質(zhì)，然后再加標(biāo)本和酶標(biāo)抗體進(jìn)行競爭結(jié)合反應(yīng)。競爭法測抗體有多種模式，可將標(biāo)本和酶標(biāo)抗體與固相抗原競爭結(jié)合，抗 HBcELISA 一般采用此法。另一種模式為將標(biāo)本與抗原一起加入到固相抗體中進(jìn)

11、行競爭結(jié)合，洗滌后再加入酶標(biāo)抗體，與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)。抗 HBe 的檢測一般采用此法。2.2.5 競爭法測抗原 小抗原或半抗缺乏可作夾心法的兩個以上的位點(diǎn)，因此不能抗體夾心法進(jìn)定，可以采用競爭法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原，最后的顯色也愈淺。小激素、等 ELISA 測定多用此法。2.2.6 捕獲包被法測抗體 IgM 抗體的檢測用于傳染病的早期中。間接法 ELISA 一般僅適用于檢測總抗體或 IgG 抗體。如用抗原包被的間接法直接測定 IgM 抗體，因標(biāo)本中一般同時較高濃度的 IgG 抗體，后者將競爭結(jié)合固相抗

12、原而使一部份 IgM 抗體不能結(jié)合到固相上。因此如用抗人 IgM 作為二抗，間接測定 IgM 抗體，必須先將標(biāo)本用 A 蛋白或抗 IgG 抗體處理，以除去 IgG 的干擾。在臨床檢驗(yàn)中測定抗體 IgM 時多采用捕獲包被法。先用抗人 IgM抗體包被固相，以捕獲血清標(biāo)本中的 IgM（其中包括抗原的特異性 IgM 抗體和非特異性的 IgM）。然后加入抗原，此抗原僅與特異性 IgM 相結(jié)合。繼而加酶標(biāo)記抗體。再與底物作用，呈色即與標(biāo)本中的 IgM 成正相關(guān)。此法常用于抗原的特異性染的早期。甲型肝炎（HAV）抗體的檢測模式見圖 2-7。 類風(fēng)濕因子（RF）同樣能干擾捕獲包被法測定 IgM 抗體，導(dǎo)致假陽

13、性反應(yīng)。因此中和 IgG 的間接法近來頗受青睞，用這類試劑檢測抗CMV IgGM 和抗弓形蟲 IgM 抗體已獲。2.2.7 ABS-ELISA 法 ABS素(avidin)生物素(biotin)系統(tǒng)(system)的略語。親和一種糖蛋白， 化合物，種類型的大小量 60000，每個由 4 個能和生物素結(jié)合的組成。生物小量 244。用化學(xué)方成的衍生物素-羥基琥珀酰亞胺酯可與蛋白質(zhì)和糖等多形成生物素標(biāo)記產(chǎn)物，標(biāo)記方法頗為簡便。生物素素的結(jié)合具有很強(qiáng)的特異性，其親和力較抗原抗體反應(yīng)大得多，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。由于一個親和素可與 4 個生物素結(jié)合，因此如把 ABS 與 ELISA 法可分為酶標(biāo)記親和

14、素-生物素（LAB）法和橋聯(lián)親和素-生物素（ABC）法兩種類型。兩者均以生物素標(biāo)記的抗體（或抗原）代替原ELISA 系統(tǒng)中的酶標(biāo)抗體（抗原）。在 LAB 中，固相生物素先與不標(biāo)記的親和素反應(yīng)，然后再加酶標(biāo)記的生物素以進(jìn)一步提高敏感度。在早期，親和蛋清中提取，這種卵親和堿性糖蛋白，與聚苯乙烯載體的吸附性很強(qiáng)，用于 ELISA 中可使本底增高。從鏈霉菌中提取的鏈霉親和無此缺點(diǎn)，在 ELISA 應(yīng)用中有替代前者的趨勢。由于 ABS-ELISA 較普通 ELISA多用了兩種試劑，增加了操作步驟，在臨床檢驗(yàn)中 ABS-ELISA 應(yīng)用不多。ELISA 技術(shù)中的抗原與抗體的反應(yīng)抗體1.2.1 抗體的結(jié)構(gòu)

15、抗體是能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig 分五類，即 IgG、IgA、IgM、IgD 和 IgE。與免疫測定有關(guān)的 Ig 主要為 IgG 和 IgM。Ig 由兩個輕鏈（L）和兩個重鏈（H）的單體組成。Ig 的輕鏈?zhǔn)窍嗤?，有（kappa）和（Lambda） 兩種型別。五類 Ig 的重鏈結(jié)構(gòu)不同，這決定了它們的抗原性也不同。IgG 和 IgM 的重鏈分別稱為（gamma）鏈和（mu）鏈。IgG 的結(jié)構(gòu)見圖。 木瓜酶裂解部位 胃蛋白酶裂解部位 重鏈和輕鏈的 N 端的氨基酸排列順序因各種抗體而異，稱為可變區(qū)，分別用 VH和 VL 表示。兩者抗體的抗原結(jié)合部位，

