1、4人的因素人是造就澄明度的首要因素,在生產(chǎn)工藝基本成熟,并滿足規(guī)定的質(zhì)量要求的情況下,操作者造成注射液澄明度不理想主要有以下幾個(gè)因素:4.1員工操作技能各有差異,部分員工處理不了較為復(fù)雜的機(jī)械故障及質(zhì)量問(wèn)題。4.2員工操作不熟練,設(shè)備及工具安裝使用不當(dāng),造成不正常的機(jī)械磨擦、碰撞,人為地導(dǎo)致異物引入。4.3未認(rèn)真按規(guī)定著裝、頭皮露出、工作服不潔造綜述成污染。4.4未嚴(yán)格按工藝規(guī)定進(jìn)行操作,造成容器處理不清潔,藥液過(guò)濾不澄明引入異物。4.5員工情緒、健康等客觀因素影響員工的工作技能的充分發(fā)揮,導(dǎo)致澄明度不良品增加。我們只要依據(jù)GMP規(guī)定,嚴(yán)格按SOP操作,把凡能影響注射液澄明度的各環(huán)節(jié)嚴(yán)格控制起

2、來(lái),定能確保藥品質(zhì)量。(200l一0631收稿高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離及中藥質(zhì)控中的應(yīng)用第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院(上海200433黃寶康秦路平鄭漢臣宓鶴鳴摘要本文介紹了高速逆流色譜技術(shù)的工作原理、特點(diǎn)以及近幾年在中藥分析尤其是植物藥有效成分分離純化方面的應(yīng)用情況,并對(duì)高速逆流色譜技術(shù)在中藥分析中的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。關(guān)鍵詞高速逆流色譜天然產(chǎn)物中藥質(zhì)控高速逆流色譜(Hi咖一speed Countercurrent Chromatography,簡(jiǎn)稱Hsccc技術(shù)是一種較新型的液一液分配技術(shù),它不用任何固體載體或支撐體,于1982年由Yiochiro1w博士首創(chuàng)。其原理是基于組分在旋轉(zhuǎn)螺旋管內(nèi)的相

3、對(duì)移動(dòng)而互不混溶的兩相溶劑間分布不同而獲得分離。從原理上講與液液分配色譜完全相同,但所用的技術(shù)不同,采用一根100多米長(zhǎng)的空心柱,實(shí)現(xiàn)無(wú)載體快速高教分離,可用于分析各類化合物。到目前為止,此項(xiàng)技術(shù)已用于生物化學(xué)、生物工程、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、天然產(chǎn)物化學(xué)、有機(jī)合成、化工、環(huán)境、農(nóng)業(yè)、食品、材料等領(lǐng)域。美國(guó)、日本、中國(guó)、俄羅斯、法國(guó)、英國(guó)、瑞士等國(guó)都開展了此項(xiàng)研究。美國(guó)FDA及世界衛(wèi)生組織(WHO都引用此項(xiàng)技術(shù)作為抗生素成分的分離檢定,80年代后期各國(guó)學(xué)者迅速認(rèn)識(shí)到該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用和開發(fā)價(jià)值,并被廣泛地應(yīng)用于天然藥物成分的分離制備和中藥的分析鑒定中。1HSCCC的工作原理及特點(diǎn)1.1ItSCCC的工作原理

4、IfSCCC同逆流色譜技術(shù)一樣,也是基于液液分配原理。當(dāng)儀器工作時(shí),互不相溶的兩相溶劑在繞成線圈的聚四氟乙烯管內(nèi)具有單向性流體動(dòng)力平衡性質(zhì).溶劑在聚四氟乙烯管內(nèi)作高速行星運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí),如用其中一相溶劑作固定相,則恒流泵可以輸送另一相溶劑載著樣品穿過(guò)固定相。中藥材第24卷第10期2001年10月兩相溶劑在螺旋管中實(shí)現(xiàn)高效的接觸、混合、分配和傳遞。由于樣品中各組分在兩相中的分配能力不同,導(dǎo)致在聚四氟乙烯管中移動(dòng)的速度也不同,因而能使樣品巾各組分得到分離。Ito將所用的溶劑系統(tǒng)分為三類:親水性系統(tǒng),由極性小的非水相與水相組成,兩相極性相差很大;親油性系統(tǒng),由高極性的非水相與水相組成,兩相極性相差不大;還有

