1、淺談大孔吸附樹脂分離純化長春花中長春堿和長春新堿                 作者：潘岳峰,王慧敏,張?,韓靜,張立軍,殷莉梅,楊靜 【摘要】  目的 優(yōu)選分離純化長春花中長春堿和長春新堿的最佳工藝參數(shù)。方法 采用不同型號大孔吸附樹脂對長春花中長春堿和長春新堿分離純化,用不同濃度乙醇水溶液以不同速度洗脫,配合硅膠柱層析,以hplc跟蹤檢測。結(jié)果 ab-8型樹脂分離效果佳,90%乙醇水溶液以1.5 bv/h的速度洗脫,總比吸

2、附量達(dá)到74.5 mg/g,經(jīng)硅膠柱層析后長春新堿純度達(dá)97.26%,長春堿純度達(dá)94.18%。結(jié)論 該工藝簡便合理,重復(fù)性良好,能得到高純度的長春堿和長春新堿。 【關(guān)鍵詞】  大孔吸附樹脂；長春花；長春新堿；長春堿     abstract：objective to optimize the technological parameters of separation and purification of vinblastine and vincristine from gatharanthus roseus. methods different t

3、ypes of macroporous adsorption resin were used to separate and purify vinblastine and vincristine from gatharanthus roseus, eluting with different concentration of alcohol aqueous and velocities, combined with silica gel column chromatography, the process was monitored by hplc. results ab-8 type res

4、in showed better comprehensive adsorption property, 90% alcohol aqueous and 1.5 bv/h velocities were used to elute. ratio adsorption quantity was achieved to 74.5 mg/g. through silica gel column chromatography, the purity of vincristine was achieved to 97.26% and the purity of vinblastine was achiev

5、ed to 94.18%. conclusions the process is simple and reasonable with good reproducibility. it is effective to enrich highly purified vinblastine and vincristine.    key words：macroporous adsorption resin；gatharanthus roseus；vinblastine；vincristine     長春花為夾竹桃科長春花屬中一

6、種重要的藥用植物,迄今已經(jīng)分離出70余種生物堿,其中以長春新堿(vincristine)和長春堿(vinblastine)最具價(jià)值。長春新堿通過作用于腫瘤細(xì)胞微管蛋白而干擾腫瘤細(xì)胞代謝,臨床主要用于治療急性淋巴細(xì)胞白血病、何杰金及非何杰金淋巴瘤,也用于乳腺癌、支氣管肺癌、軟組織肉瘤及神經(jīng)母細(xì)胞瘤等。     對于長春堿和長春新堿的分離純化工藝,國內(nèi)外已有相關(guān)介紹,gunaselcera sarath p1、atta-ur-rahman2、jean-hugues renault3等人分別采用不同方法純化長春堿和長春新堿,但大都煩瑣、耗時(shí)、耗費(fèi)有機(jī)溶劑,造成環(huán)境污染,

7、且成本高,不利于工業(yè)化生產(chǎn)。    由于大孔吸附樹脂廣泛應(yīng)用于天然植物活性成分(皂苷、黃酮、生物堿等)的提取分離4-6,經(jīng)該技術(shù)處理后可使有效成分高度富集,且可有效除去大量糖類、無機(jī)鹽等成分, 降低產(chǎn)品吸潮性,提高產(chǎn)品質(zhì)量。因此,本試驗(yàn)主要通過此技術(shù)對長春花中長春新堿和長春堿的分離純化工藝進(jìn)行研究,并配合硅膠柱層析,得到較高純度的長春堿和長春新堿。 1  儀器與試藥     長春花提取液(自制,含總堿17.95 mg/ml,沈陽藥科大學(xué)生物化工實(shí)驗(yàn)室鑒定)；長春花(海南省)；長春新堿和長春堿標(biāo)準(zhǔn)品(廣東嶺南制藥有限公司提供)

8、。甲醇(山東市禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司),磷酸(沈陽經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)試劑廠),二乙胺(天津市博迪化工有限公司),乙醇(天津市百世化工有限公司),超純水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司),硅膠(青島海洋化工廠分廠)。大孔樹脂：d101(天津市瑞金特化學(xué)品有限公司),d102(天津南開大學(xué)化工廠),ab-8(天津南開大學(xué)化工廠),d-3520(天津南開大學(xué)化工廠),hpd-100(河北滄州寶恩化工有限公司)。     jy92-2d型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司),高效液相色譜儀(日本日立公司),df-101s型恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限公司),