16、只與相應(yīng)的抗原決定簇匹配，發(fā)生特異性結(jié)合（見圖），是抗體專一性結(jié)合抗原的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。 IgG 可被木瓜蛋白酶分解為三個區(qū)段，其中兩個相同的區(qū)段稱抗原結(jié)合片段（Fab）。每個 Fab 都保存結(jié)合抗原的能力，但只有一個抗原結(jié)合位點(diǎn)，是單價的，與抗原結(jié)合后不出現(xiàn)凝集或沉淀。另一區(qū)段稱 Fc 段，無抗體活性，但具有 IgG 特有的抗原性。 IgG 可被胃蛋白酶分解為兩個片段，一個 Fab 雙體，稱 F（ab'）2，能和兩個相同的抗原結(jié)合；另一片段類似 Fc，隨后被分解成小多肽，無生物活性。 IgM 是由五個單體組成的五聚體，含 10 個重鏈和 10 個輕鏈，具有 10 個抗原結(jié)合價，由于空間位置

17、的影響，只表現(xiàn)為五個抗原結(jié)合價。IgM量約為 900000，IgG量約為 150000。 機(jī)體被微生物后，先產(chǎn)生 IgM 抗體，然后產(chǎn)生 IgG 抗體。經(jīng)過一段時間，IgM 抗體量逐漸減少而消失，而 IgG 抗體可長期，在疾病痊愈后可持續(xù)數(shù)年之久。 IgM抗體一般為保護(hù)性抗體具有免疫性。因此 IgM 抗體的測定，對某些傳染病如甲型肝炎有較高的臨床價值。右圖為為甲型肝炎血清中 IgG 抗體和 IgM 抗體出現(xiàn)的時間和水平。1.3 抗原抗體反應(yīng)1.3.1 可逆性 抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過程是一種動態(tài)平衡，其反應(yīng)式為：Ag+AbAgAb 抗體的親和力（affi）是抗原抗體間的固有結(jié)合力，

18、可以用平衡常數(shù) K表示： K=AgAbAgAb AgAb 的解離程度與 K 值有關(guān)。和力抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性，因此可用親和層析法來提純抗原或抗體。在抗血清中，特異性的IgG 抗體僅占總 IgG 中的極小部分。用親和層析法提取的特異性抗體，稱應(yīng)用于免疫測定中可得到更好的效果。層析純抗體，1.3.2 最適比例 在恒定量的抗體中加入遞增量的抗成抗體復(fù)合物（沉淀）的量見圖1-4。曲線的部分是抗原抗體比例最合適的范圍，稱為等價帶（zone of equivalence）。在等價帶前后分別為抗體過剩帶和抗原過

19、剩帶。如果抗原或抗體極度過剩，則無沉淀物形成， 在免疫測定中稱為帶現(xiàn)象（zone phenomenon）?？贵w過量稱為前帶（prezone），抗原地過量稱為后帶（postzone）。在用免疫學(xué)方法測定抗原時，應(yīng)使反應(yīng)系統(tǒng)中有足夠的抗體量，否則測得的量會小于實(shí)際含量，甚至出現(xiàn)假。1.3.3 特異性 抗原抗體的結(jié)合實(shí)質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)之間。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系，所以抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性。例如同一中的表面抗原（HBsAg）、e 抗原（HBeAg）和抗體（HBcAg），隨來源于，但僅與其相應(yīng)的抗體結(jié)合，而不與另外兩種抗體反應(yīng)?？乖贵w反應(yīng)的這種

20、特異性使免疫測定能在一非常復(fù)雜的蛋白質(zhì)化合物（例如血清）中測定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。 但是這種特異性也不是絕對的。假使兩種化合物有著部分相同的結(jié)構(gòu)，在抗原抗體反應(yīng)中可出現(xiàn)交叉反應(yīng)。例如：絨毛膜促激素（hCG）和生成激素（LH）均由和兩個亞組成，其結(jié)構(gòu)的不同處在亞，而兩者的亞是同類的。用hCG 免疫動物所得的抗血清中含有抗-hCG 和抗-hCG 兩種抗體，抗-hCG 抗體將與 LH中的 酶位發(fā)生交叉反應(yīng)。在臨床檢驗(yàn)中，如用抗 hCG 抗血清作為妊娠試劑檢定尿液中 hCG，只能用于 hCG 濃度較高的試驗(yàn)，否則婦女生理性排泄入尿液中的微量 LH 將與之發(fā)生交叉反應(yīng)。因此在作為早孕敏感

