附件4-1-1-1：江蘇省普通高校學(xué)術(shù)學(xué)位研究生科研創(chuàng)新計劃項目申報書 申 請 人： 研 究 生 層 次： 博士研究生 碩士研究生一級學(xué)科名稱： 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué) 二級學(xué)科名稱： 免疫學(xué) 研 究 方 向 ： 糖生物學(xué) 申請項目名稱：TAK1的糖基化修飾在調(diào)節(jié)巨噬細胞炎癥微環(huán)境中的作用 指 導(dǎo) 教 師 ： 季玉紅 所 在 學(xué) 校 ： 南通大學(xué) 江蘇省學(xué)位委員會制表江蘇省教育廳二O一四年四月填 表 說 明一、填寫本表前，應(yīng)先仔細閱讀江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃項目實施與管理辦法等有關(guān)文件及本說明，務(wù)必實事求是填寫。二、填寫本表欄目時，如需要可加附頁。三、本表所有信息必須全部填寫，不存在的內(nèi)容一律填“無”。項目概況項目名稱 TAK1的糖基化修飾在調(diào)節(jié)巨噬細胞炎癥微環(huán)境中的作用 項目類別A.人文社科項目B.自然科學(xué)項目起止年限 2014 年 05 月 至 2015 年 05 月 二級學(xué)科代 碼1001二級學(xué)科名 稱 100102重點學(xué)科國家級 省 級 申請人姓 名徐志偉性 別男出生年月1991年1月博（碩）士入學(xué)年月2013年9月所 在院 系 醫(yī)學(xué)院聯(lián)系電子信箱1、 立項依據(jù)（包括項目來源，研究意義，國內(nèi)外研究現(xiàn)狀、水平和發(fā)展趨勢等） 炎癥反應(yīng)是機體免疫系統(tǒng)針對外界刺激如感染和組織損傷而產(chǎn)生的一種復(fù)雜的生理性反應(yīng),由趨化因子、細胞因子、脂類炎癥介質(zhì)等參與。巨噬細胞是炎癥反應(yīng)的主要效應(yīng)細胞,激活的巨噬細胞在炎癥開始后迅速抵達炎癥部位,參與吞噬病原體和分泌各種參與炎癥反應(yīng)的介質(zhì)和細胞因子1-2】。炎癥反應(yīng)中所產(chǎn)生的 大量炎癥介質(zhì)在有效清除病原體的同時,也可造成正常細胞和組織的病理性損傷。因此,對炎癥反應(yīng)這把機體防御雙刃劍的有效調(diào)控就顯得尤為重要。巨噬細胞至少可以被分為兩種類型:Ml型,即經(jīng)典活化的巨噬細胞(Classicallyactivatedmacrophage)和MZ型,即替代性活化的巨噬細胞(Altemativelyaetivatedmacrophage)MI型巨噬細胞在細菌或其產(chǎn)物脂多糖(Lipopolysaceharides,LpS)或干擾素(Interferon一了,IFN一丫)的誘導(dǎo)下產(chǎn)生,表現(xiàn)為:高遞呈抗原的能力3-4】;高分泌白細胞介素12(Inierlukin一12,IL一12)和白細胞介素23(Inierlukin一23,IL一23)及其隨后誘導(dǎo)的I型免疫應(yīng)答;高產(chǎn)生毒性中間產(chǎn)物一氧化氮(Nitrieoxide,No),活性氧中間產(chǎn)物(Reaetiveoxygen intermediates,Rol):的能力因此,Ml型巨噬細胞被認為具有殺傷細菌和腫瘤細胞并可以分泌多種促炎性細胞因子的能力而MZ型巨噬細胞可由白細胞介素4(Interlukin一4,IL一4)!白細胞介素13(Interlukin一13,IL一13)!糖皮質(zhì)激素!轉(zhuǎn)化生長因子一p(Transformatinggro誠hfacto卜p,TGF一p)和前列腺素EZ(ProstaglandinEZ,PGEZ)等誘導(dǎo)產(chǎn)生5,表現(xiàn)為:低的遞呈抗原的能力;產(chǎn)生抑制細胞增殖和活性的細胞因子,如白細胞介素10(Interfukin一10,IL一10);較好的清除碎片的能力;促進血管生成和創(chuàng)傷愈合的能力。 轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-活化激酶（TAK），也叫做絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶7(MAP3K7)，是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的一員6。