1、1 冷凍電鏡發(fā)展背景人類基因組計(jì)劃的完成，標(biāo)志著科學(xué)已進(jìn)入后基因組時(shí)代。雖然大量的基因序列得到闡明，但是生物大分子如何從這些基因轉(zhuǎn)錄、翻譯、加工、折疊、組裝，形成有功能的結(jié)構(gòu)單元，尚需進(jìn)一步的研究。后基因組時(shí)代人類面臨的一個(gè)挑戰(zhàn)是解析基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，建立結(jié)構(gòu)基因組學(xué)，并在原子水平上解釋核酸蛋白，蛋白蛋白之間的相互作用，從而闡明由這些生物大分子和復(fù)合物所行使的生物學(xué)功能。在此過程中，結(jié)構(gòu)生物學(xué)在其中扮演著重要角色。對生物大分子結(jié)構(gòu)的解析，不僅具有深遠(yuǎn)的基礎(chǔ)意義，而且具有廣闊的應(yīng)用前景。通過對核酸、蛋白質(zhì)及其復(fù)合物的結(jié)構(gòu)解析，人們對它們的功能的理解更加透徹，就可以根據(jù)他們發(fā)揮功能的結(jié)構(gòu)基

2、礎(chǔ)有針對性地進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)，基因改造，疫苗研制開發(fā)，甚至人工構(gòu)建蛋白質(zhì)等工作，從而對制藥、醫(yī)療、疾病防治、生物化工等諸多方面產(chǎn)生巨大的推動(dòng)作用。日前用于解析生物大分子空間結(jié)構(gòu)的主要手段是X射線晶體學(xué)技術(shù)和核滋共振波譜學(xué)。X射線晶體學(xué)可給出分子的高分辨結(jié)鉤，核磁共振波譜學(xué)則可測定分子在溶液中的精確構(gòu)像，并可研究構(gòu)像的動(dòng)態(tài)變化。雖然X射線晶體學(xué)和核磁共振波譜學(xué)是解析生物大分子結(jié)構(gòu)的強(qiáng)有力工具，但各有局限性。X射線晶體學(xué)解析的結(jié)構(gòu)常常是分子的基態(tài)結(jié)鉤，而對解析分子的激發(fā)態(tài)和過渡態(tài)卻往往無能為力：生物大分子在體內(nèi)常常發(fā)生相互作用并形成復(fù)合物而發(fā)揮功能，這些復(fù)合物的結(jié)晶化非常困難。核磁共振波譜學(xué)雖可獲得分

3、子在溶液中的結(jié)構(gòu)并可研究結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化，但目前只能用于分子量較小的生物大分子（10000道爾頓），而對分子量大的生物大分子尤其是超分子復(fù)合物卻無能為力。人類對生物體系的研究經(jīng)歷了由個(gè)體到器官，由器官到組織，由組織到細(xì)胞，由細(xì)胞到生物大分子這樣一個(gè)層次由高到低的過程。隨著科學(xué)的發(fā)展，人們對生物體系的研究又轉(zhuǎn)向由低層次到高層次，由簡單體系到復(fù)雜體系。在此過程中，細(xì)胞作為生命的基本單位起著承上啟下的重要作用。多少年來，科學(xué)家的一個(gè)夢想是能觀察到生物大分子在細(xì)胞內(nèi)的行為，幾十年來，人們對大量的生物大分子及其復(fù)合物應(yīng)用電子顯微鏡進(jìn)行研究，發(fā)展出了強(qiáng)有力的電子顯微學(xué)來研究生物大分子結(jié)構(gòu)的方法學(xué)。近年來，由

4、于快速冷凍和低溫冷卻技術(shù)的引進(jìn)，導(dǎo)致了冷凍電子顯微學(xué)技術(shù)的誕生。冷凍電鏡在研究生物大分子結(jié)構(gòu)尤其是超分子體系的結(jié)構(gòu)方面取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，在生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用越來越受到重視，逐漸成為一種被普遍接受的公認(rèn)的研究生物大分子尤其是超分子體系結(jié)構(gòu)的有效研究手段，成為連接生物大分子和細(xì)胞的紐帶和橋梁。2 冷凍電鏡發(fā)展過程及分類2.1 冷凍電鏡發(fā)展過程冷凍電子顯微鏡技術(shù)（cryo-electron microscopy）是在20世紀(jì)70年代提出的，早在20世紀(jì)70年代科學(xué)家們就利用冷凍電鏡研究病毒分子的結(jié)構(gòu)，首次提出了冷凍電鏡技術(shù)的原理、方法以及流程的概念。到了20世紀(jì)90年代，隨著冷凍傳輸裝置、場發(fā)射電