21、度應(yīng)達(dá)到 50mIu/mlhCG）的實(shí)際中必須應(yīng)用只對 hCG特異的抗-hCG，以避免與其它激素的交叉反應(yīng)的發(fā)生。1.3.4 敏感性 在測定血清中某一物質(zhì)的含量時，化學(xué)比色法的敏感度為 mg/ml 水平，酶反應(yīng)測定法的敏感度約為 510g/ml，免疫測定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿。標(biāo)記的免疫測定的敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá) ng/ml 水平。例如，用放射免疫測定法或酶免疫測定法測定 HBsAg，其敏感度可達(dá) 0.1ng/ml。1.4 免疫測定在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用 由于各種抗原成份，包括小的半抗原，均可用以特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測標(biāo)本中相應(yīng)的抗免疫測定的應(yīng)

22、用范圍極廣，在臨床檢驗(yàn)中可用于測定：此1)2)3)4)5)體液中的各種蛋白質(zhì)，包括含量極少的蛋白質(zhì)如甲胎蛋白等。激素，包括小量的甾體激素等?？股睾?。病原體抗原，HBsAg、HBeAg 等。另外，也可利用純化的抗原檢測標(biāo)本中的抗體，例如抗-HBs 等5 標(biāo)記的免疫測定 如上所述，免疫測定是一種很敏感的測定方法，抗原抗體反應(yīng)后直接測定形成的沉淀或濁度，敏感度可達(dá) 510g/ml，但在臨床檢驗(yàn)中，某些待測物在標(biāo)本中的含量遠(yuǎn)低于這一水平，因此要尋找增加敏感度的方法。標(biāo)記的免疫測定是將檢測試劑中的抗原或抗體用可微量測定的物質(zhì)加以標(biāo)記，通過測定標(biāo)記物來提高敏感度。在放射免疫測定和酶免疫測定中，標(biāo)記物分別

23、為放射性核素和酶，最后用測定放射性和酶活力來計(jì)算待檢物的量，敏感度可比直接測定沉淀物提高數(shù)百至數(shù)千倍。在標(biāo)記免疫測定中，一般加入過量的標(biāo)記試劑以保證與待測物徹底反應(yīng)。以標(biāo)記抗體（Ab）檢測抗原（Ag）為例，反應(yīng)式如下：Ag+ Ab AgAb+ Ab 在反應(yīng)產(chǎn)物中有與 Ag 結(jié)合的 Ab和游離和 Ab，如不將兩者分離而測定標(biāo)記物，測得的結(jié)果將為兩者之和。因此，游離標(biāo)記物與結(jié)合標(biāo)記物的分離是標(biāo)記免疫測定中的重要步驟?？刹捎枚喾N，固相載體是其中之一。如將抗原或抗體包被在固相載體上，然后再與標(biāo)記的抗原或抗體直接反應(yīng)，結(jié)合的標(biāo)記物被固定在載體上，而游離的標(biāo)記物留于溶液中。這樣可以通過洗滌將游離的 Ab除

24、去，結(jié)合標(biāo)記物的測定可在固相上進(jìn)行。6 酶免疫測定 酶免疫測定（enzyme immunoassay）可分為均相（homogenous）和非均相（heterogenous）兩種類型。在均相 EIA 中可不需進(jìn)行游離的和結(jié)合的標(biāo)記物的分離而直接測定標(biāo)記物。例如在某種條件下，抗原抗體反應(yīng)后形成的酶標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物中的酶失去其對底物作用的活力，因而測出的酶活力直接反映游離的酶標(biāo)記物。均相 EIA 在臨床檢驗(yàn)中較少應(yīng)用。非均相 EIA 需先進(jìn)行游離的和結(jié)合的標(biāo)記物的分離。如前所述，固相載體可用作一種分離。這種固相酶免疫測定方法在最初建立時稱為酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzyme linked immun

25、osorbent assay），簡稱 ELISA，在國內(nèi)有譯作酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的，雖然含義全確切，但已習(xí)用。3.ELISA 樣本處理上清以及組織勻漿等。不同樣本類型的預(yù)處理方法也不同。適當(dāng)?shù)臉颖绢A(yù)處理是確保 ELISA實(shí)驗(yàn)正確性和準(zhǔn)確性的第一步。這里，幾種不同樣本類型的處理方法。1.血清血清是 ELISA 實(shí)驗(yàn)最常用的樣本，其預(yù)處理也十分簡單。使用無熱原無內(nèi)毒素的試管或離心管血液樣本，將試管或離心管在室溫下放置 2 小時或4過夜，分離清（建議傾斜試管或離心管以擴(kuò)大液面的橫截面，使血清可以更大程度地分離出來）。4下以 1000×g 離心 20 分鐘，收集上清液（血清），立即進(jìn)定。建議在

