1、醉母蔗糖酶的提取及性質(zhì)測定引論及原理酶的分離制備在酶學(xué)以及生物大分子的結(jié)構(gòu)功能研究中有重要意義。本實驗屬綜合性實驗，接近研究性實驗，包括八個連續(xù)的實驗內(nèi)容，通過對蔗糖酶的提純和性質(zhì)測定，了解酶的基本研究過 程；同時掌握各種生化技術(shù)的實驗原理、基本操作方法。本實驗技術(shù)多樣化，并且多個知識點互相 聯(lián)系，實驗內(nèi)容逐步加深，構(gòu)成了一個綜合性整體，為學(xué)生提供一個較全面的實踐機會，學(xué)習(xí)如何 提取純化、分析鑒定一種酶，并對這種酶的性質(zhì)，尤其是動力學(xué)性質(zhì)作初步的研究。蔗糖酶（invertase） （ pD 吠喃果糖昔果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase）（EC.321

2、.26）特異地催化非還原糖中的口一吠喃果糖昔鍵水解，具有相對專一性。不僅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。每水解1mol蔗糖，就生成2mol還原糖。還原糖的測定有多種方法，本實驗采用Nelson比色法測定還原糖量，由此可得知蔗糖水解的速度。Sucrose在研究酶的性質(zhì)、作用、反應(yīng)動力學(xué)等問題時都需要使用高度純化的酶制劑以避免干擾。酶的提純工作往往要求多種分離方法交替應(yīng)用，才能得到較為滿足的效果。常用的提純方法有鹽析、有機溶劑沉淀、選擇性變性、離子交換層析、凝膠過濾、親和層析等。酶蛋白在分離提純過程中易變性失活，為能獲得盡可能高的產(chǎn)率和純度，在提純操作中要始終

3、注意保持酶的活性如在低溫下操作等，這樣才能收到較好的分離效果。啤酒酵母中，蔗糖酶含量豐富。本實驗用新鮮啤酒酵母為原料， 通過破碎細(xì)胞，熱處理，乙醇沉淀，柱層析等步驟提取蔗糖酶，并對其性質(zhì)進行測定。一、蔗糖酶的提取與部分純化（一）實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)酶的提取和純化方法，掌握各步驟的實驗原理，并為后續(xù)實驗提供一定量的蔗糖酶。 （二）實驗原理（略）（三）實驗儀器、材料及試劑儀器1 .高速冷凍離心機、恒溫水浴箱、-20 c冰箱2 .電子天平、研缽（ 200ml）、制冰機、50ml燒杯3 .離心管（2ml, 10ml, 30ml或50ml）、移液器（1000ul）或滴管、量筒 材料及試劑1. 市售鮮啤酒酵母（低

4、溫保存）2. 石英砂（海沙）、甲苯（使用前預(yù)冷到0以下）3. 95%乙醇（預(yù)冷20） 、去離子水（使用前冷至4左右）4. Tris-HCl （pH7.3）緩沖液（四）操作步驟1. 提?。?）將市售鮮啤酒酵母 2000 rpm,離心10 min,除去大量水分。（ 2）將研缽穩(wěn)妥放入冰浴中。（ 3）稱取50g 鮮啤酒酵母，加30g 石英砂放入研缽中，加50ml 預(yù)冷的甲苯（邊研邊加）或預(yù)冷的去離子水，在研缽內(nèi)研磨成糊狀，然后每次緩慢加入預(yù)冷的10ml 去離子水，邊加邊研磨以便將蔗糖酶充分轉(zhuǎn)入水相。共加75ml 去離子水，研磨約4060 分鐘，使其成糊狀液體。（注：研磨時可用顯微鏡檢查研磨的效果，至

5、酵母細(xì)胞大部分研碎）。（4）將混合物轉(zhuǎn)入 50ml （或分裝入2個30ml）離心管中，平衡后，用高速冷凍離心機離心，4C, 15000rpm, 15min。觀察結(jié)果：如果中間白色的脂肪層厚，說明研磨效果良好。（ 4）用移液器（或滴管）吸出上層有機相（棄掉）。（ 5）用移液器小心地取出脂肪層下面的水相液轉(zhuǎn)入量筒，量出體積，并記錄。（ 6）取出2ml 放入 2ml 離心管中（標(biāo)記為粗級分I，20下保存），用于測定酶活力及蛋白含量。剩余部分轉(zhuǎn)入清潔的小燒杯中。2. 熱處理（ 1） 將盛有粗級分I 的小燒杯迅速地放入50恒溫水浴中，保持 30 分鐘， 并用玻璃棒溫和攪動。（ 2）取出小燒杯，迅速用冰浴

