1、機(jī)能學(xué)設(shè)計性實(shí)驗(yàn)福建醫(yī)科大學(xué)2012級臨床醫(yī)學(xué)8中班邱涼涼陳志龍尹哲黃國堡汪聲祺預(yù)先靜脈注射維生素C對家兔腸系膜上動脈缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用【U的和原理】根據(jù)休克的缺血-再灌注損傷理論，通過靜脈注射環(huán)磷酰胺封閉家兔肝臟網(wǎng)狀內(nèi)皮祚噬系統(tǒng)功能，24h后夾閉腸系膜上動脈若干時間，然后 恢復(fù)血流灌注可造成小腸缺血-再灌注損傷，腸源性內(nèi)毒素入血而發(fā)生休克1。研 究表明，對組織造成損傷的主要因素，不是缺血本身，而是恢復(fù)血液供應(yīng)后，產(chǎn)生 大量的自山基攻擊這部分重新獲得血液供應(yīng)的組織內(nèi)細(xì)胞，造成腸內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)屏 障的損傷，腸道毛細(xì)血管通透性增高，腸粘膜損傷加重，并出現(xiàn)廣泛上皮和絨毛分 離，上皮壞死，引起腸

2、道內(nèi)細(xì)菌毒素入血，從而產(chǎn)生類似感染性休克的結(jié)果2。已有實(shí)驗(yàn)表明，維生素C具有很強(qiáng)的抗氧化（清除氧自山基）和降低腸道細(xì)菌易位 發(fā)生率和易位量的作用，因此預(yù)先靜脈注射維生素C可使超氧化物歧化酶（SOD）活 性增高、血清丙二醛（MDA）含量下降3,起到保護(hù)腸粘膜屏障的作用?；谝陨显?，本實(shí)驗(yàn)旨在學(xué)習(xí)腸系膜上動脈閉塞性休克動物模型復(fù)制的方 法，探討維生素C對缺血一再灌注損傷休克的保護(hù)作用，從而進(jìn)一步拓展維生素C 的臨床應(yīng)用價值?！緦?shí)驗(yàn)動物】家兔9只，體重2 kg以上，雌雄不拘?！緦?shí)驗(yàn)器材與藥品】RM6240多道生理信號采集處理系統(tǒng)或BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)、壓力換能器；手術(shù)臺、急性動物實(shí)驗(yàn)動物手

3、術(shù)器械、動脈夾、氣管插 管、三通管、30ml注射器、玻璃試管、可調(diào)節(jié)移液槍（100 u 1和1000 P1）、滴 管、秒表、紗布、細(xì)絲線；0.5%肝素鈉生理鹽水（625U/ml）、環(huán)磷酰胺、20%氨基 屮酸乙酯溶液（或3%戊巴比妥鈉溶液）、1%普魯卡因溶液、顯色基質(zhì)鯊試劑盒、 無熱原的真空采血管、無熱原試管等?！緦?shí)驗(yàn)步驟與觀察項LI】1、手術(shù)操作（1）術(shù)前動物處理：取家兔9只，隨機(jī)分為三組，分別編號A、B、C,實(shí)驗(yàn) 前24h各耳緣靜脈注射環(huán)磷酰胺60mg/kg,禁食，自由飲水。（2）麻醉與固定：家兔稱重，耳緣靜脈緩慢注射20%氨基屮酸乙酯溶液 ml/kg或3%戊巴比妥鈉溶液lml/kg麻醉動物

4、，注射時應(yīng)密切觀察動物的肌張力、 心跳、呼吸、瞳孔大小、角膜反射和皮膚夾捏的疼痛反映等。麻醉后將動物仰臥固 定于手術(shù)臺上，注意頸部要放正。（3）氣管插管：剪去頸部的毛，自甲狀軟骨到胸骨上方沿正中線切開皮膚及 皮下組織（切口長約5cm）,分離皮下組織和肌肉，暴露氣管，氣管下方穿一根絲 線，在屮狀軟骨下方的氣管上做一倒“T”形切口，插入氣管插管后結(jié)扎固定。（4）頸總動脈插管：分離左側(cè)頸總動脈2、3cm,近心端用動脈夾夾閉，遠(yuǎn)心 端（盡量靠近頭端）用線結(jié)扎，在結(jié)扎下方剪一切口，向心臟方向插入注滿0.5% 肝素鈉生理鹽水的動脈插管，用另一絲線結(jié)扎固定。打開動脈夾，用注射器經(jīng)三通 管向動脈內(nèi)注入0. 5