26、-20或-80下將收集的血清分裝保存，避免反復(fù)凍融。在收集血液樣本的過程中應(yīng)避免溶血，因?yàn)榧t細(xì)胞在溶解時會具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，這種情況下，ELISA 實(shí)驗(yàn)中將會出現(xiàn)非特異性顯色反應(yīng)，導(dǎo)致檢測結(jié)果確，出現(xiàn)假陽性結(jié)果。另外，樣本還應(yīng)避免細(xì)菌污染，因?yàn)榧?xì)菌可能含有內(nèi)源性 HRP，也會導(dǎo)致檢測結(jié)果確。2.血漿使用含抗凝劑的采或離心管血液樣本，后 30 分鐘內(nèi)，4下以 1000×g 離心15 分鐘，收集上清液（血漿）。建議在-20或-80下將收集的血漿分裝保存，避免反復(fù)凍融。樣本應(yīng)避免溶血或高血脂。常見的抗凝劑包括 EDTA，肝素鈉，枸櫞酸鈉等。檢測前請仔細(xì)閱讀 ELISA 試劑盒說明書

27、，查看該試劑盒抗凝劑是否有特殊要求。3.細(xì)胞培養(yǎng)上清將細(xì)胞培養(yǎng)上清液吸入離心管中并以 1000×g 離心 20 分鐘，除去細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，收集上清液備用，樣本保-20或-80，避免反復(fù)凍融。可用于 ELISA 實(shí)驗(yàn)的樣本一般有血清、血漿、尿液、細(xì)胞培養(yǎng)4.細(xì)胞反復(fù)凍融方法1） 吸出培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，然后加入適量的培養(yǎng)基將培養(yǎng)板上的細(xì)胞沖洗干凈。懸浮細(xì)胞可以省略該步驟。2） 將細(xì)胞懸浮液收集到離心管中，以 1000×g 離心 10 分鐘，然后吸去培養(yǎng)基，用預(yù)冷 PBS洗滌細(xì)胞 3 次。3） 加入適量的預(yù)冷 PBS（建議在使用前立即加入蛋白酶抑制劑）重懸細(xì)胞

28、。在 6 孔培養(yǎng)板中，每個孔需要 150-250L 的 PBS 來重懸細(xì)胞。4） 使樣本在-20或-80條件和室溫條件下反復(fù)凍融，重復(fù)凍融過程數(shù)次，直至細(xì)胞完全裂解。也可以使用超聲波細(xì)胞破碎器超聲處理懸浮液來裂解細(xì)胞。5）4下以 10,000×g 離心 10 分鐘，去除細(xì)胞碎片，收集上清液， -20或-80保存，避免反復(fù)凍融。5.組織勻漿1）用預(yù)冷的 PBS（0.01M，PH7.4）沖洗組織以除去表面殘留的血液或雜質(zhì)。2）將組織塊稱重，然后切成盡可能小的碎塊，以便充分勻漿。3）加入適量的預(yù)冷 PBS（體積取決于組織的重量，9 mLPBS 適用于 1 g 組織，建議使用前立即在 PBS

29、 中加入適量蛋白酶抑制劑），用勻漿器在冰上或冰浴中充分勻漿。4） 將勻漿液吸入離心管中，4 下以 5000×g 離心 510 分鐘，收集上清液，保存至-20或-80，避免反復(fù)凍融。6.尿液、唾液及其他生物體液以 1000×g 離心 20 分鐘，收集上清液，立即進(jìn)定。一般來說，由于 ELISA 實(shí)驗(yàn)只能檢測可溶性蛋白質(zhì)的含量，因此要求樣本應(yīng)清晰透明并離心除去沉淀物或懸浮物質(zhì)。為確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性， -20或-80保存的樣本應(yīng)在1-6內(nèi)完成檢測，4保存的樣本在一周內(nèi)完成檢測。此外，樣本中不能含有會抑制 HRP活性的 NaN3，否則會造成假結(jié)果。4 ELISA 技術(shù)的-操作要點(diǎn)優(yōu)質(zhì)

30、的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證 ELISA 檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件。ELISA 的操作因固相載體的形成不同而有所差異，國內(nèi)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)一般均用板式點(diǎn)。本文將敘述板式ELISA 各個操作步驟的注意要點(diǎn)，珠式、管式及磁性球 ELSIA，國外試劑均與特殊儀器配合應(yīng)用，兩者均有詳細(xì)的使用說明，嚴(yán)格遵照規(guī)定操作，必能得出準(zhǔn)確的結(jié)果。4.1 標(biāo)本的采取和保存可用作 ELISA 測定的標(biāo)本十分廣泛，體液（如血清）、物（唾液）和排泄物（如尿液、糞便）等均可作標(biāo)本以測定其中某種抗體或抗原成份。有些標(biāo)本可直接進(jìn)定（如血清、尿液），有些則需經(jīng)預(yù)處理（如糞便和某些物）。大部分 ELISA 檢測均以血清為標(biāo)本。血

31、漿中除尚含有蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等于血清。血漿標(biāo)本需借助于抗凝劑，而血清標(biāo)本只要待血清自然凝固、血塊收縮后即可取得。除特殊情況外，在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中均以血清作為檢測標(biāo)本。在 ELISA 中血漿和血清可同等應(yīng)用。血清標(biāo)本可按常規(guī)方法，應(yīng)注意避免溶血，紅細(xì)胞溶解時會出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以 HRP 為標(biāo)記的 ELISA測定中，溶血標(biāo)本可能會增加非特異性顯色。 血清標(biāo)本新鮮時檢測。細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性 HRP，也會產(chǎn)生假 陽性反應(yīng)。如在冰箱中保存，其中的可發(fā)生聚合，在間接法 ELISA 中可使本底加深。一般說來，在 5 天內(nèi)測定的血清標(biāo)本可放置于 4，超過一周測定的需低溫冰存。凍