5、一類處于兩者之間,為中間系統(tǒng)。對(duì)于不同的組分可咀采用不同的溶劑系統(tǒng),控制不同的條件加以分離分析。1.2HSCCC的優(yōu)點(diǎn)HSCCC主要具有以F幾個(gè)方面的優(yōu)點(diǎn)。12.3回收率高。由于該色譜技術(shù)沒(méi)有固定載體,不存在吸附和降解,理論上樣品的回收率可達(dá)100%。在實(shí)驗(yàn)中只要調(diào)整好分離條件,一般都有很757高的回收率。根據(jù)以上特點(diǎn),Hsccc技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)非常適合于中藥成分的分離和分析。目前高速逆流色譜儀已成功地開發(fā)出分析型和制備型兩大系列,制備或半制備HSCCC的特點(diǎn)是高流速、高濃度,小但適用于非極性化合物的分離,也適用于極性化合物的分離。對(duì)檢測(cè)器的靈繁度要求不高,常配以各種波長(zhǎng)的紫外吸收(UV檢測(cè)器。在制

6、備分離方面,可用于中藥租提物中各組分的分離,也可進(jìn)一步精制,甚至市接從粗提物一步純化到純品,米制備中曲化學(xué)成分標(biāo)準(zhǔn)品HSCCC還可川于定量分析。進(jìn)樣量可大可小。分析型IISCCC的分離度、重現(xiàn)性與HPLC相似,但儀器價(jià)格低廉,性能可靠,分析成奉低,易十操作,是一種適用丁中藥質(zhì)控的現(xiàn)代化儀器。與分析型tfSCCC連接的柃測(cè)器有:紫外檢測(cè)器(UV或RAI、博立葉變換紅外檢測(cè)器(FTIR、質(zhì)譜(MS、蒸發(fā)激光散射檢測(cè)器(ELsAl等。2HSCCC技術(shù)在天然藥物活性成分分離中的應(yīng)用在中藥的分離分析巾,HSCCC已川十各類化學(xué)成分如,物堿、黃酮類、萜類、木脂素、香可素類成分的分離純化,近幾年來(lái)研究較多的

7、主要有以下一些滅然藥物。23粉防己S“phania tetrandra為防己科干金藤屬植物,豐要舍生物堿類。用正已烷一乙酸乙酯一甲醇一水(3:7:5:5為溶劑系統(tǒng),以1800r/rain的轉(zhuǎn)速, 70min內(nèi)從粉防已1:燥根提取物中分離r粉防己堿(tetrandfine、去甲粉防己堿(fangchinoline和輪環(huán)藤酚堿(cyclml01ine。24黃連Copti chinensis為毛茛科植物.主要含小檗堿等乍物堿。利川制備型tlSCCC從黃連根生物堿粗提物中分離純化得到巴-亭(pahnatine、小檗堿(bed*erine、喪小檗堿(epiberbefine及酋連堿(coptisinel

8、。25虎杖Polygoman cuspidatum為蓼科蓼屬植物.以根、根狀莖、莖、葉人藥,含葸醌類化臺(tái)物等成分。分別用氯仿一q1醇一水(4:3:2、乙酸乙酯一乙醇一水(10:l:10為溶劑系統(tǒng),從虎杖根的己酸乙酯提取物及水提物中分得白藜蘆醇(resveratr01、i杉新苷(口iceid,得率分別為218%、1.07%(以I一藥材計(jì),化合物經(jīng)MS與1H NMR鑒定”J。2.6葛Pueraria lo&m為豆科葛屬植物,禽黃酮類化合物。用乙酸乙酯一正J醇一水(2:1:3為溶劑系統(tǒng),從;0n根粗提物中經(jīng)HSCCC步分離得到包括葛根素(puerarin在內(nèi)的七個(gè)昴黃酮類化合物l。中藥材第2

