1、穩(wěn)定表達(dá)PTEN EGFR EGFRffl人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的建立及其分析鑒定穩(wěn)定表達(dá)PTEN EGFR EGFR人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的建立及其分析鑒定#董裕翠，任歡 *51015（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)免疫教研室，哈爾濱 150081 ）摘要：目的：分別建立穩(wěn)定表達(dá)抑癌基因 PTEN表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR 及突變型 EGFRv的惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，從基因、蛋白及細(xì)胞水平驗(yàn)證外源性PTEN EGFR和EGFR基因?qū)87MG細(xì)胞的影響。方法：采用PCR方法擴(kuò)增PTEN基因編碼區(qū)序列， 構(gòu)建重組表達(dá)載體 pcDNA3.1 - /PTEN。分別將 pcDNA3.1 -/PTEN 和 pLWERNL轉(zhuǎn)染 U

2、87MG細(xì)胞，篩選后建立穩(wěn)定細(xì)胞系。應(yīng)用 RT-PCR 和 Western blotting法檢測(cè) PTEN、EGFR在不同抗性細(xì)胞克隆的表達(dá)。MTT法檢測(cè)外源性 PTEN EGFR和 EGFRv基因?qū)?xì)胞增殖 的影響。結(jié)果： 構(gòu)建 真核表 達(dá) 載 體 pcDNA3.1 - /PTEN 及 穩(wěn) 定表 達(dá)細(xì) 胞系 U87MG-PTEN和U87MG-EGFR并經(jīng) RT-PCR 及 western blotting驗(yàn)證。轉(zhuǎn)染外源性 PTEN抑制細(xì)胞增殖（P 0.05），轉(zhuǎn)染EGFRv促進(jìn)細(xì)胞增殖（P 0.05），轉(zhuǎn)染EGFR對(duì)細(xì)胞增殖 無(wú)顯著影響（P 0.05 ）。結(jié)論：成功建立穩(wěn)定表達(dá)抑癌基因 P

3、TEN原癌基因EGFR及其突變體 EGFRv的人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系。 為進(jìn)一步研究所轉(zhuǎn)染基因?qū)ο嚓P(guān)下游細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 通路的影響及對(duì)惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的作用打下良好基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：惡性膠質(zhì)瘤；PTEN基因；EGFR基因；EGFR基因；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染中圖分類號(hào)： R20Establishment and Identification of Human GlioblastomaCell Line Stably expressing PTEN/EGFR /EGFRvDong Yucui, Ren HuanDepartment of Immunology, Harbin Medical University, H

4、arbin 15008125303540Abstract: Objective ： To establish human glioblastoma cell line U87MG-PTEN, U87MG-EGFRand U87MG-EGFRstably expressing PTEN, epidermal growth factor receptor EGFR andEGFRffl respectively. On gene expressi on, protein expressi on andcell proliferation levels toverify the effect of

5、exoge nous PTEN, EGFR and EGFRv 川 gene on the U87MG cells. Methods ：The PTENgene CDSwas amplified by PCR, then inserted into eukaryotic expression vectorpcDNA3.1 - to constructrecombinant vector pcDNA3.1 - /PTEN.pcDNA3.1 - /PTEN andpLWERNLwere transfectedinto U87MG cellsrespectively. Theexpression o

6、f PTEN and EGFRin different G418 resistant cell clones was detected by RT-PCR andWestern blotting. The effectof exoge nous PTEN, EGFR and EGFRvn gene on the cell proliferati on was tested by MTTassay. Results ：The eukaryotic expression vector pcDNA3.1- /PTENwas constructed. The stablecell lines U87M

7、G-PTEN and U87MG-EGFR were established and verified by RT-PCR andWestern blotting. Stable expression of exogenous PTEN can suppress the growth of humanglioblastoma cell line U87MG P0.05 , stable expression of exogenousEGFR 昭 can in creasethe growth of U87MG P 0.05 , whereas stable expression of EGFR