5、子槍以及CDD成像裝置的出現(xiàn)，冷凍電鏡單顆粒技術(shù)出現(xiàn)。21世紀(jì)初，冷凍電鏡技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展，利用三維重構(gòu)技術(shù)獲得了二十面體病毒的三維結(jié)構(gòu)，但此時(shí)冷凍電鏡的分辨率水平依然沒有得到突破，這限制了冷凍電鏡在生物大分子領(lǐng)域的應(yīng)用，雖然冷凍電鏡和X射線晶體學(xué)、核磁共振被稱作結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的三大利器，但不得不承認(rèn)冷凍電鏡是三者當(dāng)中最弱的一種技術(shù)手段，在現(xiàn)在已解析的一千多種膜蛋白結(jié)構(gòu)當(dāng)中，90%以上都采用的是X射線晶體學(xué)方法，核磁共振在小分子量的蛋白結(jié)構(gòu)解析中也發(fā)揮了重要的作用，而冷凍電鏡在蛋白結(jié)構(gòu)解析當(dāng)中所起的作用微乎其微。然而2013年12月5日，美國加州大學(xué)舊金山分校副教授程亦凡與同事David Jul

6、ius兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室合作，采用單電子計(jì)數(shù)探測器，以近原子分辨率（3.4埃），確定了在疼痛和熱知覺中起中心作用的一種膜蛋白TRPV1的結(jié)構(gòu)，這一振奮人心的成果讓研究人員們開始重新審視冷凍電鏡在結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中的所能發(fā)揮的作用。畢竟和X射線晶體學(xué)方法相比，它所需的樣品量很少，也無需生成晶體，這對于一些難結(jié)晶的蛋白質(zhì)的研究帶來了新的希望。蛋白質(zhì)TRPV1結(jié)構(gòu)的確定標(biāo)志著冷凍電鏡正式跨入“原子分辨率”時(shí)代。2.2 冷凍電鏡分類目前我們討論的冷凍電鏡基本上指的都是冷凍透射電子顯微鏡，但是如果我們以使用冷凍技術(shù)的角度定義冷凍電鏡的話，冷凍電鏡主要可以分為冷凍透射電子顯微鏡、冷凍掃描電子顯微鏡、冷凍蝕刻電子顯微

7、鏡。2.2.1 冷凍透射電子顯微鏡冷凍透射電鏡（Cryo-TEM）通常是在普通透射電鏡上加裝樣品冷凍設(shè)備，將樣品冷卻到液氮溫度（77K），用于觀測蛋白、生物切片等對溫度敏感的樣品。通過對樣品的冷凍，可以降低電子束對樣品的損傷，減小樣品的形變，從而得到更加真實(shí)的樣品形貌。一臺(tái)冷凍透射電鏡的價(jià)格在600萬美元左右，價(jià)格極其昂貴，它的優(yōu)點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：第一是加速電壓高，電子能穿透厚樣品；第二是透鏡多，光學(xué)性能好；第三是樣品臺(tái)穩(wěn)定；第四是全自動(dòng)，自動(dòng)換液氮，自動(dòng)換樣品，自動(dòng)維持清潔。 圖2.1 冷凍透射電鏡及冷凍電鏡下高分辨病毒的三維重構(gòu)圖2.2.2 冷凍掃描電子顯微鏡掃描電鏡工作者都面臨著

8、一個(gè)不能回避的事實(shí)，就是所有生命科學(xué)以及許多材料科學(xué)的樣品都含有液體成分。很多動(dòng)植物組織的含水量達(dá)到98%，這是掃描電鏡工作者最難對付的樣品問題。冷凍掃描電鏡（Cryo-SEM）技術(shù)是克服樣品含水問題的一個(gè)快速、可靠和有效的方法。這種技術(shù)還被廣泛地用于觀察一些“困難”樣品，如那些對電子束敏感的具有不穩(wěn)定性的樣品。各種高壓模式如VP、LV和ESEM的出現(xiàn)，已允許掃描電鏡觀察未經(jīng)冷凍和干燥的樣品。但是，冷凍掃描電鏡仍然是防止樣品丟失水分的最有效方法，它能應(yīng)用于任何真空狀態(tài)，包括裝于SEM的Peltier臺(tái)以及向樣品室內(nèi)沖以水汽的裝置。冷凍掃描電鏡還有一些其他優(yōu)點(diǎn)，如具有冷凍斷裂的能力以及可以通過控