5、-lcm的0.5%肝素鈉生理鹽水，再旋轉(zhuǎn)三通管的開關(guān)，使動脈 插管與壓力換能器相通，即可記錄動脈血壓。（5）右頸總靜脈插管：頸總靜脈位置較淺，位于頸部肌肉外緣，用血管鉗輕 輕鈍性分離并在下方穿兩根絲線，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，以結(jié)扎線作為牽引線提起頸總靜 脈，并將一手指墊在頸總靜脈下。用眼科剪在近心端血管壁上呈45°角剪一小 口，插入帶三通開關(guān)、已充滿生理鹽水的靜脈導(dǎo)管并深入至相當(dāng)右心房位置（5、7cm,該長度需在插管前在導(dǎo)管上做標(biāo)記），遇有阻力應(yīng)往回退一小段，切不 可硬插（易插破靜脈進(jìn)入胸腔）。此時旋動三通管開關(guān)，使靜脈插管與壓力換能器 相通，即可測得中心靜脈壓，觀察插管是否成功。若導(dǎo)管插管成

6、功，則可見中心靜 脈壓數(shù)值在012cmH20范圍并隨呼吸而上下波動，結(jié)扎固定。三通管連上輸液瓶， 不測壓時使導(dǎo)管與輸液管相通，緩慢輸入生理鹽水（5、10滴/分），保持靜脈通 暢。（6）暴露腸系膜上動脈：自劍突下1.5cm起沿腹正中線向下做一個正中切 口，切口長約8cm,打開腹腔后，用溫生理鹽水紗布將內(nèi)臟輕輕推向左前方，暴露 出脊柱和腹膜后組織、在脊柱稍右可見黃色的右腎上腺，于右腎上腺右上方可見腸 系膜上動脈，用血管鉗鈍性分離周圍組織，然后在腸系膜上動脈穿線備用。（7）B組輕輕提起腸系膜上動脈的穿線，用動脈夾夾閉腸系膜上動脈60min 后，除去動脈夾，分別在松開動脈夾后Omin、5min、15m

7、in、30min、60min、 90min. 120min于家兔耳中央動脈采血2ml置于含肝素鈉抗凝劑的無熱原試管中待 用，并描記頸動脈血壓曲線同時觀察血壓變化；A組僅暴露但不夾閉腸系膜上動 脈，取血與描記頸動脈血壓曲線操作與B組同；C組于動脈夾松開前15min （即夾 閉后的第45min）由三通管注射維生素C 0. 500g/kg （濃度為0. 300mg/L） 4,接 下來的操作與B組同。2、系統(tǒng)連接和參數(shù)設(shè)置（1）實(shí)驗(yàn)裝置連接：與頸總動脈插管相連的壓力換能器置于家兔心臟同一水 平面，其輸出線接RM6240 （或BL-420）系統(tǒng)輸入通道1。（2）參數(shù)設(shè)置：打開儀器電源，啟動計算機(jī)，進(jìn)入R

8、M6240 （或BL-420）操 作相應(yīng)界面，預(yù)熱20分鐘。RM6240系統(tǒng)：采樣頻率800Hz,掃描速度500ms/div,時間常數(shù)選直流，高頻 濾波30Hzo模式為壓力，靈敏度2. 5cmH20/divoBL-420F系統(tǒng)：采樣頻率50Hz,時間常數(shù)選直流，高頻濾波20Hz。掃描速度 l.Os/divo通道1選壓力,增益50mVo3、觀察項目（1）測定血液內(nèi)毒素含量分別從各無熱原試管取血lml,在顯色基質(zhì)蛍試劑試劑盒按其使用說明書提 供的方法（見附錄），測定各血漿內(nèi)毒素水平并比較A、B、C三組內(nèi)毒素水平的不 同。（2）描記頸動脈血壓曲線輕輕提起腸系膜上動脈的穿線，用動脈夾夾閉腸系膜上動脈，

9、同時觀察并描 記血壓曲線。然后分別在松開動脈夾后Omin、5min、15min、30min、60min、 90min> 120min觀察并描記血壓曲線。將上面的結(jié)果記錄于記錄于表1 （見附錄）【預(yù)期結(jié)果】1、三組家兔內(nèi)毒素測定的平均值分別為：A 組：0. 008 ug/ml; B 組：6 M g/ml C 組：0. 05 u g/ml可見，實(shí)驗(yàn)組（C組）注射維生素C后，家兔血液中的內(nèi)毒素含量較對照組 （B組）明顯減少，較空白組（A組）增加不明顯。2、三組家兔的血壓變化曲線可見，對照組（B組）的血壓較正常組（A組）明顯下降，實(shí)驗(yàn)組（C組）的 血壓較正常組（A組）無明顯變化。由上述結(jié)果可知，