6、冷卻，轉(zhuǎn)入清潔的離心管中（根據(jù)量大小選擇離心管）， 4，15000rpm,離心 15min。（ 3）將上清液轉(zhuǎn)入量筒，量出體積，并記錄。（ 4）取出2ml 放入 2ml 離心管中（標(biāo)記為熱級分II，20下保存），用于測定酶活力及蛋白含量。剩余部分轉(zhuǎn)入清潔的小燒杯中。3. 乙醇沉淀（ 1）將盛有熱處理后的上清液放入小燒杯，在冰浴下逐滴加入預(yù)冷的等體積（逐滴加入）95%乙醇，溫和攪拌、放置，需1 小時。（2）轉(zhuǎn)入清潔的離心管中，用 4C, 15000rpm ,離心15min,傾去上清，并滴干。4. 3） 離心管中沉淀用58mlTris-HCl（ pH7.3） 緩沖液充分溶解（若溶液混濁，則用離心管

7、，4000rpm離心除去不溶物），轉(zhuǎn)入量筒，量出體積，并記錄。（4）取出2ml放入2ml離心管中（標(biāo)記為醇級分出，一20 c下保存），用于測定酶活力及蛋白含量。剩余部分轉(zhuǎn)入清潔的小燒杯中，用于下一步實驗。（注：離心管中沉淀也可蓋上蓋子或薄膜封口，然后將其放入冰箱中冷凍保存，用時再處理）（五）實驗結(jié)果與分析記錄實驗結(jié)果，并加以解釋，若有異?，F(xiàn)象出現(xiàn)，可進行分析討論。（六）注意事項二、DEAE-纖維素層析純化蔗糖酶（一）實驗?zāi)康膶W(xué)會離子交換柱層析法純化蛋白的方法，掌握各步驟的實驗原理，并為后續(xù)實驗提供一定量的蔗糖酶。（二）實驗原理（略）（三）實驗儀器、材料及試劑儀器1. 核酸蛋白檢測儀、自動部分收

8、集器、蠕動泵、層析柱、梯度混合器2. 滴管、真空泵或抽濾瓶、燒杯等。材料及試劑1. 0.05mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH7.3）2. 0.5mol/L NaOH3.0.5mol/L HCl4. 含 100mmol/L NaCl 的 0.05mol/L Tris-HCl （pH7.3）液5. DEAE- 纖維素6. 2%蔗糖溶液7. Benedict試劑：稱取才?檬酸鈉 173g及碳酸鈉（Na2CO3?H20） 100g加入600mL蒸儲水中，加熱使其溶解，冷卻，稀釋850mL 。另稱取17.3g 硫酸銅溶解于100mL 熱蒸餾水中，冷卻，稀釋至 150mL。 最后， 將硫酸銅溶液

9、徐徐地加入檸檬酸碳酸鈉溶液中，邊加邊攪拌，混勻， 如有沉淀，過濾后貯于試劑瓶中可長期使用。（四）操作步驟1. 離子交換劑的處理（1）稱取6克DEAE纖維素（DE-23）干粉，力口水浸 24小時抽干（真空泵或抽濾瓶）后放入小燒杯中；（ 2）加入0.5mol/L NaOH 溶液（約50ml） ，輕輕攪拌，浸泡0.5小時后抽干，用去離子水洗至近中性，抽干后放入小燒杯中；（ 3）加50ml 0.5 mol/L HCl, 攪勻，浸泡0.5 小時后抽干，用去離子水洗至近中性，放入小燒杯中；（ 4）用0.5 mol/L NaOH 重復(fù)處理一次，用去離子水洗至近中性后，抽干備用。本實驗可直接用0.5mol/L

10、 NaOH 浸泡 1 小時，抽干水洗至中性。因DEAE纖維素昂貴，用后務(wù)必回收。按“堿-酸”的順序洗即可，因為酸洗后較容易用水洗至中性。堿洗時因過濾困難，可以先浮選除去細(xì)顆粒，抽干后用0.5 mol/L NaOH 溶液處理，然后水洗至中性備用。2裝柱與平衡（ 1）先將層析柱垂直裝好，用滴管吸取燒杯底部大顆粒的纖維素裝柱（裝量為柱長2/3 或離柱頂端3 4cm,柱內(nèi)纖維素要均勻，不要出氣泡） ；（ 2）用0.05 mol/L pH 7.3 Tris-HCl 起始緩沖液平衡（約100ml 流出液即可），以流出液pH 與緩沖液一致為準(zhǔn)。3. 上樣與洗脫（1）將剩余小燒杯中的醇級分出用滴管取1.5ml