9、制樣品升華刻蝕來選擇性地去除表面水分（冰）等。冷凍電鏡基本的觀測流程如下圖2.2所示：圖2.2 低溫掃描電鏡樣品制備及觀測流程2.2.3 冷凍蝕刻電子顯微鏡冷凍蝕刻（Freeze-etching）電鏡技術(shù)是從50年代開始發(fā)展起來的一種將斷裂和復(fù)型相結(jié)合的制備透射電鏡樣品技術(shù)，亦稱冷凍斷裂（Freeze-fracture）或冷凍復(fù)型（Freeze-replica），用于細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域的顯微結(jié)構(gòu)研究。冷凍蝕刻電鏡的優(yōu)點(diǎn)：樣品通過冷凍，可使其微細(xì)結(jié)構(gòu)接近于活體狀態(tài)；樣品經(jīng)冷凍斷裂蝕刻后，能夠觀察到不同劈裂面的微細(xì)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而可研究細(xì)胞內(nèi)的膜性結(jié)構(gòu)及內(nèi)含物結(jié)構(gòu)；冷凍蝕刻的樣品，經(jīng)鉑、碳噴鍍而制備的復(fù)型

10、膜，具有很強(qiáng)的立體感且能耐受電子束轟擊和長期保存。缺點(diǎn)：冷凍也可造成樣品的人為損傷；斷裂面多產(chǎn)生在樣品結(jié)構(gòu)最脆弱的部位，無法有目的地選擇。目前，冷凍蝕刻裝置的型號(hào)很多，但主要分為兩種類型：一種是專用冷凍蝕刻裝置，如EIKO公司生產(chǎn)的FD-2A型、FD-3型，BALZERS公司生產(chǎn)的BAF300型；另一種是真空噴鍍儀的冷凍蝕刻附件，如日立公司生產(chǎn)的HFZ-1型，它與FE-1型加溫蝕刻裝置一起安裝在HUS-5型真空噴鍍儀中使用。以上兩種類型各有優(yōu)缺點(diǎn)，專用裝置優(yōu)點(diǎn)在于操作方便，能連續(xù)制樣，效率高。缺點(diǎn)是價(jià)格貴；附件裝置價(jià)格雖便宜，但不能連續(xù)操作，效率低。利用冷凍蝕刻電鏡技術(shù)觀察到的紅細(xì)胞如圖2.3

11、所示。圖2.3 紅細(xì)胞冷凍電鏡蝕刻圖3 冷凍電鏡原理冷凍電子顯微學(xué)解析生物大分子及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的核心是透射電子顯微鏡成像，其基本過程包括樣品制備、透射電子顯微鏡成像、圖像處理及結(jié)構(gòu)解析等幾個(gè)基本步驟（圖3.1）。在透射電子顯微鏡成像中，電子槍產(chǎn)生的電子在高壓電場中被加速至亞光速并在高真空的顯微鏡內(nèi)部運(yùn)動(dòng)，根據(jù)高速運(yùn)動(dòng)的電子在磁場中發(fā)生偏轉(zhuǎn)的原理，透射電子顯微鏡中的一系列電磁透鏡對電子進(jìn)行匯聚，并對穿透樣品過程中與樣品發(fā)生相互作用的電子進(jìn)行聚焦成像以及放大，最后在記錄介質(zhì)上形成樣品放大幾千倍至幾十萬倍的圖像，利用計(jì)算機(jī)對這些放大的圖像進(jìn)行處理分析即可獲得樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)。圖3.1 冷凍電子顯微學(xué)解析結(jié)

12、構(gòu)基本步驟圖3.2 冷凍電子顯微學(xué)原理示意圖透射電子顯微鏡成像過程中，電子束穿透樣品，將樣品的三維電勢密度分布函數(shù)沿著電子束的傳播方向投影至與傳播方向垂直的二維平面上。1968 年，Aron Klug發(fā)現(xiàn)中心截面定理（圖3.3），提出可以通過三維物體不同角度的二維投影在計(jì)算機(jī)內(nèi)進(jìn)行三維重構(gòu)來解析獲得物體的三維結(jié)構(gòu)。根據(jù)這一原理，利用透射電子顯微鏡獲得生物樣品多個(gè)角度的放大電子顯微圖像，即有可能在計(jì)算機(jī)里重構(gòu)出它的三維空間結(jié)構(gòu)。圖3.3 中心截面定理在冷凍電子顯微學(xué)結(jié)構(gòu)解析的具體實(shí)踐中，依據(jù)不同生物樣品的性質(zhì)及特點(diǎn)，可以采取不同的顯微鏡成像及三維重構(gòu)方法。目前主要使用的幾種冷凍電子顯微學(xué)結(jié)構(gòu)解析

