.,實(shí)驗(yàn)五酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定BSA抗體效價(jià)1.目的要求(1)學(xué)習(xí)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定的基本原理。(2)掌握酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定技術(shù)，抗體的效價(jià)測(cè)定及酶聯(lián)免疫測(cè)定儀的使用。,.,2.基本原理免疫酶技術(shù):酶標(biāo)Ab/Ag,酶結(jié)合物的酶在免疫反應(yīng)后，作用于厎物后顯色，根據(jù)顏色的有無和深淺，定量測(cè)定Ab/Ag。免疫反應(yīng)：一次或數(shù)次具Ag,Ab特異的免疫學(xué)反應(yīng)酶促反應(yīng)：只進(jìn)行一次顯示出生物放大作用，靈敏度ng,pg,.,60年代初期，Averameas&Ram等建立了免疫酶技術(shù)(immunoenzymatictechniques)利用特殊的交聯(lián)劑研制出辣根過氧化物酶-人血清白蛋白及酸性磷酸酯酶-抗體，統(tǒng)稱為酶標(biāo)記物或酶結(jié)合物，用于抗原或抗體的示蹤、定位或定量測(cè)定,.,酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linkedimmunosorbentassay簡(jiǎn)稱為Elisa)-是在免疫酶技術(shù)(immunoenzymatictechniques)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測(cè)定技術(shù)。本法兼有靈敏度高和特異性強(qiáng)兩方面的優(yōu)點(diǎn)。,.,1974年Voller等用聚苯乙烯微量反應(yīng)板作為免疫吸附劑吸附抗體(抗原)，再與相應(yīng)的酶標(biāo)記物結(jié)合操作更方便，易重復(fù)靈敏度可高達(dá)ng（10-9g）至pg(10-12g)，,.,(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay),.,免疫標(biāo)記技術(shù),.,應(yīng)用各種液相和固相免疫分析方法，對(duì)體液中的半抗原、抗原或抗體進(jìn)行定性和定量測(cè)定,標(biāo)記抗體或抗原,熒光素、放射性同位素、酶、鐵蛋白、膠體金及化學(xué)(或生物)發(fā)光劑,鏡檢觀察或進(jìn)行自動(dòng)化測(cè)定,熒光顯微鏡，射線測(cè)量?jī)x，酶標(biāo)檢測(cè)儀，電子顯微鏡和發(fā)光免疫測(cè)定儀等,直接在細(xì)胞、亞細(xì)胞、超微結(jié)構(gòu)及分子水平上,對(duì)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行定性和定位研究,.,酶-性能穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)易得、底物無色、產(chǎn)物顯色，便于檢測(cè)常用的酶:堿性磷酸酯酶、辣根過氧化物酶(horseradperoxidase簡(jiǎn)稱HRP)、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶等。,酶標(biāo)技術(shù),.,戊二醛法，過碘酸氧化法將酶與Ab交聯(lián)在一起,Ag-Ab-抗Ab-HRP,TMB+H2O2,產(chǎn)物（黃色，OD450)+H2O,.,圖一直接型Elisa,.,圖二間接型Elisa,.,圖三雙抗體夾心型ELISA,.,圖四固相抗體競(jìng)爭(zhēng)型ELISA未知抗原量=A（1）-A（2）,.,每次反應(yīng)后都要反復(fù)洗滌？保證反應(yīng)的定量反應(yīng)防止重疊反應(yīng)，引起非特異現(xiàn)象。,.,Partiallypurified,inactivatedHIVantigensantigenspre-coatedontoanELISAplate部分純化，滅活病毒抗原抗原涂到酶標(biāo)板Patientserumwhichcontainsantibodies.IfthepatientisHIV+,thenthisserumwillcontainantibodiestoHIV,andthoseantibodieswillbindtotheHIVantigensontheplate.病人血清中含有抗體。如果病人是艾滋病毒+，那么這個(gè)血清含有艾滋病毒抗體，這些抗體可以綁定到病毒抗原板Anti-humanimmunoglobulincoupledtoanenzyme.Thisisthesecondantibody,anditbindstohumanantibodies.抗人免疫球蛋白耦合酶。這是繼抗體，并結(jié)合人類抗體substratewhichchangescolorwhencleavedbytheenzymeattachedtothesecondantibody.