11、小心地沿柱壁加到層析柱中，不要擾動柱床。（注意上樣量：分析用量一般為床體積的1%2% ，制備用量一般為床體積的20%30%）（ 2）用滴管小心地沿柱壁加入起始緩沖液約5ml；（ 3）用0.05mol /L Tris-HCl ， pH7.3 的緩沖液進行NaCl（ 0100mmol/L ）線性梯度洗脫。層析柱聯(lián)上梯度混合器，混合器中分別為50ml 0.05ml/L Tris-HCl ， pH7.3 的緩沖液和50ml0.05mol/L Tris-HCl ， pH7.3 的緩沖液，其中含100mmol/L NaCl 。洗脫流速為0.5 ml /分1ml/分，使用部分收集器連續(xù)收集洗脫液，每管接收

12、4ml。記錄每管 A 280。至混合器中液體流完為止。（4）每隔4管（或取A280值高的幾個峰值）做酶活力的定性測定，確定活性最高的幾管合并（約 20ml 即可） ，轉(zhuǎn)入量，量出體積，并記錄。（ 5）取出2ml 放入 2ml 離心管中（標(biāo)記為柱級分IV，20下保存），用于測定酶活力及蛋白含量。剩余部分用于下一步實驗。（標(biāo)記為柱級分IV） 。蔗糖酶活力的定性測定方法：取1干凈試管加入2%蔗糖溶液1.5ml,蔗糖酶溶液0.5 ml, 37c恒溫水浴保溫15分鐘后，加入Benedict試劑1ml,沸水浴23分鐘。觀察桔紅色沉淀多少。（五）實驗結(jié)果與分析記錄實驗結(jié)果，并加以解釋，若有異?，F(xiàn)象出現(xiàn)，可進

13、行分析討論。（六）注意事項三、蔗糖酶活性及蛋白質(zhì)濃度的測定（一）實驗?zāi)康膶W(xué)會用考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法測定蛋白質(zhì)濃度，用Nelson 方法測定酶活力。掌握各步驟的實驗原理和方法。（二）實驗原理本實驗以Nelson 方法測定酶活力，其原理是還原糖含有的自由醛基或酮基，在堿性溶液中將Cu2+還原成氧化亞銅，糖本身被氧化成羥酸，神鋁酸試劑與氧化亞銅生成藍(lán)色溶液，在510nm下有正比于還原糖的吸收，從而可確定酶的活力，測定范圍：25200的。本實驗用考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法測定蛋白濃度，考馬斯亮藍(lán)能與蛋白質(zhì)的疏水微區(qū)相結(jié)合，這種結(jié)合具有高敏感性?？捡R斯亮藍(lán) G250的磷酸溶液呈棕紅色，最大吸收峰在465nm。當(dāng)它與蛋

14、白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物時呈藍(lán)色，其最大吸收峰改變?yōu)?95nm,考馬斯亮藍(lán) G250-蛋白質(zhì)復(fù)合物的高消光效應(yīng)導(dǎo)致了蛋白質(zhì)定量測定的高敏感度。在一定范圍內(nèi)，考馬斯亮藍(lán)G250蛋白復(fù)合物呈色后，在 595nm 下，吸光度與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系，故可以用于蛋白質(zhì)濃度的測定。（三）實驗儀器、材料及試劑儀器1. 722 型（或 7220 型）分光光度計、電子分析天平、恒溫水浴箱2. 量筒、容量瓶、移液器、試管。材料及試劑1. 考馬斯亮藍(lán)（G250）染液（0.01%）:稱取0.1g考馬斯亮藍(lán) G250溶于50ml 95%乙醇中，再加入 100ml 濃磷酸（市售質(zhì)量百分渡為85%） ，然后加蒸餾水定容至1000