8、 has much less effect on theU87MG cells growth P 0.05 . Conclusion： We have successfullyestablished humanglioblastoma cell line U87MG-PTENU,87MG-EGFaRnd U87MG-EGFR stably expressingPTEN,EGFRand EGFRffl , respectively. This will lay down a good basis to further study theeffect of transfected gene on

9、the related downstream signaling pathways in glioblastoma and thedevelopment of GBM.Keywords: Glioblastoma; PTEN gene; EGFR gene; EGFRv 川 gene; stable transfect基金項(xiàng)目：本課題受高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助（項(xiàng)目編號(hào) 20092307110006）作者簡(jiǎn)介：董裕翠， 1982- ，女，講師，主要研究惡性腦膠質(zhì)瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 模式及靶向治療。通信聯(lián)系人：任歡， 1967- ，女，教授，主要研究惡性腫瘤的靶向治療及免疫逃逸機(jī)制。 E-ma

10、il:huanren2009126-1-4550556065707580在惡性膠質(zhì)瘤中，表皮生長(zhǎng)因子受體（ epidermal growth factor receptor ，EGFR的過(guò)表達(dá)及突變占45%1。EGFR基因擴(kuò)增常伴隨結(jié)構(gòu)的變異，其中第三類突變體 （EGFR）v 是惡性膠質(zhì)瘤中最常見(jiàn)的基因組突變體，該受體缺失 2-7 外顯子。抑癌基因 PTEN（humanphosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten）在正常情況下通過(guò)調(diào)控原癌基因磷脂酰肌醇（PI） -3-激酶（PI3K）來(lái)抑制該信號(hào)通路的活化從而發(fā)揮調(diào)節(jié) 功能。惡

11、性膠質(zhì)瘤中36%的PTEN基因發(fā)生了缺失或突變1。研究證實(shí)，EGFR PTEN等 基因的異常表達(dá)正是促進(jìn)與之相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路網(wǎng)絡(luò)異?；钴S的重要因素。因此，EGFR下游區(qū)域密切相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)可能是在維持惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞基因表型及功能狀態(tài) 中起關(guān)鍵作用的主效通路。人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MGS達(dá)低水平EGFR基因，不表達(dá)EGFRS因，PTEN 基因發(fā)生剪接位點(diǎn)突變， 第 3外顯子缺失， 因而不能發(fā)揮其功能。 本實(shí)驗(yàn)將建立分 別表達(dá)PTEN和EGFR勺兩種人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，研究外源性 PTEN EGFR和EGFR基因的表達(dá)及對(duì)U87MG田胞增殖的影響。1 材料與方法1.1 主要材料人惡性膠質(zhì)瘤

12、細(xì)胞U87MG LN229和U87MG-EGFRV為本教研室保存，質(zhì)粒 載體pcDNA3.1 - 由本校遺傳學(xué)教研室饋贈(zèng)，含 EGFR 基因的表達(dá)載體 pLWERNL 由 Dr. FrankFurnari Ludwig Institute, San Diego, CA 惠贈(zèng)， LipofectamineTM2000 購(gòu)自 Invitrogen 公司，DNAmarker、限制性內(nèi)切酶（EcoR Kpn Sal和Neo）購(gòu)自TaKaRa公司， T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB公司，G418為EMDBiosciences 公司產(chǎn)品，EGFR兔單克 隆抗體、 PTEN兔單克隆抗體、HRP標(biāo)記抗兔抗體購(gòu)自C

13、ell Signaling 公司，B -actin 抗購(gòu)自武漢博士德公司，四甲基偶氮唑藍(lán) MTT 為 Sigma 公司產(chǎn)品。1.2 重組質(zhì)粒 pcDNA3.1 - /PTEN 的構(gòu)建0>. 引物設(shè)計(jì)根據(jù) GeneBank 中 PTEN 的 cDNA 序列，分別在引物 5' 端加上 EcoR 和Kpn 酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物 P1 （上游引物：CCG GAA TTC GGC TCC CAG ACA TGA,CAG游引物: CGGGGT ACC AAG TTT ATT TTC ATG GTG ）T用于擴(kuò)增 PTEN 基因編碼區(qū)。根 據(jù)包含PTEN基因第三外顯子的原則設(shè)計(jì)引物 P2 （上游