9、4卷第10期2001年10月minl。2.8牛膝Achyrarahes bidemata為莧科牛膝屬植物,多糖類為其活性成分之一。以12.5%聚乙二醇(PEG1000與16%磷酸鉀緩沖液紺成的水性二相系統(tǒng),上層作為流動(dòng)相,下層作為固定相,在交叉同步線圈行星離心式高速逆流色譜儀上,成功地分離出了多糖部分和蛋白多糖部分,實(shí)現(xiàn)了牛膝多糖的分離和純化。29寬葉羌活Notopterygiumforbessi為傘形科背翅芹屬植物,又稱大頭羌,以根狀莖和根入藥。具有解表,祛風(fēng)濕,止痛的功效。以石油醚一乙酸乙酯一甲醇一水(比例從5:5:4.8:5生5:5:5:4為溶劑系統(tǒng).采用HSCCC從中分離得到notop

10、terol、isoimpemtofin,純度在98%以上L9J。2.10紅豆杉chinend.s為紅睜杉科植物,含抗腫瘤活性成分紫杉醇。其粗提物采用正己烷一乙酸乙酯一乙醇.水(2:5:2:5及丁F己烷一氯仿一甲醇一水(5 :25:34:20為溶劑系統(tǒng),分離純化得到10-脫乙酰漿果紫杉素(10.deacetylbaccatin,純度在98%以卜【lo J。此外.分別用止己烷一乙酸乙酯一乙醇一水(6:3:2:5和正己烷一乙酸乙酯一甲醇一水(1:1:1:1為溶劑系統(tǒng),以上相干1:為固定相,下相為流動(dòng)相,從紅豆杉及云南紅豆杉Taxus vunnnnm如的粗提物中分離純化了三個(gè)結(jié)構(gòu)相似的紫杉烷類萜化合物

11、質(zhì)紫杉醇(tax01、Ceohalonumnine、漿果紫杉素(baccatin。姒石油醚(bp4065一乙酸乙酯一甲醇.水(50:70:80:65為兩相體系,從紫杉醇的混合物中分離得到r純的紫杉醇和Cephalomannine。211大黃Rhettm oJfi,imde為蓼科大黃屬植物,根狀莖及根中含蒽醌類化合物約3%,以氯仿一甲醇一水(6:3:2為溶劑系統(tǒng),采用HSCCC以1800r/rain的轉(zhuǎn)速在15min內(nèi)從太黃根葦中分離出大黃素甲醚(ohyscion、蘆薈大黃素(aloe-emodin、大黃酸(rhein、大黃酚(chrysophan01和大黃素(e|rvodin;用丁F己烷一乙酸

12、乙酯一甲醇.水(9:1:5:5梯度洗脫,在1800r/min轉(zhuǎn)速下,70min內(nèi)從掌葉大黃Rhe/j p“一咖的根摹中也分離了大黃素甲醚、蘆薈大黃酸、人黃酸、大黃酚和大黃素,純度在98%以上l“J。2.12鹽生肉蓯蓉C曲細(xì)M幢sals為列當(dāng)科植物,具有補(bǔ)腎益精的功效。含有微量生物堿及葡萄糖甙類÷以乙酸乙酯一正丁醇一乙醇一水(4:0.6:0.6:5,v/ v為溶劑系統(tǒng),采用HSCCC技術(shù)從鹽生肉蓯蓉提取物巾分離得到ohenylethanoid glycosides(Phi、acteoside、2'-acetylacteoside,它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)1tt NMR, 13C NMR