15、ml。2. 0.9% NaCl 溶液3. 牛血清標(biāo)準(zhǔn)蛋白液（0.1mg/ml）:準(zhǔn)確稱取牛血清蛋白0.1g,用0.9% NaCl溶液溶解并稀釋至1000ml。4. 4mmol/L 葡萄糖、4mmol/L 蔗糖、 0.5mmol/L 蔗糖。5. 0.2mol/L 乙酸緩沖溶液（pH4.5）：（ 1） 0.2mol/L NaAC ：稱取 27.616g NaAC 溶解并定容至1000ml。（ 2） 0.2mol/L HAC ： 100ml 乙酸 （分析純）定容至500ml。（ 3）將兩者分別取315ml、 185ml 混合，用強堿調(diào)pH 到 4.5。6. Nelson 試劑：A試齊1J: 100m

16、l溶齊1J中含 Na2CO3 2.5g, NaHCO3 2.0g ,酒石酸鉀鈉（酒石酸鈉）2.5g, Na2SO4 20g。B 試齊J: 100ml 溶劑中含 CuSO4?5H2O 15g ,濃 H2SO4 2 滴。以A: B=50: 2比例混合即可使用，使用前需在37c以上溶解，防止溶質(zhì)析出。7.神鋁酸試劑：100ml中含鋁酸俊 5g ,濃H2SO4 4.2ml,神酸鈉 0.6g。（神酸鈉有毒，實驗 中注意）（四）操作步驟1 .各級分蛋白質(zhì)濃度測定（1）蛋白質(zhì)濃度測定一一標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備取7支干凈試管，按表1編號并加入試劑混勻。以吸光度平均值為縱坐標(biāo)，各管蛋白含量作為橫坐標(biāo)作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。（或

17、將數(shù)據(jù)代入線性回歸方程，求出 Y?和r?）表1考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度一一標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制編號0123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白液/ml一0.10.20.30.40.50.60.9%NaCl/ml1.00.90.80.70.60.50.4考馬斯亮藍(lán)/ml4444444蛋白含量/g g0102030405060室溫靜置5minA 595nm（2）各級分蛋白濃度的測定取9支干凈試管，每級分做兩管，按表 2編號并加入試劑混勻。讀取吸光度值。以各級分的吸 光度的平均值查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出蛋白質(zhì)含量。各級分應(yīng)進行一定倍數(shù)的稀釋，先試做，選其吸光 度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)，即蛋白含量應(yīng)在1080 g的稀釋度為宜。表2 各級分蛋

18、白濃度的測定編號1234粗級分I/ ml熱級分II/ ml醇級分III/ ml柱級分IV/ ml0.9%NaCl/ml考馬斯亮藍(lán)/ml44444444蛋白含量/g g各級分應(yīng)進行一定倍數(shù)的稀釋，先試做，選其吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)，即蛋 白含量應(yīng)在1080 Vg的稀釋度為宜室溫靜置5minA 595nmA 595nm平均值各級分蛋白濃度mg/ml2 .各級分蔗糖酶活性的測定（1）蔗糖酶活性的測定一一標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取9支試管，按表3加樣。以吸光度值（O.D）為縱坐標(biāo)，以還原糖（葡萄糖含量，”mol）作為橫坐標(biāo)作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。（或?qū)?shù)據(jù)代入線性回歸方程，求出 Y?和r?）（2）各級分蔗糖酶活性測定取9

19、支干凈試管，分兩組，按表4編號并加入試劑混勻。各級分酶液應(yīng)進行一定倍數(shù)的稀釋，先試做，選其吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)，即還原糖含量應(yīng)在 0.081.2“mol的稀釋度為宜。讀取吸光度值。以各級分的吸光度的平均值查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出蛋白質(zhì)含量。表3 Nelson法測定蔗糖酶活性一一標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制編號0123456784mmol/L 葡萄糖 /ml一0.020.050.100.150.200.250.30一4mmol/L 蔗糖/ml一一一一一一一一0.2蒸儲水/ml10.980.950.900.850.800.750.700.80葡萄糖量/ g mol00.080.20.40.60.811.2Nelson

20、 試齊U向每管中加入1ml Nelson試劑，蓋上塞子，置于沸水浴中 20分鐘，再冷至室溫 （在堿性條件下糖被氧化，將CiT還原成氧化亞銅（C*0）碑鋁酸試劑向每個管中加入1ml碎鋁酸試劑，5分鐘 （碑鋁酸試劑與氧化亞銅生成藍(lán)色溶液）蒸儲水/ml向每個管中加入7ml蒸儲水，充分混勻A510nm表4各級分蔗糖酶活性測定樣品空白粗級分I熱級分II醇級分III柱級分IV編號012121212乙酸緩沖液/ml0.20.20.20.20.20.20.20.20.2蒸儲水/ml0.60.5mol/L 蔗糖/ml0.20.20.20.20.20.20.20.20.2各級分酶液/ml一?室溫時間/min10分