基板而改變顏色，當(dāng)裂解酶附二抗體,HIV(humanimmunodeficiencyvirus)detection,.,positive,negative,.,Proteinproteininteraction-ELISA,1.DirectelisadifferentepitopeCoatwithpreyproteinIncubatewithbaitproteinPimaryAbantibaitprotein-直接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)不同表位外套與獵物蛋白孵化與誘餌蛋白原發(fā)性抗體抗誘餌蛋白,.,2.CompetitiveelisasameepitopeCoatwithbaitprIncubatewithprimaryantibodyantibaitprandvariousconcentrationpreyprotein(競(jìng)爭(zhēng)同一表位。外套與誘餌蛋白培養(yǎng)初級(jí)抗體抗誘餌蛋白及不同濃度的獵物蛋白),.,.,4.操作方法4.1包被特異性抗原:固體抗原(如蛋白質(zhì))用包被液稀釋至10Og/ml，每凹孔加100L，加蓋置4過夜(372h)，次日傾去凹孔內(nèi)液體，用滴管取洗滌液在每孔中加34滴，靜置3min后傾去，重復(fù)3次，將反應(yīng)板扣放在濾紙上，以除凈液體。4.2封閉:每孔中加入200400L封閉液，加蓋或用封口膜封板，置37恒溫箱60min，傾去孔內(nèi)液體，按上法洗滌3次。,.,4.3加待測(cè)血清(內(nèi)含抗體)、陰性血清(無抗體)及稀釋液(PBS/Tween):待測(cè)血清按倍比法用稀釋液稀釋(1:100、1:200等)，陰性血清也稀釋成1:100，取不同稀釋度的待測(cè)血清，陰性血清及稀釋液(PBS/Tween)各1OOL加至相應(yīng)的凹孔中，加蓋或封板，置37恒溫箱1h，使抗體與固相抗原進(jìn)行特異性結(jié)合，反復(fù)洗滌3次。,.,12345678,PBS/Tween1:100陰性血清1:1,0001:5,0001:10,0001:20,0001:50,0001:100,000,陽(yáng)性血清,.,4.4加酶標(biāo)抗體:按說明書要求用稀釋液稀釋HRP-抗體(抗抗體)，每孔加l00L，封板后置37溫育lh，按上法至少洗滌5次，最后用蒸餾水洗滌2次，扣在濾紙上吸干水分。4.5顯色:每孔加入OPD應(yīng)用液1OOuL、反應(yīng)板置室溫暗處530min。當(dāng)顯示橙色時(shí)應(yīng)及時(shí)終止反應(yīng)。4.6終止反應(yīng):每孔加入5OL2mol/LH2SO4。穩(wěn)定35min即可比色測(cè)定。,.,4.7檢測(cè):用酶聯(lián)免疫測(cè)定儀，以PBS/Tween孔為對(duì)照、測(cè)波長(zhǎng)為49Onm時(shí)各孔光吸收（A）。計(jì)算陽(yáng)性血清與陰性血清A值之比(Positive/negative，P/N)，當(dāng)P/N2.1時(shí)為陽(yáng)性，P/N2.1而1.5為可疑，P/N1.5為陰性。用目測(cè)法則以較陰性對(duì)照深色的最高稀釋度作為抗體效價(jià)。用“”“”表示，超過規(guī)定吸收值（0.20.4）的標(biāo)本均屬陽(yáng)性。,.,注意事項(xiàng)(1)聚苯乙烯微量反應(yīng)板應(yīng)選擇高質(zhì)量、非特異性吸附小的產(chǎn)品。包被物應(yīng)具有較高的純度，其濃度一般在1100g之間，在偏堿條件下易吸附于反應(yīng)板的凹孔中，4放置過夜較理想，若暫時(shí)不用，可加入終濃度為0.02%NaN3，4貯存，也可傾去包被液，干燥后置硅膠干燥器中，室溫存放3個(gè)月以上不影響測(cè)定效果。(2)反應(yīng)各步均應(yīng)充分洗滌，以除去殘留物，減少非特異性吸附。為使結(jié)果重復(fù)應(yīng)固定洗滌次數(shù)及放置時(shí)間，切忌相互污染。(3)為使顯色反應(yīng)便于比較，顯色后置室溫暗處的時(shí)間應(yīng)一致，終止反應(yīng)35min后應(yīng)立即比色。必要時(shí)可設(shè)陽(yáng)性對(duì)照，以固定顯色及終止時(shí)間。(4)待測(cè)抗體或抗原與酶標(biāo)抗體應(yīng)具有相同的免疫特異性，否則無法結(jié)合。,.,自動(dòng)酶標(biāo)儀（Elx800UV）使用程序1開機(jī)，進(jìn)行Systemself-test2按“DEFINE”鍵，進(jìn)入“SELECTASSAYNUMBER”，用“NUMERIC”或“OPTION”鍵輸入測(cè)試號(hào)（注：assay01為quickread，最大測(cè)試號(hào)為55）；按“ENTER”鍵修改測(cè)試的“NAME”；再按“ENTER”鍵進(jìn)入下列菜單：按“METHOD”鍵選擇測(cè)試的波長(zhǎng)類型（Single或Dual）、波長(zhǎng)大小(340、405、450、490或630nm)、微孔板類型(96孔、48孔或24孔)。