32、結(jié)血清宜輕緩，避免氣泡，可上下顛倒混和，本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測。反融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻不要在混勻器上強(qiáng)烈振蕩?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢?biāo)復(fù)凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰 存。保存血清自適當(dāng)防腐劑（見 3.2.4）。4.2 試劑的準(zhǔn)備時就應(yīng)注意無菌操作，也可加入按試劑盒說明書的要求準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)中需用的試劑。ELISA 中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的。自配的緩沖液應(yīng)用 pH 計(jì)測量較正。從冰箱中取出的試驗(yàn)用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗(yàn)不需用的部分應(yīng)及時放回冰箱保存。4.3 加樣 在 E

33、LISA 中一般有 3 次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時所加物加在 LEISA 板孔的底部，避免加在標(biāo)本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。 加。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染，也可用的定量管加樣。有此測定（如間接法 ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板加入稀釋液，再在其中加入血清標(biāo)本，然后在微型震蕩器上震蕩 1 分鐘以保證混和。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成。4.4 保溫在 ELISA 中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后?？乖贵w反應(yīng)的完成需要有

34、一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為(incubation)，有人稱之為孵育，在 ELISA中似不恰當(dāng)。 ELISA 屬固相免疫測定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板的標(biāo)本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機(jī)會，只有最貼近的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程，因此需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn)。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么 ELISA 反應(yīng)總是需要一定時間的。采用的溫度有 43、37、室溫和 4度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。（冰箱溫度）等。37是中常用的保在建立 ELISA 方法作反應(yīng)動力學(xué)研究時

35、，實(shí)驗(yàn)表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在 37經(jīng) 1-2小時，產(chǎn)物的生成可達(dá)頂峰。為反應(yīng)，可提高反應(yīng)的溫度，有些試驗(yàn)在 43進(jìn)行，但不宜采用更高的溫度?？乖贵w反應(yīng) 4更為徹底，在放射免疫測定中多使反應(yīng)在冰箱中過夜，以形成最多的沉淀。但因所需時間太長，在 ELISA 中一般不予采用。 保溫的有的 ELISA 儀器附有特制的電熱塊外，一般均采用水浴，可將 ELISA 板置于水浴箱中，ELISA板底應(yīng)貼著水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反應(yīng)板漂浮在水面上。若用保溫箱，ELISA 板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，最后

36、將 ELISA 板放在濕紗布上。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)規(guī)定的溫度，特別是在氣溫較低的時候更應(yīng)如此。無論是水浴還是濕盒，反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室育的反應(yīng)，操作時的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室度是指 20-25，但具體操作時可根據(jù)說明書的要求。室育時，ELISA 板只要平置于操作臺上即可。應(yīng)注意的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證這一點(diǎn)，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。4.5 洗滌洗滌在 ELISA 過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。ELSIA 就是靠洗滌來達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板沒能與固相抗原或抗體結(jié)

37、合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。可以說在 ELISA 操作中，洗滌是最主要的格按要求洗滌，不得馬虎。 洗滌的，應(yīng)引起操作者的高度重視，操作者應(yīng)嚴(yán)某些 ELISA 儀器配有特殊的自動洗滌儀外，手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種，過程如下： （1）浸泡式 a.吸干或甩干反應(yīng)液；b.用洗滌液過洗一遍（將洗滌液注滿板，即甩去）；c.浸泡，即將洗滌液注滿板孔，放置1-2 分鐘，間歇搖動，浸泡時間不可隨意縮短；d.吸干液體。吸干應(yīng)徹底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水

38、紙上拍干；e.重復(fù)操作 c 和d，洗滌 3-4 次（或按說明規(guī)定）。在間接法中如本底較高，可增加洗滌次數(shù)或延長浸泡時間。 微量滴定板多采用浸泡式洗滌法。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，也含親水基團(tuán)，其疏水基團(tuán)與蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)借疏水鍵結(jié)合，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團(tuán)和水的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫 20，其濃度可在 0.05%-0.2%之間，高于 0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗(yàn)的靈敏度。 （2）流水沖洗式 流水沖

39、洗法最初用于小珠載體的洗滌， 洗滌液僅為蒸餾水甚至可用自來水。洗滌時附接一特殊裝置，使小珠在流水沖擊下不斷地滾動淋洗，持續(xù)沖洗 2 分鐘后，吸干液體，再用蒸餾水浸泡 2 分鐘，吸干即可。浸泡式猶如盆浴，流水沖洗式則好比淋浴，其洗滌效果更為徹底，且也簡便、快速。已有實(shí)驗(yàn)表明，流水沖洗式同樣也適用于微量滴定板的洗滌。洗滌時設(shè)法加大水流量或加大水壓，讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。4.6 顯色和比色4.6.1 顯色 顯色是 ELISA 中的最后一步反應(yīng)，此時酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內(nèi)，保持無色，而陽性隨時間的延長而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于顯

