1、應(yīng)用發(fā)酵技術(shù)讀書報(bào)告劉云琳（2014141494027）一 目錄1發(fā)酵:從過去的一門藝術(shù),對(duì)未來的一種技能2發(fā)酵設(shè)備選擇:實(shí)驗(yàn)室規(guī)模生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)注意事項(xiàng)3研究發(fā)酵實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的膜蛋白生產(chǎn)4發(fā)酵罐操作模式5生物過程介質(zhì)的設(shè)計(jì)與制備6發(fā)酵系統(tǒng)中生物活性的動(dòng)力學(xué)建模7發(fā)酵系統(tǒng)生物活性動(dòng)力學(xué)建模8發(fā)酵過程的規(guī)模化和規(guī)?；?即時(shí)原位內(nèi)發(fā)酵測(cè)量10生物反應(yīng)器SCADA系統(tǒng)11發(fā)酵過程中的基本統(tǒng)計(jì)分析12發(fā)酵罐的研究與發(fā)展二 貢獻(xiàn)者名單鳴謝：感謝所有參與生產(chǎn)實(shí)用發(fā)酵技術(shù)的人。三 前言發(fā)酵是一種非常古老的習(xí)俗，可以追溯到幾千年前。最近，發(fā)酵已被開發(fā)用于制造從化學(xué)簡(jiǎn)單的原料，如乙醇，到高達(dá)復(fù)雜的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的范圍

2、廣泛的材料制造。這一系列產(chǎn)品和工藝的出現(xiàn)，已經(jīng)徹底改變了臨床醫(yī)學(xué)的實(shí)踐和許多基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，也大大增加了對(duì)發(fā)酵領(lǐng)域的技術(shù)人員的需求。如今的關(guān)鍵問題是我們?nèi)绾尾拍軐⑦@些技能傳遞給需要它們的人。本書從發(fā)酵發(fā)展的簡(jiǎn)要背景出發(fā)，以選擇實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵罐的標(biāo)準(zhǔn)，以及關(guān)于為膜蛋白表達(dá)裝置實(shí)驗(yàn)室提供更專業(yè)化的需求為目的設(shè)置小型發(fā)酵實(shí)驗(yàn)室或套件。這本書從預(yù)發(fā)酵階段（設(shè)備選擇、實(shí)驗(yàn)室建立、培養(yǎng)技術(shù)、接種裝備）來描述我們?nèi)绾卧O(shè)計(jì)，控制規(guī)模，并監(jiān)控發(fā)酵。第一章 發(fā)酵:一種來自過去的藝術(shù)，一種未來的技能布萊恩.麥克內(nèi)爾11“發(fā)酵”的含義（1）發(fā)酵的起源在古代歷史中遺失了，他的開始甚至可能追溯到史前時(shí)期。古埃及人和蘇美爾人的知

3、識(shí)技術(shù)用于谷物淀粉轉(zhuǎn)化為酒精。對(duì)于大多數(shù)歷史，這些過程或基于果汁轉(zhuǎn)化的類似過程代表了對(duì)“發(fā)酵”一詞最普遍接受的解釋。（2）狹義的發(fā)酵：現(xiàn)在的發(fā)酵指的是液體培養(yǎng)基中的微生物,植物或動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)有用的產(chǎn)品，或研究這些細(xì)胞生理的過程。（3）現(xiàn)代發(fā)酵：現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)主要是20世紀(jì)的產(chǎn)物，它的主要目標(biāo)是生產(chǎn)一系列高價(jià)值的產(chǎn)品，而不是簡(jiǎn)單的乙醇。1.2.現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)（1）近年來，發(fā)酵技術(shù)在使用上有了很大的發(fā)展。當(dāng)今的發(fā)酵工業(yè)處于一種不斷變化的狀態(tài)，其地位、產(chǎn)品范圍和過程的規(guī)模都發(fā)生了迅速的變化。這在很大程度上受到宏觀經(jīng)濟(jì)因素的影響，隨著人類基因組的破譯，靶點(diǎn)治療的進(jìn)步等發(fā)酵表達(dá)系統(tǒng)的建設(shè)有了重大進(jìn)展。利用發(fā)