按“MAP”鍵選擇閱讀方式(Auto或Manual)、閱讀方向（Down或Across）、重復(fù)方向（Down或Across）、閱讀起始位置（輸入編號(hào)）、空白Map（Air、Full、Const、Column、P-Down、P-Across）。,.,3按“READ”鍵，酶標(biāo)板推進(jìn)入儀器，開始讀數(shù)并計(jì)數(shù)，打印機(jī)輸出數(shù)據(jù)。4按“MAINMENU”鍵回到主菜單，關(guān)閉電源。,.,酶標(biāo)板的清洗：采用ELx50TM型微孔板洗板機(jī)，注射泵驅(qū)動(dòng)的液體輸送，條狀單排清洗或全板清洗,.,了解轉(zhuǎn)膜電泳原理的應(yīng)用及操作,WesternBlottingorimmunoblotting,aspecificprimaryantibody,1979,Towbin,1975,Southern,Southernblotting1977,Alwine,Northernblotting1979,Towbin,WesternBlotting1982,Reihart,Easternblotting,雙向蛋白質(zhì)印記,.,.,.,.,Westernblotting:Antibodiescanbeusedtodetectspecificproteins,.,AlternatedetectionmethodSecondaryantibodies,.,Memebrane:吸附生命大分子的固體材料NC,nitrocellulose硝酸纖維素膜0.45um結(jié)合率：80ugPr/cm2便宜，可簡(jiǎn)單快速封閉非特異性抗體的結(jié)合NDM,nylon-densedmembrane尼龍膜結(jié)合率：480ugPr/cm2DBM,diazobenzyloxymethyl重氮芐氧甲基膜,.,.,濕法轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)：將gel和membrane夾在blotterpaper中，浸在轉(zhuǎn)移裝置的buffer中，通電45min或overnight可完成。,TransferBuffer(500ml,pH8.3)glycine1.450g(39mM)Trisbase2.900g(48mM)SDS0.185g(0.037%),.,UsingtheSemi-DryTransferUnitRemovethestackinggelfromthegel.去除堆積凝膠的凝膠。2.Cutpiecesofblotterpapertothesizeofthegel.note:theblotterpaper(andthemembrane)notbelargerthanthegel.Largerpiecesmaymakecontactaroundthegel,andallowthecurrentanalternateroute,therebymakingtransferinefficient.裁片的記事簿紙張的大小的凝膠。注：本記事簿紙（和膜）不大于凝膠。大塊的可能使接觸周圍的凝膠，并允許目前的替代路線，從而使傳輸效率。3.Wearingglovesrinsedofpowder,cutapieceofmembranetothesizeofthegel.Markthelowerright-handcornertoallowfororientation.Pre-wetthemembraneintransferbufferfor2to5minutes.戴手套清洗粉，剪下一塊膜大小的凝膠。標(biāo)記右下角以便方向。濕膜轉(zhuǎn)移緩沖液為2到5分鐘。,.,4.sandwichblotterpapermembrane-gel-blotterpapermakesurenoairbubblesaretrappedThemembranemustthereforebepositionedcorrectlythefirsttime.Donottrytoadjust.三明治吸墨紙紙膜凝膠-記事簿紙確保沒有氣泡被困膜因此必須正確定位第一時(shí)間。不要試圖調(diào)整。,.,5.Holdthecoverlevelandslideitgentlydownontothestack.持有的封面和滑動(dòng)它輕輕地放到堆棧6.weighdownthelidinordertoensureevencontactwiththestack.權(quán)衡下來的蓋子，以確保即使接觸堆棧。7.Connecttheunittoasuitablepowersupply.Turnthepowersupplytozerobeforeturningon.Turnonthepowersupplyandsettoapproximately0.8mA/cm2ofgel.Largergelsmustbelimitedto0.8mA/cm2toavoidexcessiveheatbuildup.。連接到一個(gè)合適的電源供應(yīng)裝置。打開電源供應(yīng)零之前打開。打開電源并設(shè)定約0.8毫安/厘米2凝膠。較大的凝膠必須被限制在0.8毫安/厘米2避免過度生熱。,.,8mmx7mmmini-gelsat100mA.,.,Problem：蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移效率低