40、色進(jìn)行。在定量測定中，加入底物后的反應(yīng)溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。定性測定的顯色可在室溫進(jìn)行，時間一般不需要嚴(yán)格控制，有時可根據(jù)陽性對照對照孔的顯況適當(dāng)縮短或延長反應(yīng)時間，及時。OPD 底物顯色一般在室外溫或 37反應(yīng) 20-30 分鐘后即不再加深，再延長反應(yīng)時間，可使本底值增高。OPD 底物液受光照會自行變色，顯色反應(yīng)應(yīng)避光進(jìn)行，顯色反應(yīng)結(jié)束時加入終止液終止反應(yīng)。OPD 產(chǎn)物用硫酸終止后，顯色由橙黃色轉(zhuǎn)向棕黃色。 TMB 受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應(yīng)觀察結(jié)果。但為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，規(guī)定的適當(dāng)時間閱讀結(jié)果。TMB 經(jīng) HRP 作用后，約 40 分鐘顯色達(dá)頂峰，隨即逐漸減

41、弱，至 2 小時后即可完全消退至無色。TMB 的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止。這類終止劑尚能使維持較長時間（12-24 小時）不褪，是目視的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會使測讀吸光值。轉(zhuǎn)變成黃色，此時可用特定的波長（450nm）4.6.2 比色比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗(yàn)，需先將板置于標(biāo)準(zhǔn) 96 孔的座架中，進(jìn)行比色。最好在加底物液顯色前，先將軟板邊緣剪凈，這樣，此板就可完全平妥坐入座架中。 比色時應(yīng)先以蒸餾水校零點(diǎn)，測讀底物孔（任何反應(yīng)僅加底物液的空白生理鹽水或稀釋液蒸餾水

42、校零點(diǎn)，代替標(biāo)本作全過程的孔），以本次試驗(yàn)的試劑狀況。其后可用空白以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行計(jì)算。 比色結(jié)果的表達(dá)以往通用光密度（oplical density，OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫于 A 字母的右下角，如 OPD 的吸收波長為 492nm，表示方法為"A492nm"或"OD492nm"。4.6.3 酶標(biāo)比色儀酶標(biāo)比色儀簡稱酶標(biāo)儀，通常指于測讀 ELISA 結(jié)果吸光度的光度計(jì)。固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設(shè)計(jì)。許多試劑公司配套供應(yīng)酶標(biāo)

43、儀。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到 0.001，準(zhǔn)確性為±1%，重復(fù)性達(dá) 0.5%。舉例說，若某孔測得的 A 值為 1.083，則該孔相對于空氣的真實(shí) A 值應(yīng)為 1.083±0.01(1.0731.093），重復(fù)測定數(shù)次，其 A 值均應(yīng) 1.083±0.05（1.0781.088）在之間。酶標(biāo)儀的可測范圍視各酶標(biāo)儀的性能而不同。普通的酶標(biāo)儀在 0.0002.000，新型號的酶標(biāo)儀上限拓寬達(dá) 2.900，甚至更高。超出可測上限的 A 值常以"*"或"o

44、ver"或其它符號表示。應(yīng)注意可測范圍與線性范圍的不同，線性范圍常小于可測范圍，比如某一酶標(biāo)儀的可測范圍為 0.0002.900，而其線性范圍僅 0.0002.000，這在定量 ELISA 中制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時應(yīng)予注意。 酶標(biāo)儀不應(yīng)安置在陽光或強(qiáng)光照射下，操作時室溫1530，使用前先預(yù)熱儀器 15-30 分鐘，測讀結(jié)果更穩(wěn)定。 測讀 A 值時，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如 OPD 用 492nm 波長。有的酶標(biāo)儀可波長式測讀，即每孔先后測讀兩次，第一次在最適波長（W1），第二次在不敏感波長（W2）， 兩次測定間不移動 ELISA 板的位置。例如 OPD 用 492nm 為 W1，630nm

45、 為 W2，最終測得的 A值為兩者之差（W1-W2）。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。 各種酶標(biāo)儀性能有所不同，使用中應(yīng)詳細(xì)4.7 結(jié)果4.7.1 定性測定說明書。定性測定的結(jié)果分別用"陽性"、"是對受檢標(biāo)本中是否含有待測抗原或抗體作出"有"或"無"的簡單回答，"表示。"陽性"表示該標(biāo)本在該測定系統(tǒng)中有反應(yīng)。""則為無反應(yīng)。用定性法也可得到半定量結(jié)果，即用滴度來表示反應(yīng)的強(qiáng)度，其實(shí)質(zhì)仍是一個定性試驗(yàn)。在這種半定量測定中，將標(biāo)本作一系列稀釋后進(jìn)行試驗(yàn)，呈陽