14、引物：CATGACAGCCATCAT CAA AG，下游引物：GTC AAG ATC TTC ACA AAA）G創(chuàng)于檢測(cè)突變型和野生型 PTEN 的表達(dá)。根據(jù)GeneBank中EGFRcDNA序列，設(shè)計(jì)引物 P3 （上游引物：CTTCGGGGA GCA GCG ATGCGA C 下游弓I物：ACC AAT ACC TAT TCC GTT ACA）C 檢測(cè) EGFR 基因的 表達(dá)。根據(jù)GeneBank中B -actin cDNA序列，設(shè)計(jì)參照引物P4（上游引物：ATTGGC AAT GAG CGGTTC CGC下游引物：CTC CTG CTT GCT GAT CCA CATC引物由上海英俊 生物

15、技術(shù)公司合成。.人PTEN cDNA的擴(kuò)增按 Trizol 試劑說(shuō)明書提取 LN229 細(xì)胞（ LN229 中含完整的 PTEN 基因， 能表達(dá)內(nèi)源性的 PTEN 蛋白2,35min 。以 LN229 cDNA 為模板， P1 為引物，擴(kuò)增 PTEN 編碼區(qū)序列。反應(yīng) 條件: 98 變-2-性10s , 65退火10s , 72延伸70s （30個(gè)循環(huán)）。PCR產(chǎn)物通過(guò)1.5%瓊脂 糖凝膠電泳鑒85人 PTEN 真核表達(dá)載體的構(gòu)建將回收純化的PCR產(chǎn)物及質(zhì)粒pcDNA3. 1 -分別用EcoR和Kpn雙酶切，低熔點(diǎn)瓊脂糖電泳分離、膠回收純化后，經(jīng)T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感

16、受態(tài)細(xì)胞，重組質(zhì)粒分別經(jīng) Sal 和 Nco 酶切及基因測(cè)序鑒定。G418對(duì)U87MG細(xì)胞的毒性試驗(yàn)9095U87MG在5% CO237條件下培養(yǎng)于 DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100U/ml霉素和100卩g/ml鏈霉素）。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，接種于 6 孔板中，待細(xì)胞貼壁后， 更換含有 G418 的濃度分別為 100、 200、 300、 400、 500、 600、 700、 800、 900和1000卩g/ml DMEM培養(yǎng)基，每種濃度設(shè)2個(gè)平行孔，每隔3天換藥1 次，以 10-14 天細(xì)胞全部死亡的最低 G418 濃度為最佳篩選濃度。1.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立按

17、照 LipofectamineTM2000 操作說(shuō)明書，用表達(dá)載體 pcDNA3.1 - /PTEN 和 pLWERNL分別轉(zhuǎn)染U87MG細(xì)胞。轉(zhuǎn)染約48小時(shí)后，在含G418的選擇性培養(yǎng)基中 篩選細(xì)胞 2-3 周，獲得抗性細(xì)胞克隆，擴(kuò)增培養(yǎng)、鑒定后，建立穩(wěn)定細(xì)胞系。1.4 穩(wěn)定細(xì)胞系的鑒定100RT-PCR 法分別收集 pcDNA3.1 - /PTEN 和 pLWERNL 轉(zhuǎn)染后挑取的細(xì)胞克隆，按Trizol 試劑說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA取1卩g進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以P2為引物的PCR反應(yīng)條件：94 預(yù)變性 3min ，94變性30s , 58退火30s , 72延伸45s （30個(gè)循環(huán)），72延伸10

18、min。以P3 為引物的PCR反應(yīng)條件：94預(yù)變性2min，94變性30s，58退火30s，72延伸60s（ 30 個(gè)循105110115環(huán)），72延伸 10min 。以 P4 為引物的 PCR 反應(yīng)條件： 98變性 10s ，54退 火 15s ， 72延伸 30s （ 28 個(gè)循環(huán)）。取 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。. Western Blotting 法分別收集pcDNA3.1 -/PTEN 和pLWERNL轉(zhuǎn)染后挑取的細(xì)胞克隆，經(jīng)裂解 液裂解細(xì)胞，Bradford 法測(cè)蛋白濃度。樣品于 100 水浴 5 min , 取等量蛋白上樣進(jìn)行SDAS - PAGE 電泳,電泳后將蛋白轉(zhuǎn)