TAK在TNF的產(chǎn)生和其他炎性介質(zhì)激活MAPK中有關(guān)鍵作用，比如p38a MAPK，c-Jun氨基末端激酶(JNK1/JNK2)，ERK1/2和轉(zhuǎn)錄因子核因子kB (NFkB) kB (NFkB) ，TAK在幾種細胞因子介導(dǎo)的先天免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)中很重要，包括TNF，IL-1和TGF-通路，也包括Toll樣受體的下游信號和NOD1/2。在這些通路中，多個促炎細胞因子和內(nèi)毒素觸發(fā)TAK的活動，引起自身磷酸化作用和IkB 激酶復(fù)合物的繼發(fā)補充，最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子NFkB的激活。原生形態(tài)的TAK包含一個催化激酶亞單位與調(diào)節(jié)亞基TAB（TAK1結(jié)合蛋白1，一種擬磷酸化酶）形成的復(fù)合物和兩種同源蛋白TAB2 or TAB3之一。脂多糖或IL-1引起的TAK1的活化由Lys63相關(guān)的多聚泛素化腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6多聚泛素化觸發(fā)，它與TAB2和TAB3的碳端的鋅指結(jié)構(gòu)結(jié)合，刺激TAK1的自身磷酸化和活化7。 蛋白質(zhì)的糖基化可以影響蛋白質(zhì)的折疊、成熟、配體-受體結(jié)合及胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在維持生理功/或疾病的發(fā)生中均發(fā)揮重要作用8。越來越多的研究表明，蛋白質(zhì)的糖基化修飾與巨噬細胞炎癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)糖基化修飾與機體的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，例如白細胞表面的整合素及選擇素等細胞表面分子在被糖基化修飾后，能促進其向炎性部位募集，以完成免疫細胞識別/清除病原體等過程。最近的研究也表明蛋白質(zhì)糖基化修飾參與膠巨噬細胞炎癥微環(huán)境的形成及炎癥的發(fā)生及發(fā)展9.巨噬細胞細胞表面的高級糖基化終產(chǎn)物（advanced glycosylation end product，AGE）能與巨噬細胞細胞表面高度聚糖化作用終產(chǎn)物的受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）相結(jié)合，抑制巨噬細胞釋放細胞因子，上述研究結(jié)果表明蛋白糖基化修飾可影響巨噬細胞局部的炎癥反應(yīng)，在炎癥過程中發(fā)揮重要作用10】。目前國內(nèi)外研究巨噬細胞炎癥作用過程中所涉及的信號通路主要有，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信號通路以及細胞核因子-kappa B（nuclear factor-kappa B，NF-B）信號通路11。轉(zhuǎn)化生長因子激活激酶（TAK1，MEKK7）是MAP3K家族的成員之一，能被多種細胞因子包括IL-1，IL-18，TNF-等激活，處于這兩條途徑的分支點上12 。TAK1作為炎癥反應(yīng)中細胞信號傳導(dǎo)上游重要的激酶，可能對巨噬細胞炎癥起著重要的調(diào)節(jié)作用。其中經(jīng)典NF-B信號通路的激活在炎癥過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。已有的研究表明脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激的炎癥模型中，TAK1的活性明顯上調(diào)，以及炎癥因子的表達穩(wěn)定性增高13-14。但TAK1的糖基化對其炎癥具體的分子調(diào)節(jié)機制尚不清楚。綜上所述，TAK1是否存在糖基化的修飾？LPS刺激巨噬細胞炎性激活調(diào)節(jié)過程是否需要TAK1糖基化的參與？