21、鐘Nelson 試齊U向每管中加入1ml Nelson試劑，蓋上塞子，置于沸水浴中20分鐘后冷至室溫碑鋁酸試劑向每個管中加入1ml碎鋁酸試劑，5分鐘蒸儲水/ml向每個管中加入7ml蒸儲水，充分混勻1A10nm02A10n0A510nm平均值0（3）活力和比活力的計算活力單位（U）:酶在室溫，pH=4.5條件下，每分鐘水解產(chǎn)生 1科mol葡萄糖所需酶量。根據(jù)測得結(jié)果，計算出各步數(shù)據(jù)填入下表各級分樣液體積/ml蛋白mg/ml總蛋白mg活力U總活力U比活力U/mg提純倍數(shù)回收率粗級分I熱級分II醇級分III柱級分IV（五）實驗結(jié)果與分析記錄實驗結(jié)果，并加以解釋，若有異常現(xiàn)象出現(xiàn)，可進行分析討論。（六

22、）注意事項四、蔗糖酶純度測定（一）實驗?zāi)康膶W(xué)會操作步驟，掌握實驗原理，能夠分析實驗結(jié)果。（二）實驗原理（三）實驗儀器、材料及試劑儀器1 .電泳儀、電泳槽2 .微量取樣器、染脫色裝置材料及試劑1 .凝膠貯備液：丙烯酰胺（ Acr） 29.2g亞甲基雙丙烯酰胺（Bis） 0.8g 加蒸儲水至100 ml,外包 錫紙，4c冰箱保存30天內(nèi)使用2 .凝膠緩沖液（1.5mol/LTris-HCl , pH8.8）： 18.15gTris （三羥甲基氨基甲烷）,加約80ml蒸儲水, 用1mol/L HCl調(diào)pH到8.8,用蒸儲水稀釋至最終體積為100ml, 4c冰箱保存.3 .電極緩沖液（5*TBE）:使

23、用1*TBE。4 .質(zhì)量濃度為10%過硫酸錢：此溶液需臨用前配制5 .澳酚藍(lán)溶液：5ml 50%甘油+5ml電極液+數(shù)滴澳酚藍(lán)6 .染色液：0.25g考馬斯亮藍(lán) R250,加入91ml 50%加甲醇，9 ml冰醋酸。7 .脫色液：50 ml甲醇，75ml冰醋酸與875 ml蒸儲水混合。（四）操作步驟1. 8%凝膠的配制、灌膠、上樣（1） 8%PAGE 凝膠溶液成分總體積10ml蒸儲水/ml4.830%丙烯酰胺/ml2.66凝膠緩沖液/ ml2.5TEMED/ ul510%Ap /ul50（2）用滴管吸取凝膠，在電泳槽的兩玻璃板之間灌注后插入梳子，待凝膠聚合后，將梳子取出（3）將各步留液（I、I

24、I、III、IV）稀釋成12mg/ ml蛋白，上樣量20 6（蛋白稀釋液與澳酚藍(lán)溶液1: 1混合上樣）。每級分酶液樣占一個泳道。（注：若酶液蛋白濃度低，可增加上樣量）3 .電泳接上電泳儀，上樣端接電源的負(fù)極，打開電泳儀電源開關(guān)，調(diào)電壓 80V, 30分鐘后加大到120V,待藍(lán)色的澳酚藍(lán)條帶遷移至距凝膠下端約1cm時，停止電泳。4 .剝膠、染色與脫色：小心將膠取出，置于染脫色裝置中，染色 30min,脫色30min后更換一次脫色液，直至背景清晰。（五）實驗結(jié)果與分析繪出凝膠電泳圖譜，分析各步純化后酶的純度情況。（六）注意事項五、蔗糖酶Km值測定及月尿素的抑制作用（一） 實驗?zāi)康牧私饷资铣?shù)的意義