19、移至硝酸纖維膜上 ,5 %脫脂奶粉封閉 ,隨后與特異性一抗孵 育 4 過(guò)夜，次日與辣根過(guò)氧化物酶 HRP 標(biāo)記的二抗室溫孵育 1 小時(shí)后，暗室中用 ECL 化 學(xué)發(fā)光試劑作用雜交膜顯影成像于 X 膠片上。1.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 U87MG U87MG-PTENJ87MG-EGF和 U87MG-EGFR細(xì)胞，胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，按每孔4 X 103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每 孔體積100卩L。用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)后，更換無(wú)血清培養(yǎng)液。以U87MG為 對(duì)照組，U87MG-PTEN U87MG-EGFR和U87MG-EGFR為試驗(yàn)組，每組細(xì)胞設(shè)4個(gè)復(fù) 孔， 6

20、個(gè)時(shí)間檢測(cè)點(diǎn)，分別于第 1 、2、3、4、5、6 天檢測(cè)。在指定時(shí)間點(diǎn)每孔加入MTT 5mg/ml 20 卩 l ,37孵育 4h后吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入 DMSOWOy l，室溫振蕩10min ,在酶聯(lián)免疫檢測(cè)-3-120125130儀 490nm 波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值，以細(xì)胞增殖百分率為縱坐標(biāo)、時(shí)間為橫 坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（X ± S）表示，采用SPSS軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué) 處理，組間樣本均數(shù)比較采用方差分析，以 P 0.05 作為有無(wú)顯著性差異的判斷標(biāo)準(zhǔn)。2 結(jié)果2.1 重組質(zhì)粒的鑒定重組質(zhì)粒 pcDNA3.1 - /PTEN ，經(jīng)

21、 Sal 酶切可得到長(zhǎng)度 4480bp 和 2185bp 兩條片段，經(jīng)Nco 酶切可得到長(zhǎng)度 3342bp 、 2588bp 和 735bp 三條片段，與預(yù)期片段一 致（圖 1 ）。經(jīng)基因測(cè)序、BLAST比對(duì)，重組質(zhì)粒的插入片段序列與 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中PTEN 編碼區(qū)序列相符。圖 1 pcDNA3.1 - /PTEN 酶切鑒定結(jié)果Fig.1 Restrictive endonuclease digestion of pcDNA3.1 - /PTEN1352.2M:DNA marker 1: Sal 酶切質(zhì)粒 2: Nco 酶切質(zhì)粒G418 最佳篩選濃度的確定800、900、1000 卩

22、g/ml 組于第 2 天，500、600、700 卩 g/ml 組于第 3 天， 300、400 卩 g/ml組于第5天開(kāi)始出現(xiàn)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)現(xiàn)象，第10天，除200、300卩g/ml組 有細(xì)胞存活外，其余各組細(xì)胞全部死亡。 因此，可以認(rèn)為在本實(shí)驗(yàn)條件下 G418 最佳篩選濃度 為 400 卩 g/ml。1402.3 穩(wěn)定細(xì)胞系的鑒定RT-PCR水平. ( 1)：用引物 P2 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，在轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1 - /PTEN 的三株細(xì)胞 克隆中可擴(kuò)增出兩條條帶，即突變型 PTEN( 283bp)和野生型PTEN (328bp),而在U87MG細(xì)胞只能檢測(cè)到突變型PTEN (283bp