9、shz-d(?)型循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限公司),alc-210.3型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司),800b臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。 2  方法與結(jié)果 2.1  高效液相色譜分析     色譜條件：采用diamonsi1tm c18色譜柱(200 mm×4.6 mm, 5 m,迪馬公司)；流動相為甲醇-水-二乙胺(7002955),磷酸調(diào)ph7；柱溫為30 ；流速為1.0 ml/min；紫外檢測波長為297 nm；進(jìn)樣量為20 l。   長春新堿標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：a3×107

10、c12 292(r0.999 5),線性范圍2.020.0 g/ml；長春堿標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：a2×107c78 105(r0.999 6),線性范圍5.030.0 g/ml。 2.2  長春堿和長春新堿分離純化工藝的優(yōu)選 2.2.1  長春花提取液的制備  以長春花全草為原料,提取長春總堿主要采用超聲法,最佳工藝為：90%甲醇水溶液作溶劑、浸泡時(shí)間為16 h、超聲溫度為40 、功率為600 w、超聲30 min。長春新堿和長春堿的提取率可達(dá)到90.14%和79.26%。    由于藥液濃度直接影響樹脂的吸附效果,根據(jù)lang

11、muir單分子層理論7,樹脂的吸附量與藥液的濃度在一定范圍內(nèi)成正比,因此,根據(jù)預(yù)試驗(yàn),選擇最佳藥液濃度為17.95 mg/ml,其中長春新堿8.11 mg/ml,長春堿6.12 mg/ml。 2.2.2  樹脂的篩選  選擇大孔吸附樹脂分離有效成分時(shí)利用其吸附的可逆性8-10。根據(jù)“相似相溶”原理,脂溶性成分如生物堿等應(yīng)選用非極性或弱極性樹脂,因此,預(yù)選d101、d102、ab-8、d-3520、hpd-100共5種樹脂。 2.2.3  樹脂的預(yù)處理 取以上樹脂,分別在提取器內(nèi)加入高于樹脂層10 cm的80%乙醇,浸漬4 h后用80%乙醇淋洗,至流出液用一定量的水

12、稀釋不混濁,再用水反復(fù)洗滌至乙醇含量小于1%。用2 bv的5%hcl溶液,以4 bv/h的流速通過樹脂層,并浸泡4 h后,用水洗至中性,再用2 bv的2%na0h溶液,同法洗至中性備用。 2.2.4  靜態(tài)吸附試驗(yàn)  精密稱取預(yù)處理后樹脂,每份含干燥樹脂5.0 g,分別加入長春花提取液50 ml,在常溫磁力攪拌下吸附12 h,過濾,測定不同樹脂濾液中長春堿和長春新堿的含量。將各過濾后樹脂中加入70%乙醇50 ml,放置12 h,過濾得解析液,同法測定含量。計(jì)算樹脂對長春堿和長春新堿的吸附能力,公式：a吸c(diǎn)1v1c2v2/w,其中a吸為樹脂比吸附量(mg/g), c1為提取液

13、有效成分含量(mg/ml),v1為提取液體積(ml),c2為濾液有效成分含量(mg/ml),v2為濾液體積(ml),w為樹脂質(zhì)量(g)。a解c3v3/wa吸,其中a解為樹脂解吸率(%),c3為解析液中有效成分含量(mg/ml),v3為解析液體積(ml)。結(jié)果見表1。以優(yōu)選ab-8型樹脂為最佳。表1  不同樹脂的靜態(tài)吸附能力（略） 2.2.5  動態(tài)吸附試驗(yàn)  精密稱取預(yù)處理后樹脂ab-8(含干燥樹脂5.0 g),濕法裝入2.1 cm×40 cm的柱子中,不斷加入長春花提取液,吸附流速為2 bv/h,每試管收集5 ml流出液。hplc測定長春堿和長春新堿的

14、含量,結(jié)果見圖1。     由圖1可知,當(dāng)流出液體積為100 ml時(shí)長春堿的泄漏量開始增大,流出液體積為125 ml時(shí)長春新堿的泄漏量顯著增大,根據(jù)公式p吸(c前c后)v吸/w,其中p吸為樹脂比吸附量(mg/g), c前為吸附前提取液有效成分含量(mg/ml),c后為吸附后溶液有效成分含量(mg/ml),v吸為吸附溶液體積(ml),w為樹脂質(zhì)量(g),確定樹脂最佳比上柱量為68.36 mg/g。2.2.6  洗脫中乙醇濃度的考察  精密稱取預(yù)處理后樹脂ab-8(含干燥樹脂5.0 g),取長春花提取液50 ml,吸附流速為2 bv/h,分別選擇8