25、， 學(xué)會測定蔗糖酶米氏常數(shù)的方法；了解底物濃度和抑制劑對反應(yīng)速度的影響，掌握確定抑制類型的方法。（二）實驗原理酶促動力學(xué)研究酶促反應(yīng)的速度及影響速度的各種因素，而米氏常數(shù)Km值等于酶促反應(yīng)速度為最大速度的一半時所對應(yīng)的底物濃度，其數(shù)值大小與酶的濃度無關(guān)，是酶促反應(yīng)的特性常數(shù)。 不同酶的Km值不同，同一種酶在與不同的底物反應(yīng)時，其Km值也不同。Km反映了酶和底物親和能力的強弱程度。大多數(shù)純酶的Km值0.01100mmol/L之間。酶的活力可以被某些物質(zhì)激活或抑制，凡能降低酶的活性甚至使酶失活的物質(zhì)，稱為酶的抑制劑， 酶的活力抑制有可逆抑制和不可逆抑制兩種。而可逆的抑制又包括有競爭性抑制，非競爭性

26、抑制等類型，在有抑制劑存在條件下，酶的一些動力學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變，如 Km,縱軸交點為1/Vmax,橫 軸交點為-1/Km 。-1/Km1/S本實驗以米氏公式VmaxSKm+S利用雙倒數(shù)法作圖，（1/V對1/S）,實驗推導(dǎo)得出 Km,并推導(dǎo)出抑制類型，Vmax等，通過實驗的方法，可以確定出抑制類型。（三）實驗儀器、材料及試劑儀器1.722型（或7220型）分光光度計、電子分析天平、恒溫水浴箱2.量筒、容量瓶、移液器、試管。材料及試劑1. 0.2mol/L乙酸緩沖液2. 0.5mol/L蔗糖溶液3. 8mol/L 月尿4. Nelson 試齊！J：（每組 30ml）5. 神鋁酸試劑：（每組30ml）

27、（四）操作步驟1 . Km值的測定（1）時間作用曲線取11支試管，按表5加樣操作。以時間為橫坐標(biāo)，以產(chǎn)物量為縱坐標(biāo)，制作時間作用曲線。 酶液的稀釋倍數(shù)以測定酶活力時得出的稀釋倍數(shù)為準(zhǔn)。表5時間作用曲線的制做編號0123456789100.2mol/L乙酸緩沖液向各管中力口 0.2ml0.5mol/L 蔗糖/ml向各管中加0.1ml蒸儲水/ml向各管中力口 0.6ml酶液（稀釋的IV）0管不加作空白，其余各管中加0.1ml保溫時間（分鐘）0123481012152025Nelsol 試齊U向各管加入Nelsol試劑1ml,置沸水浴中20分鐘，再冷至室溫碑鋁酸試劑向各管中加1 ml碎鋁酸試劑，5分

28、鐘蒸儲水向各管中加7ml水，充分混勻A510nm0（2）底物濃度的影響取9支試管編號，按表 6加樣操作。以1/s對1/v作圖，求Km直。表6酵母蔗糖酶Km值的測定編號0123456780.2mol/L乙酸緩沖液向各管中力口 0.2ml0. 5mol/L 蔗糖/ml0.2-0.020.040.060.080.10.20.4蒸儲水/ml0.40.60.580.560.540.520.50.40.2酶液（稀釋的IV）0管不加作空白，其余各管中加0.2ml保溫時間（分鐘）室溫放置10分鐘Nelso l試齊1J向各管加入Nelso l試劑1ml,置沸水浴中20分鐘，再冷至室溫碑鋁酸試劑向各管中加1 ml

29、碎鋁酸試劑，5分鐘蒸儲水向各管中加7ml水，充分混勻A10nm02 .月尿的抑制取9支試管，按表7加樣操作（做兩組，求平均）。以1/s對1/v作圖，與底物影響之雙倒 數(shù)圖對照比較，推出抑制類型。表7月尿?qū)φ崽敲傅囊种祁愋蜏y定編號0123456780.2mol/L乙酸緩沖液向各管中力口 0.2ml0. 5mol/L 蔗糖/ml0.2-0.020.040.060.080.10.20.48mol/L 月尿/ml0.2向各管中加0.15ml蒸儲水/ml0.40.450.430.410.390.370.350.250.05酶液（稀釋的IV）0管不加作空白，其余各管中加0.2ml保溫時間（分鐘）室溫放置10分鐘Nelso l試齊1J向各管加入Nelso l試劑1ml,置沸水浴中20分鐘，再冷至室溫碑鋁酸試劑向各管中加1 ml碎鋁酸試劑，5分鐘蒸儲水向各管中加7ml水，充分混勻A510nm0（五）實驗結(jié)果與分析確定酵母蔗糖酶 Km值；確定月尿的抑制類型。（六）注意事項六、pH對酶活性的影響和最適pH的測定）實驗?zāi)?/p>