4、酵技術(shù)和知識(shí)推進(jìn)藥物/受體相互作用的研究是必要的。發(fā)酵技術(shù)為研究膜蛋白的功能，和對(duì)抗疾病，包括癌癥、退行性疾病如阿爾茨海默氏癥，哮喘等做出了杰出貢獻(xiàn)。新發(fā)酵衍生的藥物，包括生物藥物，具有提高免疫特異性治療并減少副作用的前景。這是臨床醫(yī)學(xué)中的一個(gè)革命時(shí)期，因?yàn)檫@些通過發(fā)酵途徑制造的新藥物開始進(jìn)入市場(chǎng)。（2）“新”發(fā)酵產(chǎn)品：“新”發(fā)酵產(chǎn)品,治療性蛋白質(zhì),抗體(簡(jiǎn)單和共軛)比以前的產(chǎn)品更復(fù)雜和昂貴,但是,這需要比以前更加注重發(fā)酵步驟。基本上，這些產(chǎn)品的“質(zhì)量”（效力，療效，穩(wěn)定性和免疫原性）是由上游或發(fā)酵階段決定，因此比以前更需要清晰的理解那個(gè)階段的過程，如何最好地監(jiān)控，并以可重復(fù)的方式進(jìn)行操作。（

5、3）發(fā)展：隨著干細(xì)胞的培養(yǎng)和復(fù)制技術(shù)的不斷發(fā)展，個(gè)性化醫(yī)療的時(shí)代可能即將到來。這將使科學(xué)家和工程師在未來幾年更了解文化技術(shù)的需要。因此，在不久的將來對(duì)發(fā)酵技能的需求可能會(huì)增加。第二章 發(fā)酵設(shè)備選擇:實(shí)驗(yàn)室規(guī)模生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)注意事項(xiàng)2.1簡(jiǎn)介本章將介紹小型生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)注意事項(xiàng),并舉例說明如何小規(guī)?！巴ㄓ谩睂?shí)驗(yàn)室選擇發(fā)酵設(shè)備常用于幾種發(fā)酵過程的發(fā)酵設(shè)備。1.在第二次世界大戰(zhàn)期間，人們因?yàn)榇罅啃枨罂股囟_始研究如何提高微生物的目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。本章中的“小規(guī)?！倍x為1L-20L。2.生物反應(yīng)器本卷的生物反應(yīng)器可用于一些目的，規(guī)模上/下研究，克隆選擇，培養(yǎng)基的發(fā)展，過程的發(fā)展，并在某些情況下生產(chǎn)

6、。（1）生物反應(yīng)器應(yīng)該具備的基本條件：長(zhǎng)時(shí)間無菌生產(chǎn);滿足當(dāng)?shù)叵嚓P(guān)法規(guī);監(jiān)測(cè)和控制以下參數(shù):pH值的酸/堿的變化添加或二氧化碳的變化;混合培養(yǎng)，使微生物保持懸浮狀態(tài)，維持一定的DO2值；所有這些都應(yīng)該在不損害生物體的前提下實(shí)現(xiàn)；;能調(diào)節(jié)溫度;無菌采樣功能。（2）生物反應(yīng)器應(yīng)考慮的其他問題備用頂板的安裝要保證能后期修理生物反應(yīng)器放大縮小規(guī)模時(shí)要按照一定比例，以小型生物反應(yīng)器為模擬生物反應(yīng)器的實(shí)用性，從完成一次運(yùn)行到另一次運(yùn)行的轉(zhuǎn)換時(shí)間手動(dòng)處理問題，特別是在10L處加標(biāo)尺時(shí)可能需要兩個(gè)人進(jìn)行安全手動(dòng)處理。2.2生物反應(yīng)器的類型本章重點(diǎn)是迄今為止最常用的生物反應(yīng)器類型STR（攪拌釜反應(yīng)器）。 1結(jié)構(gòu)

7、：它主要由縱橫比為約3:1的容器和通常通過頭板驅(qū)動(dòng)的混合系統(tǒng)組成，雖然一些蒸汽混合驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)通過底板驅(qū)動(dòng)。頭板將具有允許添加探針，試劑和氣體以及去除樣品的端口。頭板上有探針添加處、試劑和氣體以及樣品脫除的端口。2.其他可替代STR的生物反應(yīng)器：（1）塔式發(fā)酵罐：特點(diǎn)是高度與直徑比高達(dá)6：1至15：1。塔式發(fā)酵罐通常通過位于發(fā)酵罐底部附近的一個(gè)簡(jiǎn)單的分布器噴射氣體來充氣。塔式發(fā)酵罐可以通過使用擋板產(chǎn)生沉淀區(qū)域來連續(xù)地操作，使產(chǎn)品可以被取出并且細(xì)胞可以返回到容器主體。（2）氣升式發(fā)酵罐：攪拌系統(tǒng)（電機(jī)、傳動(dòng)軸、葉輪）由一個(gè)固定的燃?xì)庖牍芰魅〈?。容器?nèi)的流動(dòng)：空氣上升，然后含有細(xì)胞的介質(zhì)下降，以確保