具體的調(diào)節(jié)機制是什么？這些問題都值得我們深入研究?！緟⒖嘉墨I】1 Ayub A, Ashfaq UA, Haque A. HBV induced HCC: major risk factors from genetic to molecular level. Biomed Res Int. 2013;13(1):810461. 2 Thomas DL. Global control of hepatitis C: where challenge meets opportunity. Nat Med. 2013;19(7):850-858.3 Barone C, Koeberle D, Metselaar H, Parisi G, Sansonno D, Spinzi G. Multidisciplinary approach for HCC patients: hepatology for the oncologists. Ann Oncol. 2013;24(2): 15-23.4 Tian Y, Yang W, Song J, Wu Y, Ni B. Hepatitis B virus X protein-induced aberrant epigenetic modifications contributing to human hepatocellular carcinoma pathogenesis. Mol Cell Biol. 2013;33(15):2810-2816.5 Lazo-Gmez R, Ramrez-Jarqun UN, Tovar-Y-Romo LB, Tapia R.Histone deacetylases and their role in motor neuron degeneration. Front Cell Neurosci. 2013;7(3):243.6 Hojfeldt JW, Agger K, Helin K. Histone lysine demethylases as targets for anticancer therapy. Nat Rev Drug Discov. 2013;12(12):917-30.7 Parbin S, Kar S, Shilpi A, Sengupta D, Deb M, Rath SK, Patra SK. Histone deacetylases: a saga of perturbed acetylation homeostasis in cancer. J Histochem Cytochem. 2014 ;62(1):11-33.8 Kelly RD, Cowley SM. The physiological roles of histone deacetylase (HDAC) 1 and 2: complex co-stars with multiple leading parts. Biochem Soc Trans. 2013;41(3):741-749.9 Reichert N, Choukrallah MA, Matthias P. Multiple roles of class I HDACs in proliferation, differentiation, and development. Cell Mol Life Sci. 2012;69(13):2173-2187. 10 Schneider G, Krmer OH, Schmid RM, Saur D. Acetylation as a transcriptional control mechanism-HDACs and HATs in pancreatic ductal adenocarcinoma. J Gastrointest Cancer. 2011;42(2):85-92. 11 Di Marcotullio L, Canettieri G, Infante P, Greco A, Gulino A. Protected from the inside: endogenous histone deacetylase inhibitors and the road to cancer.Biochim Biophys Acta. 2011;1815(2):241-252.12 Gao C, Dimitrov T, Yong KJ, Tatetsu H, Jeong HW, Luo HR, Bradner JE, Tenen DG, Chai L. Targeting transcription factor SALL4 in acute myeloid leukemia by interrupting its interaction with an epigenetic complex. Blood. 