23、)的表達(dá)(圖2 )。下圖為相對(duì)應(yīng)細(xì)胞內(nèi) 參照基因 B -actin145(336bp )的表達(dá)。-4-圖2 RT-PCR檢測(cè)PTEN mRN的穩(wěn)定表達(dá)Fig.2 RT-PCR analysis of PTEN mRNA stable expressionM: DNA marker1: U87MG 細(xì)胞2：轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1 - /PTEN 的 9 號(hào)克隆1503: 轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1 - /PTEN 的 10 號(hào)克隆4: 轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1 - /PTEN 的 14 號(hào)克隆.(2):以P3為弓I物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在U87MG和pLWERNL轉(zhuǎn)染的U87MG細(xì)胞9號(hào)克隆中可擴(kuò)增出E

24、GFR的條帶(1044bp),且轉(zhuǎn)染pLWERNL的細(xì) 胞中 EGFR 基因表達(dá)更強(qiáng)(圖3 )。下圖為相對(duì)應(yīng)細(xì)胞中內(nèi)參照基因B -actin (336bp)的表達(dá)。155圖3 RT-PCR檢測(cè)EGFR mRN的穩(wěn)定表達(dá)Fig.3 RT-PCR analysis of EGFR mRNA stable expressionM:代表 DNA marker1: U87MG細(xì)胞2:轉(zhuǎn)染pLWERN的U87MG田胞9號(hào)克隆160165. Western Blotting 水平檢測(cè). 1 圖 4 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1 - /PTEN 的三株細(xì)胞克?。?9 號(hào)， 10 號(hào)和 14 號(hào)）表達(dá)PTE

25、N蛋白（54kDa,這表明PTEN在此三株細(xì)胞克隆中得到了穩(wěn)定表 達(dá)，且 14 號(hào)的蛋白表達(dá)最強(qiáng)，故將其建立穩(wěn)定細(xì)胞系，即為U87MG-PTEN圖4 Western Blotting檢測(cè)PTEN蛋白的穩(wěn)定表達(dá)Fig.4 Western Blotting analysis of PTEN protein stable expression1:U87MG細(xì)胞2：轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1 - /PTEN 的 9 號(hào)克隆3: 轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1 - /PTEN 的 10 號(hào)克隆 4: 轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1 - /PTEN 的 14 號(hào)克隆-5-.2 圖5 結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染 pLWERNL的U87MG

26、細(xì)胞9 號(hào)克隆表達(dá) EGFR蛋白170175180185（170kDa）,而在U87MG細(xì)胞和其余轉(zhuǎn)染pLWERNL后所挑取的細(xì)胞克隆中 均沒(méi)有檢測(cè)到 EGFR 蛋白的表達(dá),這表明 EGFR 蛋白在 9 號(hào)克隆中得到了穩(wěn)定表達(dá), 故將其建立穩(wěn)定細(xì)胞系，即為U87MG-EGFR圖5 Western Blotting 檢測(cè)EGFR蛋白的穩(wěn)定表達(dá)Fig.5 Western Blotting analysis of EGFR protein stable expression1: U87MG細(xì)胞2:轉(zhuǎn)染pLWERN的 U87MG田胞9號(hào)克隆2.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖 6 。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表

27、明， 在無(wú)血清狀態(tài)下培養(yǎng) 6 天后， 試驗(yàn)組細(xì)胞U87MG-PTENU87MG-EGFR與對(duì)照組細(xì)胞U87MG相比，吸光度值都有顯著 性差異（P 0.05）；而試驗(yàn)組細(xì)胞U87MG-EGFRT對(duì)照組細(xì)胞U87MG相比，吸光度 值無(wú)顯著性差異（P 0.05 ）。這表明在無(wú)血清狀態(tài)下，外源性PTEN的表達(dá)能抑制U87MG 細(xì)胞的增殖，EGFR能促進(jìn)U87MG細(xì)胞的增殖，而野生型EGFR對(duì)U87MG細(xì)胞增殖影響 不顯著。Fig.6圖6 各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖cell proliferation under serumfree conditions3 討論抑癌基因 PTEN 和原癌基因 EGFR 功能狀態(tài)