8、徹底混合。氣升式發(fā)酵罐可以通過擋板提高混合程度。這些容器提的混合非常溫和，因此特別適合于對(duì)剪切力太敏感而不能被葉輪混合的細(xì)胞。（3）灌注灌注式生物反應(yīng)器：中空纖維室用于培養(yǎng)貼壁依賴型細(xì)胞。該系統(tǒng)由一束纖維組成，細(xì)胞在墨盒內(nèi)的額外毛細(xì)管空間（ECS）中生長(zhǎng)。媒介和氣體通過毛細(xì)管進(jìn)入ECS。中空纖維的替代方案是在攪拌釜反應(yīng)器中使用微載體。微載體通常是色譜級(jí)DEAE sepadex珠子。珠子帶正電荷,所以吸引帶負(fù)電荷的動(dòng)物細(xì)胞,并提供一個(gè)細(xì)胞可以生長(zhǎng)的表面。小規(guī)模的攪拌釜生物反應(yīng)器可以分為以下三個(gè)基本組。2.2.1高壓滅菌系統(tǒng)高壓滅菌系統(tǒng)也許是最常見的系統(tǒng),或許是由于他們相對(duì)簡(jiǎn)單、低成本的實(shí)用要求。

9、所有這一切由本地控制器控制，該控制器可連接到SCADA（監(jiān)控和數(shù)據(jù)采集包），該軟件包將記錄系統(tǒng)生成的所有數(shù)據(jù)并控制系統(tǒng)。SCADA的使用能提供比僅由本地控制器提供的更高級(jí)別的功能，這一點(diǎn)將在第10章中更詳細(xì)地討論。圖2.1(a)代表一個(gè)典型的小規(guī)模高壓滅菌系統(tǒng)。該容器由玻璃制成，帶有不銹鋼頭板，并由一個(gè)驅(qū)動(dòng)面板和一個(gè)本地控制器連接到一個(gè)SCADA（監(jiān)控和數(shù)據(jù)采集包）服務(wù)。圖2.1(a) 典型的小型臺(tái)架式玻璃高壓滅菌生物反應(yīng)器2.2.2不銹鋼蒸汽系統(tǒng)圖2.1（b）顯示了與圖2.1（a）中體積相同的容器，但是由不銹鋼制造。它與玻璃系統(tǒng)的關(guān)鍵區(qū)別在于，鋼制容器具有通過管道輸送的蒸汽供應(yīng)器，從而在現(xiàn)場(chǎng)

10、進(jìn)行滅菌，因此不再需要大型現(xiàn)場(chǎng)高壓釜。（1）玻璃系統(tǒng)相比： 主要優(yōu)點(diǎn)是能夠承受超壓，使用過壓（高于大氣壓的系統(tǒng)運(yùn)行）來提高氧氣傳輸速率。而我們因?yàn)榘踩?，不能將超壓施加到玻璃容器。但一些運(yùn)營(yíng)商更喜歡高壓滅菌生物反應(yīng)器系統(tǒng),因?yàn)樗奈廴靖?。?）蒸汽供應(yīng)：蒸汽必須是無顆粒和無油的，因?yàn)檫@兩者之一可以通過在容器中留下殘余物而影響產(chǎn)品，或通過阻塞閥來損壞系統(tǒng)。蒸汽也需要干燥，因?yàn)樗畷?huì)冷凝導(dǎo)致一個(gè)冷點(diǎn)，使溫度不能達(dá)到滅菌溫度（通常為121攝氏度）。圖2.1(b) 小型蒸汽生物反應(yīng)器2.2.3一次性生物反應(yīng)器圖2.1（c）顯示了一個(gè)單一的使用系統(tǒng)，該容器已被一個(gè)袋子替換。這種袋子是多層次的，符合與生