2013;121(8):1413-1421. 13 Jiang Y, Iakova P, Jin J, Sullivan E, Sharin V, Hong IH, Anakk S, Mayor A, Darlington G, Finegold M, Moore D, Timchenko NA. Farnesoid X receptor inhibits gankyrin in mouse livers and prevents development of liver cancer. Hepatology. 2013;57(3):1098-1106.14 Buurman R, Grlevik E, Schffer V, Eilers M, Sandbothe M, Kreipe H, Wilkens L, Schlegelberger B, Khnel F, Skawran B. Histone deacetylases activate hepatocyte growth factor signaling by repressing microRNA-449 in hepatocellular carcinoma cells. Gastroenterology. 2012;143(3):811-820.注：項目名稱應(yīng)簡潔明了，字數(shù)限25個漢字內(nèi)。2、 研究目標、研究內(nèi)容和擬解決的主要問題研究目標： (1) 明確TAK1是否存在糖基化修飾（2）明確TAK1的糖基化修飾在細胞炎癥微環(huán)境中的作用；（3）明確TAK1的糖基化修飾在巨噬細胞炎癥微環(huán)境中作用；（4）明確TAK1的糖基化修飾在巨噬細胞炎癥因子分泌中的作用；研究內(nèi)容： 1.TAK1糖基化修飾在巨噬細胞炎癥微環(huán)境中的作用。（1） TAK1糖基化位點的鑒定。分離、純化TAK1的蛋白，利用糖基化抗體及質(zhì)譜分 析檢測TAK1是否存在糖基化修飾及其可能的糖基化修飾位點；利用凝集素印跡及質(zhì)譜鑒定其糖型及糖鏈結(jié)構(gòu)。（2） TAK1糖基化修飾與巨噬細胞微環(huán)境之間的關(guān)系。分析炎癥環(huán)境中TAK1的糖基化修飾在巨噬細胞；同時分析TAK1的糖基化修飾對巨噬細胞細胞因子分泌的影響。（3） TAK1糖基化修飾對巨噬細胞微環(huán)境影響的分子機制。干預(yù)TAK1的糖基化修飾檢測巨噬細胞中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)的靶基因的表達及巨噬細胞生物學(xué)行為的改變；在此基礎(chǔ)上構(gòu)建炎癥模型，分析干預(yù)TAK1的表達對巨噬細胞生物學(xué)行為的影響。（4） TAK1的糖基化修飾在巨噬細胞中磷酸化的作用。分析巨噬細胞中TAK1表達及糖基化修飾與磷酸化修飾之間的關(guān)系，抑制TAK1的糖基化后檢測該分子磷酸化的變化。 擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題：1. TAK1是否可通過 O-糖基化修飾影響巨噬細胞激活我們前期的研究在預(yù)測TAK1存在糖基化修飾位點的基礎(chǔ)上，驗證PPAR能發(fā)生 O糖基化修飾，深入分析其糖基化位點，發(fā)現(xiàn)其分別位于 TAK1 與TAB2結(jié)合域內(nèi)，而先前的研究也發(fā)現(xiàn)突變 PPAR 的糖基化位點可減少其對巨噬細胞激活的抑制，這表明 PPAR 可通過糖基化修飾影響巨噬細胞激活。在后續(xù)研究中我們將鑒定 PPAR 的糖鏈結(jié)構(gòu)，并分析抑制其與TAB2結(jié)合，是否影響巨噬細胞激活。 2. 促進 TAK1 的糖基化修飾是否能調(diào)節(jié)巨噬細胞炎性激活及其細胞因子的分泌？先前的研究也已經(jīng)報道在 巨噬細胞炎癥反應(yīng)過程中， TAK1發(fā)生糖基化修飾后可促進巨噬細胞的激活，這提示 促進 TAK1的糖基化修飾影響巨噬細胞激活及其介導(dǎo)的細胞因子的分泌。