13、和MS的鑒定證實(shí),純度經(jīng)HPLC鑒定在中藥材第24卷第10期2001年10月98%以上L“J,、2.13山萊萸Comus研記蒯婦為山桀萸科【I茱萸屬植物,以除去種子的糶實(shí)入藥,具有補(bǔ)益肝腎,澀精止汗的功效。以乙酸乙酯.正丁醇一水(5:l,8:6及乙酸乙酯一乙醇一水(5:0.5:6,采用HSCCC技術(shù)從l g山茱萸果實(shí)的正丁醇提取物中分離得到60畔沒(méi)食子酸(gallic acid,純度為97%113/。2.14積雪草Centella a.iatica為傘形科植物,以干燥全草人藥,具有清熱解毒,消腫利濕之功效。主要含多種“一香樹脂醇型的t萜成分。以氯仿一甲醇.異丁醇一水(7:6:3:1為溶劑系統(tǒng),

14、從積雪草的抽提物中分離純化得到2個(gè)結(jié)構(gòu)非常相似的皂角苷,1個(gè)是積雪草苷(z.sialic*ide,1個(gè)是羥基積雪草甙(madeeassc】side,它們僅在同支鏈E有差別,前者是H。后者是OH。2.15山楂Crataegua pirvutti為薔薇科山楂屬./植物,果實(shí)、根、葉均叮人藥。從IIJ楂葉粗提物中分離金絲桃苷(hyperlcin、槲皮素(quoteetin、蘆J。(turin、牡荊素(vitexin、異牡荊素(ivitexin;另外以氯仿一f】醇一水(33:40:27體系,利用梯度洗脫技術(shù),700r/min轉(zhuǎn)速,70min內(nèi)從山楂黃酮粗提物中分離出槲皮素、四羥基黃酮和槲皮黃酮。2.1

15、6唐古特山莨菪Almmduz luridt“為茄科植物,又稱塞莨菪,豐要含生物堿類,有解疼【f痛的功效。用氯仿一磷酸鹽(0.07mol/L、PH6.4(1:1為溶劑系統(tǒng),從唐特UI莨菪粗物提中分離出rlll莨菪堿(anisodamine、樟柳堿(anisodine等4個(gè)生物堿。217葡萄Vitis virdfisra為葡萄科植物,根、果實(shí)、葉均aT供藥用。果實(shí)多作果品,或用于釀葡萄酒,或制成葡萄于。葡萄皮中含有各種花色素的單葡萄糖營(yíng)或雙葡萄糖苷,上要是紅色素,常常用以衡量葡萄酒的質(zhì)量。利用HSCCC技術(shù),采用合適的溶劑系統(tǒng),從葡萄皮及葡萄酒中分離出了各種色素,包括malvidin一3一gluc

16、oside(vitisin A、acetylvitisin A、rPonidin一3,5-diglucosid婚、anth:lcv卸ins等o”J。2.侶茶Camellia siner蕊為山茶科植物,根、果實(shí)、葉可供藥用,嫩葉采摘后可加工成綠榮或±I.茶,含嘌呤類生物堿及多酚類成分等。秉H1HSCCC技術(shù)以適當(dāng)?shù)娜軇┫到y(tǒng)從茶葉中分離純化了兒茶酚(catechins、黃酮醇葡萄糖苷類(flavonol dvcosid日s、strictinin、proanthocyanidins,并經(jīng)1H NMR和HPLCES|一MS鑒定【l“,此外還從紅茶中分離了茶黃素(theqavine、表茶黃酸(

17、e面theaflavic acids、thearubif161;lIlso2.19其它天然產(chǎn)物HSCCC技術(shù)除r用于上述759表近年來(lái)用I-ISCCC分離純化活性成分的其余天然藥物(億伯植物名稱化合物溶劑系統(tǒng)Patpa/ant/u“_rhl岫酲mpIlt-叩rymm glycosides乙醇一乙酸乙酯一正d烷一水(4:10:4:10曲M,m usambarens/s10-hydroxy-Nb-methyleorynanthoel正丁醇一氯化鈉(0.I nml/L(1:1島如,dk批和而lutein止己烷一乙醇一水(4:3:1Atrem/sht da/aame Isofraxdin和tax口xe