28、及其基因變異方式與惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展190195等生物學(xué)行為有密切關(guān)系，并且影響膠質(zhì)瘤的臨床治療效果和預(yù)后判定PTEN基因編碼的蛋白質(zhì)具有雙特異性蛋白 / 脂質(zhì)磷酸酶活性 4 ，在誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡 以及細(xì)胞的粘附、遷移、分化等多方面均起到了至關(guān)重要的作用 5-7 。研究表明，外源性 PTEN 在 PTEN 突變的惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)，可誘導(dǎo) G1 期阻滯，有效抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。 在惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中 , EGFR 常常出現(xiàn)基因擴(kuò)增和重排，導(dǎo)致基 因突變使腫瘤細(xì)胞表面的抗原表型發(fā)生變化，其中最常見(jiàn)的突變類型為EGFRv其激活 表現(xiàn)為配體非依賴性酪氨酸激酶組成性激活8。到目前為止

29、，EGFRv在將近61 %惡性 膠質(zhì)瘤被檢測(cè)至嘰而在多種正常組織中未檢測(cè)到。許多研究表明，EGFRV能促進(jìn)細(xì)胞增殖， 抑制細(xì)胞凋-6-亡，提高腫瘤細(xì)胞致瘤性 9 ，EGFRvIII 還能提高細(xì)胞活力， 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞 的遷移和侵襲 10 。因其只在腫瘤細(xì)胞中表達(dá) , 而在正常細(xì)胞中不表達(dá) , 具有腫瘤特異性 , 而成為 腫瘤靶向治療的235200205210215220225230熱點(diǎn)。在本研究中，將重組真核表達(dá)載體 pcDNA3.1 -/PTEN和pLWERNL分別轉(zhuǎn) 染人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG從基因和蛋白兩個(gè)水平驗(yàn)證了轉(zhuǎn)染基因的穩(wěn)定表達(dá)，分別 建立了穩(wěn)定表達(dá)外源性PTEN EGFR基因的細(xì)

30、胞系U87MG-PTEN和U87MG-EGF，并就外 源性 PTEN、EGFR和EGFRv基因?qū)?xì)胞增殖的影響進(jìn)行了研究。MTT實(shí)驗(yàn)表明，PTEN 能抑制U87MG細(xì)胞的增殖，EGFRvIII能促進(jìn)U87MG細(xì)胞的增殖，而 EGFR對(duì) U87MG細(xì)胞增殖影響不顯著。穩(wěn)定細(xì)胞系U87MG-PTEN U87MG-EGF和 U87MG-EGFR啲成功構(gòu)建為進(jìn)一步研究所轉(zhuǎn)染基因PTEN EGFR和 EGFRv對(duì)相關(guān)下游細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響 及對(duì)惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的作用打下良好的基礎(chǔ)， 從而明確膠質(zhì)瘤中不同分子亞型的細(xì)胞 下游相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的差別，有助于正確區(qū)分不同分子亞型不同作用靶點(diǎn)，提出有效的、

31、 有針對(duì)性的治療靶點(diǎn)，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。4 結(jié)論本研究成功建立穩(wěn)定表達(dá)抑癌基因PTEN、原癌基因EGFR及其突變體EGFRV 勺人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系。這為進(jìn)一步研究所轉(zhuǎn)染基因?qū)ο嚓P(guān)下游細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通 路勺影響及對(duì)惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展勺作用提供了良好勺體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?參考文獻(xiàn) References1 The Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines humanglioblastoma genes and core pathways J.nature, 2008,455

32、 7216 :1061-1068.2 Li J, Yen C, Liaw D, et al. PTEN, a putative protein tyrosinephosphatase gene mutated in human brain, breast,and prostate cancerJ. Science, 1997, 275 5308 :1943-1947.3 Furnari FB, Lin H, Huang HS, et al. Growth suppression of glioma cells by PTEN requires a functionalphosphatase catalytic domainJ. Proc Natl Acad Sci U S A, 1997, 9423 :12479-12484.4 Myers MP, Stolarov JP, Eng C, et al. P-TEN, the tumor suppressor from human chromosome 10q23, is adual-specificity phosphataseJ. Proc Natl Acad Sci U S A, 1997, 9417 : 9052-9057.5 Li DM, Sun H. PTEN/MMAC1/TEP1 sup