抑制TAK1的糖基化后，下調(diào)炎癥基因的表達，抑制巨噬細胞的激活及其介導(dǎo)的細胞因子。 3.巨噬細胞的轉(zhuǎn)染效率 課題組在前期研究中已經(jīng)構(gòu)建了以Flag為標簽的TAK1全長質(zhì)粒，并用于HEK293T細胞中的過表達，已經(jīng)取得了較好的結(jié)果。同時在前期研究中，課題組已經(jīng)進行了巨噬細胞轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化，并取得了較高的轉(zhuǎn)染效率。在進一步實驗中，課題組將完善實驗技術(shù)與方法，較好實現(xiàn)目標基因過表達的目的。 3、 課題的研究思路與方法、技術(shù)路線、試驗方案（含創(chuàng)新性）及其可行性分析研究思路與方法:1. 分析小膠質(zhì)細胞中 TAK1是否可發(fā)生 O-糖基化修飾。 a） 構(gòu)建TAK1真核表達載體，轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，免疫共沉淀后運用O-GlcNac抗體進行檢測；同時將分離純化得到的TAK1蛋白運用Click-iTTM O-GlcNAc Enzymatic Labeling System試劑盒進行反應(yīng)，對TAK1進行可視化標記，檢測TAK1是否可發(fā)生糖基化；b） 將轉(zhuǎn)染TAK1表達載體的HEK293T細胞分別用OGT的激活劑GlcNacstain及OGA的抑制劑CpOGA處理，分別運用免疫共沉淀純化TAK1蛋白，運用O-GlcNac抗體進行檢測明確TAK1可發(fā)生糖基化修飾；c） 分別選取巨噬細胞的細胞株，運用免疫印跡檢測TAK1的表達，在此基礎(chǔ)上選取TAK1表達較高的細胞系運用TAK1抗體進行免疫共沉淀，免疫印跡檢測TAK1的糖基化修飾。2. TAK1的O-GlcNAc修飾位點的確定。a） 利用生物信息學(xué)方法分析預(yù)測TAK1的糖基化修飾位點，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建點突變載體，分別轉(zhuǎn)染HEK293T細胞后，免疫共沉淀聯(lián)合免疫印跡分析TAK1的糖基化位點；b） 在此基礎(chǔ)上分貝運用OGT的激活劑GlcNacstain及OGA的抑制劑CpOGA處理細胞，免疫共沉淀聯(lián)合免疫印跡分析TAK1的可能的糖基化位點；分離純化巨噬細胞中TAK1蛋白，運用ETD-MS/MS分析TAK1發(fā)生O-GlcNac修飾的糖基化位點。3.分析TAK1糖基化修飾與巨噬細胞炎癥微環(huán)境之間的關(guān)系（a）將野生型及糖基化位點突變型的TAK1分別轉(zhuǎn)染入巨噬細胞，收集細胞，采用MTT法、流式細胞術(shù)檢測巨噬細胞細胞增殖情況；Realtime PCR法及ELISA法，檢測巨噬細胞內(nèi)炎癥相關(guān)細胞因子（IL-1、IL-6、TNF-、IFN、IL-10等）的合成及分泌改變，分析TAK1糖基化修飾與巨噬細胞生物學(xué)行為改變之間的關(guān)系。（b）將野生型及糖基化位點突變型的TAK1分別轉(zhuǎn)染入巨噬細胞，利用炎癥細胞因子IL-1、LPS等刺激上述轉(zhuǎn)染后巨噬細胞，模擬炎性微環(huán)境，不同時間點收集細胞，采用上述方法檢測巨噬細胞的增殖、能力的改變，分析炎癥環(huán)境中TAK1的糖基化修飾在巨噬細胞炎癥微環(huán)境發(fā)生發(fā)展中的作用。（c）將野生型及糖基化位點突變型的TAK1分別轉(zhuǎn)染入巨噬細胞，利用炎癥細胞因子IL-1、LPS等刺激上述轉(zhuǎn)染后巨噬細胞，分別采用Realtime PCR法及ELISA法，檢測巨噬細胞內(nèi)炎癥相關(guān)細胞因子（IL-1、IL-6、TNF-、IFN-、IL-10等）的合成及分泌改變。（d）將野生型及糖基化位點突變型的TAK1分別轉(zhuǎn)染入巨噬細胞，利用炎癥細胞因子IL-1、TNF-等刺激上述轉(zhuǎn)染后巨噬細胞，利用中和抗體阻斷上述細胞因子的生物學(xué)效應(yīng)，并檢測上述增殖、炎性因子釋放等指標變化，以分析巨噬細胞炎癥微環(huán)境中TAK1的糖基化修飾在其炎癥反應(yīng)放大循環(huán)中的作用。