11、物過程接觸的產(chǎn)品的所有標(biāo)準(zhǔn)，即它應(yīng)該是脫落的，浸出的或螯合的。在下一節(jié)中我們將討論袋子的結(jié)構(gòu)方面。袋子經(jīng)過預(yù)過濾處理，因此不需要高壓釜或蒸汽供應(yīng)。優(yōu)點(diǎn)是周轉(zhuǎn)時(shí)間(時(shí)間)被最小化。目前這些系統(tǒng)往往是局限于哺乳動(dòng)物和昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)。圖2.1（c）臺(tái)式單用生物反應(yīng)器在考慮上述任何系統(tǒng)之前，有一些基本要點(diǎn)需要決定，下面將討論這些要點(diǎn)。2.3結(jié)構(gòu)方面2.3.1結(jié)構(gòu)材料 結(jié)構(gòu)材料的選擇是基于它顯示以下物理特性：它必須是化學(xué)惰性的，使它不從介質(zhì)中浸出元素或螯合元素（主要是金屬離子）。這要求施工是化學(xué)惰性的材料，以及作為常識(shí)，也是一項(xiàng)監(jiān)管要求，由FDA（食品和藥物管理局制定）和MHRA（藥物和保健產(chǎn)品監(jiān)管署）的

12、設(shè)備被用于藥物或診斷產(chǎn)品的制造。（1）生物反應(yīng)器用料：大規(guī)模生物反應(yīng)器（20公升以上）：材料主要取決于壓力代碼和手動(dòng)處理。在20L以上規(guī)模的生物反應(yīng)器，幾乎都由不銹鋼制成，主要是316升級(jí)不銹鋼或等效不銹鋼較小規(guī)模生物反應(yīng)器：小規(guī)模的系統(tǒng)由硼硅玻璃制成，由316-L不銹鋼制成的頂板和由聚四氟乙烯制成的O型密封圈封頭。這種規(guī)模的系統(tǒng)可以由316L不銹鋼制成。通常，以這種規(guī)模選擇不銹鋼的唯一原因是缺乏足夠大的高壓釜，需要施加過度壓力或易于與硼硅酸鹽玻璃粘附的培養(yǎng)物。表2.1中總結(jié)了316 L包含的其他元素，這些元素都有助于其性質(zhì)。（2）材料：不銹鋼：ra值：平均粗糙度金屬電解拋光，得到超光潔度。這

13、些拋光劑被描述為具有ra(平均粗糙度)值。這意味著當(dāng)某物被描述為0.4 ra拋光時(shí)，沒有點(diǎn)高于金屬表面上方的0.4mm?？梢酝ㄟ^機(jī)械拋光而不是電拋光（其在金屬表面上溶解峰）來實(shí)現(xiàn)更高的光澤度。然而，機(jī)械拋光可能會(huì)導(dǎo)致污物聚集，因?yàn)榻饘俦砻姹徽郫B而不是溶解掉。優(yōu)點(diǎn)是可清潔度高因?yàn)闆]有碎片垃圾產(chǎn)生，耐蝕性也高。表2.1 316L不銹鋼組件的組成和功能硼硅玻璃：組成： SiO2 81，B2O3 13，Na2O+K20 4和Al2O3 2玻璃厚度和氣泡的數(shù)量確定玻璃的強(qiáng)度塑料：大約4年前，Stedim推出了一種技術(shù)，它以袋子的形式添加了第三種材料：塑料。單用發(fā)酵罐是一個(gè)300毫米厚的六層不透氣的袋子，

14、滿足上面所討論的所有標(biāo)準(zhǔn)。它為傳統(tǒng)的STR（攪拌式反應(yīng)器）的市場(chǎng)擴(kuò)大做出了杰出貢獻(xiàn)，原因如下：A)單次使用時(shí)間最短 B）成本大大降低C）系統(tǒng)的驗(yàn)證路線非常簡(jiǎn)單。這個(gè)系統(tǒng)的唯一缺點(diǎn)是缺乏實(shí)現(xiàn)更高OTR的葉輪和擋板，因此只限于對(duì)氧氣需求有限的哺乳動(dòng)物和昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)。2.3.2位置考慮系統(tǒng)應(yīng)放置在一個(gè)適合其使用的環(huán)境。2.3.3基礎(chǔ)條件該位置應(yīng)具有適當(dāng)?shù)臈l件，通常為電力，冷凍水，空氣，氧氣，氮?dú)饣蚨趸?，以及在小?guī)模蒸汽就位（SIP）系統(tǒng)的情況下，蒸汽有正確的體積，壓力和溫度 。2.3.4高壓蒸氣滅菌器大小指定系統(tǒng)時(shí)，容易忽略的一個(gè)重要因素和問題是可用高壓蒸氣滅菌器大小。還應(yīng)考慮高壓釜的類型，以及