10、通過預(yù)先給家兔注射維生素C,可以在腸系膜上動脈缺血- 再灌注休克動物模型中起到減少內(nèi)毒素釋放入血的作用，大大減輕休克損傷，從而 起到預(yù)防作用?！緦?shí)驗(yàn)研究意義】實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新與臨床應(yīng)用近年來，隨著休克治療的進(jìn)步以及溶栓治療、心臟外科體外循環(huán)、心肺腦復(fù) 蘇、斷肢再植、器官移植等方法的建立和應(yīng)用，使組織器官的血液循環(huán)重建，功能 得到恢復(fù)。山于受損組織結(jié)構(gòu)的修復(fù)，患者的病情得以好轉(zhuǎn)或康復(fù)；但是有時缺血 后再灌注，不僅未能使組織、器官功能恢復(fù)，反而加重組織、器官的功能障礙和結(jié) 構(gòu)損傷?，F(xiàn)已證實(shí)，心、腦、肝、腎、肺、胃腸道、肢體及皮膚等多種組織器官存 在缺血再灌注損傷的現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)通過探究維生素C對家兔腸系膜上

11、動脈缺血再灌 注損傷的保護(hù)作用，將維生素C的抗氧化（清除氧自山基）和降低腸道細(xì)菌易位發(fā) 生率和易位量的作用類推于存在缺血再灌注損傷現(xiàn)象的上述組織器官中，保護(hù)組織 器官，老藥新用。而且維生素C價格便宜，能夠大范圍推廣使用?！咀⒁馐马棥?、剪開腹膜時，如動物仍有疼痛反應(yīng)，可再用少量的1%普魯卡因溶液進(jìn)行 腹膜麻醉；2、移動內(nèi)臟動作輕柔，以免過度牽拉損傷腸管，造成血壓下降；3、分離腸系膜上動脈時，動作要輕，不要使用銳器，夾閉時不能用力過猛造 成血管大出血；4、正確使用動脈夾，確保夾緊腸系膜上動脈；5、動脈夾夾閉過緊，松夾后動脈仍未被復(fù)流的血液沖開，需用食指深入夾閉 處搓揉兒下?！靖戒洝匡@色基質(zhì)蛍試劑

12、盒使用說明1、材料和設(shè)備1. 1試劑鯊試劑、細(xì)菌內(nèi)毒素工作品、顯色基質(zhì)、偶氮化試劑1、偶氮化試劑2、偶 氮化試劑3、HC 1 （反應(yīng)終止劑）、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水。1.2器材無熱原試管、無熱原吸頭。旋渦混合儀、移液器、多道移液器、封口膜、試管架。恒溫水浴箱（37±1°C）、分光光度計。注意：接觸試劑及供試品的所有器皿必須是無熱原的（出產(chǎn)公司提供無熱原耗 材）。玻璃器皿可經(jīng)250°C干烤至少60分鐘去除熱原。2、供試品的貯存與預(yù)處理備注：若供試品為血液類，請參照廠家配套血液相關(guān)處理試劑使用說明書。2.1供試品的pH值應(yīng)在6 - 8之間，若超出此范圍，需用無熱原緩沖液、

13、 0. 1N氫氧化鈉或0. 1N鹽酸調(diào)節(jié)。2.2若供試品中可能存在蛍實(shí)驗(yàn)的干擾物質(zhì)，處理參見【供試品的干擾試 驗(yàn)】。2.3若供試品中可能含有B葡聚糖（B葡聚糖會產(chǎn)生G因子旁路反應(yīng)， 干擾內(nèi)毒素檢測），需選用特異性鯊試劑（出產(chǎn)公司提供）。2. 4若供試品為一些抗菌素如頭抱類抗菌素和磺胺制劑會對偶氮染色劑產(chǎn)生偶聯(lián)反應(yīng)而干擾偶氮化顯色，需要選用不含偶氮化試劑的試劑盒（出產(chǎn)公司提供）。2. 5若供試品的本底吸光度值大于0. 5,必須對供試品進(jìn)行稀釋后再檢測。2.6若供試品顏色較深（例如溶血），或在酸性條件下顏色加深（例如一些組織 培養(yǎng)介質(zhì)），必須設(shè)置供試品空口管以扣除供試品自身的顏色本底。供試品空口管不加入鯊試劑，以等體積鯊試劑的溶劑（該處為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查 用水）代替。其余操作同供試品管。3、實(shí)驗(yàn)操作3. 1細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線所釆用