15、0%、85%、90%、95%,100%乙醇洗脫,洗脫流速為1.5 bv/h,收集洗脫液,hplc檢測,并計(jì)算洗脫能力：ec洗v洗/w,其中e為比洗脫量(mg/g),c洗為洗脫液中有效成分含量(mg/ml),v洗為洗脫液體積(ml),w為樹脂質(zhì)量(g)。結(jié)果見圖2。     由圖2可知,隨著乙醇濃度逐漸增大,長春新堿的比洗脫量也不斷上升,90%時(shí)達(dá)到最大；乙醇濃度在85%和90%時(shí)長春堿的比洗脫量較高且基本持平,因此,考慮成本及誤差,選擇90%乙醇溶液作為長春堿和長春新堿的洗脫劑。 2.2.7  洗脫流速的考察  精密稱取預(yù)處理后樹脂ab-8(含

16、干燥樹脂5.0 g),取長春花提取液50 ml,吸附流速為2 bv/h,以90%乙醇洗脫,洗脫流速分別為0.5、1、1.5、2、2.5 bv/h,hplc檢測,計(jì)算樹脂洗脫能力,以洗脫流速1.5 bv/h最佳。見圖3。 2.2.8  洗脫液中酸液濃度的考察  保持其他條件不變,選擇不同濃度的硫酸溶液調(diào)節(jié)洗脫液ph值,hplc檢測,計(jì)算樹脂洗脫能力(見圖4)?？梢?當(dāng)酸液濃度為3%時(shí),長春堿和長春新堿的洗脫效果達(dá)到最佳。 2.2.9  洗脫終點(diǎn)的考察  精密稱取預(yù)處理后樹脂ab-8(含干燥樹脂5.0 g),取長春花提取液50 ml,吸附流速為2 bv/h,

17、用90%乙醇溶液洗脫,調(diào)節(jié)酸液濃度為3%,洗脫流速為1.5 bv/h,收集洗脫液,hplc檢測(見圖5)?？梢?流出液體積為25100 ml時(shí),組分含量逐漸增加,大于100 ml時(shí)長春堿含量驟然降低,大于125 ml時(shí)長春新堿含量亦驟然降低,當(dāng)流出液體積大于175 ml時(shí),已經(jīng)基本將組分洗脫完畢。 2.2.10  硅膠純化工藝及結(jié)果 將大孔吸附樹脂分離后的長春總堿(含量為76.4%)采用硅膠柱進(jìn)一步純化。優(yōu)選二氯甲烷-甲醇201作為長春堿的洗脫劑,151作為長春新堿的洗脫劑,hplc檢測(見圖6圖8),得長春堿純度97.26%,收率61.12%；長春新堿純度94.18%,收率58.5

18、0%。 3  討論     采用靜態(tài)吸附與解吸試驗(yàn),從5種非極性或弱極性大孔吸附樹脂中,篩選出適用于長春堿和長春新堿分離純化的ab-8型樹脂；通過動態(tài)吸附實(shí)驗(yàn),以比吸附量、解吸率、比洗脫量為指標(biāo),確定最佳條件為：比上柱量68.36 mg/g,洗脫液濃度90%乙醇水溶液,洗脫流速1.5 bv/h,酸液濃度3%,洗脫終點(diǎn)175 ml。     洗脫液的選擇應(yīng)符合2個條件：其一,溶劑應(yīng)能使大孔網(wǎng)狀吸附劑溶脹,這樣可減弱溶質(zhì)和吸附劑之間的吸附力；其二,溶劑應(yīng)容易溶解吸附物。因此,綜合考慮選擇乙醇水溶液作為溶劑。在弱堿性物質(zhì)洗脫過程中

19、,宜調(diào)節(jié)ph值,使溶劑呈酸性易于洗脫。   本試驗(yàn)改變傳統(tǒng)分離純化長春總堿的方法,首先采用成本低、易操作的大孔樹脂分離,再通過硅膠柱層析,將吸附后含量為76.4%的總堿進(jìn)一步純化,得長春堿純度97.26%,收率61.12%；長春新堿純度94.18%,收率58.50%。該工藝收率高,避免使用有機(jī)溶劑,環(huán)保,適宜工業(yè)化生產(chǎn)。大孔吸附樹脂每使用一次,比上柱量約下降4%,因此,大孔樹脂再生問題有待進(jìn)一步考察。 【參考文獻(xiàn)】  1 guanasekera sarath p, (vero beach fl). process of isolating vinblastine from the plant catharanthis roseus p. united states patent：w088/03135,5 may,1988.2 atta-ur-rahman. a rapid procedure for the isolation of catharant