46、性反應(yīng)的最高稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低，可以標(biāo)本反應(yīng)性的強(qiáng)弱，這比觀察不稀釋標(biāo)本呈色的深淺為性、弱陽性更具定量意義。 在間接法和夾心法 ELSIA 中，陽性色深于孔。在競爭法 ELISA 中則相反色深于陽性孔。兩類反應(yīng)的結(jié)果方法不同，分述。（1）間接法和夾心法 這類反應(yīng)的定性結(jié)果可以用肉眼。目視標(biāo)本也無色或近于無色者判為，顯色清晰者為陽性。但在 ELSIA 中，正常人血清反應(yīng)后出現(xiàn)呈色的本底，此本底的深淺因試劑的組成和實(shí)驗(yàn)的條件不同而異，因此實(shí)驗(yàn)中必須加測對照。對照的組顯色深于下，應(yīng)該用成應(yīng)為不含受檢物的正常血清或類似物（見 3.6）。在用肉眼結(jié)果時，更對照作為標(biāo)本陽性的指標(biāo)。 目視法簡捷

47、明了，但頗具性。在條件比色計(jì)測定吸光值，這樣可以得到客觀的數(shù)據(jù)。先讀出標(biāo)本（sample，S）、陽性對照（P）、和對照（N）的吸光值，然后進(jìn)行計(jì)算。計(jì)算方法有多種，大致可分為陽性判定值法和標(biāo)本與對照比值法兩類。 a 陽性判定值 陽性判定值（cut-off value）一般為對照 A 值加上一個特定的常數(shù)，以此作為結(jié)果陽性或的標(biāo)準(zhǔn)。 用此法結(jié)果要求實(shí)驗(yàn)條件十分恒定，試劑的必須標(biāo)準(zhǔn)化，陽性和的對照品應(yīng)符合一定的規(guī)格，須配用精密的儀器，并嚴(yán)格按規(guī)定操作。陽性判定值公式中的常數(shù)是在這特定的系統(tǒng)中通過對大量標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)檢測而得到的。現(xiàn)舉某種檢測 HBsAg 的試劑盒為例。試劑盒中的對照品為不含 HBsAg

48、 的復(fù)鈣人血漿，陽性對照品 HBsAg 的含量標(biāo)明為 P=9±2ng/ml。每次試驗(yàn)設(shè) 2個陽性對照和 3 個對照。測得 A 值后，先計(jì)算對照 A 值的平均數(shù)（NCX）和陽性對照 A 值的平均數(shù)（PCX），兩個平均數(shù)的差（P-N）必須大于一個特定的數(shù)值（例 0.400），試驗(yàn)才有效。3 個對照 A 值均應(yīng)0.5×NCX，并1.5×NCX，如其中之一超出此范圍，則棄去，而已另兩個對照重新計(jì)算 NCX；兩個對照 A 值超出以上范圍，則該次實(shí)驗(yàn)無效。陽性判定值按下式計(jì)算： 陽性判定值=NCX+0.05 標(biāo)本 A 值陽性判定值的為陽性，小于陽性判定值的為。應(yīng)注意的是，式中

49、 0.05 為該試劑盒的常數(shù)，只適合于該特定條件下，而不是對各種試劑均可通用。 根據(jù)以上敘述可以看出，在這種方法中對照和陽性對照也起到試驗(yàn)的質(zhì)控作用，試劑變質(zhì)和操作不當(dāng)均會產(chǎn)生"試驗(yàn)無效"的后果。 b.標(biāo)本/對照比值 在實(shí)驗(yàn)條件（包括試劑）較難保證恒定的情況下，這種法較為合適。在得出標(biāo)本（S）和對照（N）的 A 值后，計(jì)算 S/N 值。也有寫作 P/N 的，這里的 P 不代表陽性(positive)，而是（patient）的縮寫，不應(yīng)誤解。為避免，更S/N 表示。在早期的間接法 ELISA 中，有些作者定出 S/N 為陽性標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)多為各種測定所沿用。實(shí)際上每一測定系統(tǒng)應(yīng)該用

50、實(shí)驗(yàn)求出各自的 S/N 的閾值。更應(yīng)注意的是，N 所代表的對照是不含受檢物質(zhì)的人血清。有的試劑盒中所設(shè)對照為不含蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)含量較底的緩沖液，以致反應(yīng)后產(chǎn)生的本底可能較正常人血清的本底低得多。做 ELISA 試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品檢測時有幾個問題需要注意1、樣品的濃度等指標(biāo)是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出來的，所以首先要把做標(biāo)準(zhǔn)曲線看作是比做正式實(shí)驗(yàn)還要重要的一件事，否則后面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果無從談起。3、最好采用倍比稀釋法配制標(biāo)準(zhǔn)曲線中的標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度，ELISA 試劑盒這樣就能夠保證標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度出現(xiàn)較大的偏離。4、檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品時，應(yīng)按濃度遞增順序進(jìn)行，以減少高濃度對低濃度的影響，提高準(zhǔn)確性。5、標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品數(shù)