13、方法包括：電子晶體學(xué)、單顆粒重構(gòu)技術(shù)、電子斷層掃描重構(gòu)技術(shù)等，它們分別針對不同的生物大分子復(fù)合體及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。3.1 電子晶體學(xué)利用電子顯微鏡對生物大分子在一維、二維以致三維空間形成的高度有序重復(fù)排列的結(jié)構(gòu)（晶體）成像或者收集衍射圖樣，進(jìn)而解析這些生物大分子的結(jié)構(gòu)，這種方法稱為電子晶體學(xué)。其適合的樣品分子量范圍為10500kD，最高分辨率約1.9。該方法與X射線晶體學(xué)的類似之處在于均需獲得高度均一的生物大分子的周期性排列，不同之處是利用電子顯微鏡除了可以獲得晶體的電子衍射外還可以通過獲得晶體的圖像來進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。3.2 單顆粒技術(shù)對分散分布的生物大分子分別成像，基于分子結(jié)構(gòu)同一性的假設(shè)

14、，對多個(gè)圖像進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并通過對正、加和平均等圖像操作手段提高信噪比，進(jìn)一步確認(rèn)二維圖像之間的空間投影關(guān)系后經(jīng)過三維重構(gòu)獲得生物大分子的三維結(jié)構(gòu)方法（圖3.4）。其適合的樣品分子量范圍為8050MD，最高分辨率約3。利用單顆粒技術(shù)獲得三維重構(gòu)的方法主要包括等價(jià)線方法、隨機(jī)圓錐重構(gòu)法、隨機(jī)初始模型迭代收斂重構(gòu)等方法，其基本目標(biāo)是獲得二維圖像之間正確的空間投影關(guān)系，從而進(jìn)行三維重構(gòu)。圖3.4 單顆粒重構(gòu)技術(shù)原理3.3 電子斷層掃描成像技術(shù)通過在顯微鏡內(nèi)傾轉(zhuǎn)樣品從而收集樣品多角度的電子顯微圖像并對這些電子顯微圖像根據(jù)傾轉(zhuǎn)幾何關(guān)系進(jìn)行重構(gòu)的方法稱為電子斷層掃描成像技術(shù)（圖3.5）。 該方法主要應(yīng)用精

15、品文檔，超值下載于細(xì)胞及亞細(xì)胞器，以及沒有固定結(jié)構(gòu)的生物大分子復(fù)合物（分子量范圍為800kD），最高分辨率約20。圖3.5 電子斷層掃描成像技術(shù)原理我的憂傷，是滲透骨髓里的，即使吃大劑量的詩歌補(bǔ)藥、喝什么樣的心靈雞湯，都已喚不回身體里、生命中的陽光。所以，我的愛，如果你又看到了我的文字，如果這些文字里依然充滿著泣血，濕濕顫抖的哭泣，請你原諒我。因?yàn)椋憔褪俏?，只有在你面前，我可以卸掉偽裝堅(jiān)強(qiáng)的面具。撲在你的懷里，大聲的哭泣，如果沒有了你，心就會(huì)沒有熱度，變成僵硬的死掉。我也早已沒有了生命剛從死亡里，我又回到了現(xiàn)實(shí)，窗外飄起雪花。我又開始呆呆地望著雪，傻傻地跟電腦的屏幕頭像的你，談一場生死相依中

16、，你我牽手的虛擬愛情。多么可悲，現(xiàn)實(shí)終歸現(xiàn)實(shí)。我又開始行騙自己我突然害怕走進(jìn)墳?zāi)?，突然恐懼死亡，因?yàn)樗劳鰜砼R。連這點(diǎn)可憐的虛擬愛情，也將是煙消云散。絕望的時(shí)候會(huì)想，泣血和流淚如果不讓你看見多好，可我還是以文字方式，讓你看見。因?yàn)槟阋炎兂闪宋?，我的影子。如果有一天，我永遠(yuǎn)的無音信，親愛的，你就當(dāng)我這世界從來沒有來過。來過的，只有我為你用一滴滴淚，一滴滴血，輕輕研成的心墨，而寫下的詩歌。忽然很想你，想一場桃花雨我的憂傷，是滲透骨髓里的，即使吃大劑量的詩歌補(bǔ)藥、喝什么樣的心靈雞湯，都已喚不回身體里、生命中的陽光。所以，我的愛，如果你又看到了我的文字，如果這些文字里依然充滿著泣血，濕濕顫抖的哭泣，請你原諒我。因?yàn)?，你就是我，只有在你面前，我可以卸掉偽裝堅(jiān)強(qiáng)的面具。撲在你的懷里，大聲的哭泣，如果沒有了你，心就會(huì)沒有熱度，變成僵硬的死掉。我也早已沒有了生命剛從死亡