18、rylacetate氯仿一甲醇一水(2:1:1H即。k'virginian neehgnans正己烷一乙腈一乙酸乙酯一水(87:5:iE,d/da/u.m/珊/fl,oram(柳葉菜屬quercittin、myricitnn、isomyricitrin、gallic acid氯仿一甲醇一水(1:4:25:25島rd,婦/co/a(藤黃屬biflavanoids正已烷一己酸己酯一甲醇一水(I:4:25:25 Coch/ospermun如眥咄姍(卷胚屬cochloxanthin、dihydroeoehloxanthin四氯化碳一甲醇一水(5:4:1Hdan/a徹瑚眥“婦n xanthone

19、s、secoiridoid glueosides氯仿一甲醇一水(9:12:8Abrosfrut/ru/ost“triterpeneglyeoside氯仿一甲醇一水(7:13:8Sesarr,tamdatum18,19-secoumane clisacchafide氯仿一甲醇一2_戊醇一水(5:6:1:4D:l咖M-孵也m ge出waIlIn、apigenin、luteolin氯仿一甲醇一水(4:3:2AJ"temu/aArlemisinin、epideoxyarteannuin異辛烷一甲醇一水(10:7:3日叫k砌鯽婦帆eleutherc6ide氯仿.甲醇一水(8:5:3白伍刪sca

20、bra gentiopicrtKide、gnetianine氯仿一甲醇一水(9:12:81,'inca m/nor vincanune、vincathicine正己烷一乙醇一水(6:5:5山訕?gòu)Dtessd/ata lyeops咖、acetyllycopsannne氯仿一02M磷酸鉀緩沖液(1:1山抽q出cymosa benzyliscquinoline alkaloids四氯化碳一甲醇一水(20:202Parosdinum硎甲肼l falcarind、falc.afirYliel棚甲帆e、crupanone正己烷一乙腈一叔丁基甲基醚(10:10:13HSCCC技術(shù)在中藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用

21、質(zhì)譜、核磁共振譜等給出結(jié)構(gòu)信息而予以鑒定結(jié)構(gòu), 3.1HSCCC與其它色譜技術(shù)聯(lián)用進(jìn)行中藥的定從fii充分發(fā)揮HSCCC高速.高效的優(yōu)點(diǎn)與其它色譜性、定量分析前面已提到,HSCCC可以分為制備靈敏度高的優(yōu)點(diǎn),更好地用于中藥的分析鑒定。型與分析型二類,分析型HSCCC與各種檢測(cè)器聯(lián)用3.2利用HSCCC建立中藥指紋圖譜中藥現(xiàn)代可以進(jìn)行分析檢測(cè),或者將分析型與制備型HSCCC化的一個(gè)重要內(nèi)容,就是要做到中藥的質(zhì)量可控,對(duì)聯(lián)用。還可以將HSCCC技術(shù)與其它色譜或光譜技于中藥或者中藥復(fù)方里每個(gè)成分及其之間的相互作術(shù)聯(lián)用,如與高教液相色譜(HPLC、質(zhì)譜(MS等聯(lián)用機(jī)理不是十分清楚的情況下,巾藥材及中成

22、藥指用,或者足與NMR聯(lián)用,利用NMR來(lái)鑒定結(jié)構(gòu)。紋圖譜質(zhì)控技術(shù)對(duì)于保證中藥的質(zhì)量,促進(jìn)中藥的1994年IIo博士又發(fā)明了PH-Zone-YefiningCCC,使現(xiàn)代化有著f分重要的作用,已成為牽動(dòng)中藥讓全HSCCC進(jìn)樣量大大增加,能方便地分離z量級(jí)的樣面進(jìn)步的關(guān)鍵技術(shù),它對(duì)保證中藥功效,提高中藥工品,更有利于天然藥物分離制備Ll。對(duì)于含有較多業(yè)整體水平,帶動(dòng)中藥產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代化,推進(jìn)中藥走向世復(fù)雜化合物的中藥材或中藥,可以經(jīng)HSCCC分離后界,具有非常重要的意義。HSCCC技術(shù)具有很好的接各式檢測(cè)器直接進(jìn)行定性或定量測(cè)定,對(duì)于一些分辨率,且重現(xiàn)性好。中藥提取物經(jīng)HSCCC所得到結(jié)構(gòu)復(fù)雜的化合物則