15、前端或上部裝載系統(tǒng)的手動(dòng)處理的影響。2.3.5風(fēng)險(xiǎn)和控制歐洲生物技術(shù)聯(lián)合會(huì)根據(jù)人類對(duì)風(fēng)險(xiǎn)的認(rèn)識(shí)將微生物分為五類。（1）無害微生物（EFB Class 1）： 微生物從未被確定為人類疾病的致病因子，對(duì)環(huán)境不構(gòu)成威脅。（2）低危微生物（EFB Class 2）： 可能導(dǎo)致人類疾病的微生物，因此可能對(duì)實(shí)驗(yàn)室工作人員造成危害。他們基本不在環(huán)境中傳播，可有效預(yù)防和治療。（3）中等風(fēng)險(xiǎn)微生物（EFB 3級(jí)）： 微生物對(duì)實(shí)驗(yàn)室工作人員的健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，但對(duì)整體人類的風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較小?？捎行ьA(yù)防和治療。（4）高危微生物（EFB Class 4）： 導(dǎo)致人體嚴(yán)重疾病的微生物，對(duì)實(shí)驗(yàn)室工作人員和廣大人群造成嚴(yán)重危害

16、。一般來說沒有有效的預(yù)防性藥物和有效的治療方法。（5）環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)型微生物：微生物對(duì)環(huán)境的威脅比對(duì)人類更為嚴(yán)重。他們可能造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。通常認(rèn)為，大量培養(yǎng)給定微生物會(huì)提高風(fēng)險(xiǎn)。因?yàn)榘l(fā)酵罐被充氣和攪拌時(shí)，可能發(fā)生泄漏，則有可能通過氣溶膠引起嚴(yán)重的環(huán)境污染。2.4容器設(shè)計(jì)2.4.1基本設(shè)計(jì)幾乎所有小規(guī)模的容器，無論是玻璃還是鋼鐵，用于哺乳動(dòng)物或細(xì)菌使用，都有一個(gè)基本的容器設(shè)計(jì)（圖2.2）。它們由一個(gè)平板，直管壁和半球形底座組成，因?yàn)檫@樣具有產(chǎn)生良好的混合特性，而不產(chǎn)生過大的剪切力。不銹鋼和玻璃系統(tǒng)在建造容器壁上有不同。（1）玻璃系統(tǒng)有兩種選擇，無夾層和夾套，兩者都與溫度控制有關(guān)。無夾套是最簡(jiǎn)單和最

17、便宜的系統(tǒng)，依靠一個(gè)環(huán)繞的加熱帶或等同物來為系統(tǒng)供熱; 可以通過將熱交換器設(shè)置在容器內(nèi)來除去熱量。優(yōu)點(diǎn)：無夾層系統(tǒng)相比能更準(zhǔn)確和穩(wěn)定的控制溫度。缺點(diǎn)：水的高成本和連接的脆弱性。具有夾套的容器（圖2.3）具有充水的外護(hù)套。水通過熱輸入和去除來執(zhí)行溫度調(diào)節(jié)。水溫由外部熱循環(huán)器調(diào)節(jié)。隨著控制技術(shù)的發(fā)展，無夾套系統(tǒng)的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性已達(dá)到現(xiàn)在與夾套系統(tǒng)相匹配的水平。故只有對(duì)于通過直接加熱無法實(shí)現(xiàn)的升高的溫度（如70°C），或者如果該過程需要快速的溫度變化時(shí)使用具有夾套的容器，因?yàn)槠鋫鳠崦娣e大。圖2.2典型的小型無夾層玻璃生物反應(yīng)器圖2.3典型的具有夾層的玻璃生物反應(yīng)器（2）一個(gè)小型不銹鋼容器（圖2.4）在其熱輸入/去除方面的工作方式與夾套玻璃系統(tǒng)的方式大致相同，并具有外部調(diào)節(jié)的供水以控制熱量輸入/移除。圖2.4小型不銹鋼生物反