51、一般為 7 個點(diǎn)，但至少要保證有 5 個點(diǎn)。6、做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)因?qū)嶒?yàn)要求不同而有所變動，但一般來說，相關(guān)系數(shù) R 至少要大于 0.98，對于有些實(shí)驗(yàn)，至少要 0.99 甚至是 0.999.二、選擇什么方程去擬合在 S 曲線的低濃度部門可以用乘冪方程很好的擬合，中低濃度部門可以用直線方程，中間部門可用對數(shù)方程，而中后段可用四參數(shù)。免疫檢測時尺度點(diǎn)（可以是倍比稀釋的，也可以不2、設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的標(biāo)準(zhǔn)濃度范圍要有一個比較大的跨度，并且要能涵蓋你所要檢測實(shí)驗(yàn)樣品的濃度，即樣品的濃度要在標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍之內(nèi)，包括上限和下限。而對于呈 S型的標(biāo)準(zhǔn)曲線，盡量要使實(shí)驗(yàn)樣品的濃度在中間坡度最陡段，即曲

52、線幾乎成直線的范圍內(nèi)。是）濃度假如和相應(yīng)的吸光度（OD）值假如能夠呈現(xiàn)直線關(guān)系當(dāng)然是最理想的了，這時可以通過 EXELL 等利便的獲得擬合曲線，進(jìn)而推算出樣品的濃度值。關(guān)于尺度曲線的擬合方式，直線、二次曲線、三次曲線、指數(shù)、對數(shù)等雖都可用于 ELISA及其它生物學(xué)反應(yīng)中的曲線擬合，但合用于曲線的一部門，有的合用于前半段，有的合用于后半段，有的合用于段，而 Logistic 曲線則對曲線的全部都有較好的合用性。分，你想檢測的樣品濃度在曲線的哪一部分。當(dāng)然，假如用于定量，仍是在段較好。但建模型是一回事，ELISA 試劑盒而用它來定量是另一回事。這些方法固然重要，但沒有一 種方法可以通用，但也都可以

53、用，也并不是說它就是萬能的。事實(shí)上不僅是 ELISA，其它生物學(xué)反應(yīng)都是 S 形曲線，也都可以用 Logistic 曲線擬合。在 ELISA 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，我們得到的是經(jīng)酶標(biāo)儀得出的標(biāo)準(zhǔn)品以及樣本的 OD 值。其中，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度已知，我們可以利用標(biāo)準(zhǔn)品的 OD 值及其相對應(yīng)的濃度，以 OD 值為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)，做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，并用公式表示出來。這樣，我們把樣本的 OD 值以 X 值代入， 便可求出 Y 值，即樣本濃度。1、首先，將數(shù)據(jù)整理好輸入 Excel，分別為經(jīng)酶標(biāo)儀讀出標(biāo)準(zhǔn)品的 OD 值及其對應(yīng)的濃度值。2、拖動鼠標(biāo)選取完成的數(shù)據(jù)區(qū)，并點(diǎn)擊圖表向?qū)?，在圖表類型中選“XY 散點(diǎn)圖”，并

54、選擇子圖表類型的“散點(diǎn)圖”（第一個沒有連線的），如下圖所示。在一個長的區(qū)間內(nèi)，Logistic 應(yīng)該都能擬合得較為理想。假如用來定量，S 形曲線的中間段（較陡處）是比較好的，而兩真?zhèn)€平坦部門計(jì)算誤差會大，有時甚至?xí)艽?。用于免疫檢測的所謂“尺度曲線"實(shí)在稱為擬合曲線比較合適。目前國際上最流行的免疫檢測擬合方式是“四參數(shù)邏輯擬合"，用這種擬合方式往往能夠比較精確的反映濃度和吸光度的曲線關(guān)系， 從而進(jìn)一步比較準(zhǔn)確的獲得樣品中待測物質(zhì)的濃度值。但我們做免疫檢測很少有時候能夠有這么理想的情況，標(biāo)品濃度和相應(yīng) OD 值往往是"S"型的曲線關(guān)系，這時就不能用直線擬合的方式了，而對擬合方法進(jìn)行選擇就是必要的了。關(guān)鍵在于你的尺度曲線做到了 S 形的哪一部3、點(diǎn)擊“”，出現(xiàn)如下圖界面。如是輸入是如本例橫向列表的就不用更改，如果是縱向列表就改選“列”。4、在做 ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線，并通過此曲線求樣本濃度時，因樣本 OD 值是已知的，因此我們需要將 OD 值設(shè)為 X。根據(jù)上圖我們可以看到，橫坐標(biāo) X 值為 OD 值，縱坐標(biāo) Y 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，這正是