23、因?yàn)槠浞蛛x量較大,可以經(jīng)如的逆流色譜圖都有23個(gè)以上的組分峰.不但可以760中藥材第24卷第10期21301年10月用于巾藥有效成分的定性或半定量分析,若能進(jìn)一ch瑚瑚±o卵phy.J Chromatngr,2001,915(1-2:253步深入研究,整理出菜一中藥材的特征峰和指紋譜,8巢志茂,等.水性-相系統(tǒng)與逆流色譜對(duì)牛膝多糖的純制定標(biāo)準(zhǔn)圖譜,可以用于中藥的質(zhì)量控制和測(cè)定?；芯?中國(guó)藥學(xué)雜志,1999,34(7:444在高速逆流色譜指紋圖譜研究方面,目前已對(duì)大黃、9Yang9,“a1.P。er,arati”sol血0n and pL商carl60n of一沙棘、何首烏等一些中藥

24、進(jìn)行了研究(1。0pt?！盿ndisoimperat”“幻“唧qg”。/鼬“Boi8.k:i (Chimse traditional medicina herbbylig卜speed counter-cur一445t毫升;不但適用于非極性化合物,而且適用于極性化11Yang-F,eI a1.Preparative isolation and血afion d hy一合物的分離;它可用于天然產(chǎn)物粗提物的去除雜質(zhì),dn疆yaI't“唧ines from Rheum夠曲10k Bad by high 也可用于最后產(chǎn)物的精制,甚至直接從粗提物一步8peed countereunent山nm枷卵p

25、Iy using pH_rmdId址ed 純化到達(dá)純品;當(dāng)加快儀器轉(zhuǎn)速至1800r/min.其分stepwise elufion,J Chnmtatot,1999,858(1:103離速度可以與HPIJc相比,具有特征峰的逆流色潛12Lei L,d a1.Preparalaveisol枷on and purification0f8。teoside 圖和色譜指紋圖譜,對(duì)于中藥材、中藥飲片的質(zhì)量控and2。8掣8。弩deh盤也。“一(6“Me776制都具有重要意義。因此HSCCC技術(shù)對(duì)于解決巾=:奇翥l囂言”1”“。橢。胛ph”。成藥及中藥材生產(chǎn)中存在的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參差不齊現(xiàn)13Ti柚uc.。t且1.

26、se岫帥of酬li。“d。刪面試刪蠡象,為中藥生產(chǎn)現(xiàn)代化提供一種新的有效成分分離Sieb et zuc。by蚺。p捌。mt。cu。nt。hromatngraphv.技術(shù),并有希望成為中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究以及中藥J Chrommogr,2000,886(1-2:309材的質(zhì)量控制、分析的一種新方法。14I心enhardt,et a1.Preparalave ksolation of anthocvanim byti.Ek目od countemurrent ch朋嘲幻Dhv and a卵hcatian0f 參考文獻(xiàn)the。二0r act。“tv。0f忙pt t0。甜w1二1j A州c品0d clle

27、m,1Y Ito,et a1.nigh-s刪pmpadve cotmterctm'edat chnmm“g一2000,48(12:5812吶with a coil l山anet eenmfuge J chromatogr,1982,244:15Dngenhardt A,et al PrepamUve se畔011of polyphetlols 247from tea by high-speed eotmtercurrent chromatography J A2余佳紅,等.高速逆流色譜分離制備白果內(nèi)酯中國(guó)新鰣cFoodOlem,2000,48(8:3425藥雜志,2IX0,9(6:364161e彈rdaardt A,el al Isolation of blacktea P_口僻吣using hi一3Tmn G.el al Separation of umshinones from s口血.出/orth&a l*speecl countercurrent chmrr“哩吶and studies”pmpBu憚by Ili咖甲州cmtnter-current c110