4.分析TAK1的糖基化修飾對巨噬細胞炎癥微環(huán)境影響的分子機制（a）將野生型及糖基化位點突變型TAK1真核表達載體轉(zhuǎn)染入巨噬細胞，采用免疫共沉淀技術(shù)結(jié)合western blot，檢測巨噬細胞中TAK1與TAB2結(jié)合的改變；采用western blot分析MKK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)的JNK、ERK等基因的表達變化；采用MTT及流式細胞術(shù)分析TAK1糖基化修飾改變對該信號通路直接下游事件巨噬細胞的增殖的影響。（b）將野生型及糖基化位點突變型TAK1真核表達載體轉(zhuǎn)染入巨噬細胞，采用免疫共沉淀技術(shù)結(jié)合western blot，檢測巨噬細胞中TAK1與IKK、結(jié)合的改變；采用western blot分析IKK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)的IKK、等基因的表達變化。（c）將野生型及糖基化位點突變型TAK1真核表達載體轉(zhuǎn)染入巨噬細胞，采用免疫共沉淀技術(shù)結(jié)合western blot，檢測膠質(zhì)瘤細胞中MTDH與p65結(jié)合的改變；采用核漿分離技術(shù)、細胞免疫熒光技術(shù)，檢測TAK1及p65的核漿分布情況，分析TAK1糖基化修飾對于p65向細胞核轉(zhuǎn)運情況的影響；采用western blot分析IB的磷酸化水平變化；采用熒光素酶報告基因技術(shù)，分析TAK1糖基化修飾對于細胞核內(nèi)NF-B活性的影響；采用Realtime PCR技術(shù)、ELISA法，檢測炎性細胞因子（IL-1、IL-6、TNF-、IFN-、IL-10等）的合成及分泌改變。（d）在此基礎(chǔ)上，分別利用多種炎癥因子IL-1、TNF-等處理巨噬細胞，模擬巨噬細胞炎癥微環(huán)境，并干預(yù)TAK1的表達，分析其對上述信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活的影響。5. 分析 TAK1發(fā)生0-糖基化修飾對巨噬細胞激活的影響。(1)TAK1發(fā)生 N-糖基化修飾對 TAK1 與IKK結(jié)合能力的影響。 a） 將野生型及糖基化位點突變的 TAK1 轉(zhuǎn)染巨噬細胞后，檢測外轉(zhuǎn)受體的表達情況； b） 利用 FITC 標記的 15-P-DJ 處理巨噬細胞 1 小時，固定細胞，流式細胞術(shù)檢測細胞表面綠色熒光的結(jié)合情況，觀察干預(yù)TAK1 糖基化修飾對其與IKK結(jié)合能力的影響。(c） MTT 法檢測上所述巨噬細胞中細胞活力的變化，ELISA 檢測上述細胞中細胞因子分泌的變化，同時收集細胞蛋白，免疫印跡檢測細胞活化標記物的變化； 6. 分析TAK1發(fā)生0-糖基化修飾對巨噬細胞磷酸化的影響（a） 將野生型及糖基化位點突變型TAK1真核表達載體轉(zhuǎn)染入巨噬細胞，采用免疫共沉淀技術(shù)結(jié)合western blot,檢測TAK1的磷酸化的變化（b） 將野生型及糖基化位點突變型TAK1真核表達載體轉(zhuǎn)染入巨噬細胞，在炎癥因子的刺激的情況下，采用western blot檢測TAK1以及靶定下游分子的磷酸化變化 技術(shù)路線：創(chuàng)新性：（1）本項目研究的特色之處：本項目以炎癥發(fā)生過程中蛋白質(zhì)翻譯后的O-GlcNAc修飾為核心，以TAK1的糖基化修飾為切入點，系統(tǒng)的從細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、組織病理學(xué)及實驗動物學(xué)等多學(xué)科系統(tǒng)的研究刺激情況下TAK1的O-GlcNAc修飾在巨噬細胞炎癥發(fā)生及發(fā)展中的作用，為研究巨噬細胞炎癥的發(fā)生機制，尋找炎癥治療方法提供理論依據(jù)。這是本項目的特色之處。（2）本項目研究的創(chuàng)新之處：本項目研究中將蛋白質(zhì)糖基化修飾引入到巨噬細胞炎癥的調(diào)解中，從糖生物學(xué)角度研究表觀遺傳學(xué)的調(diào)控機制。本項目的研究可為闡明多因素導(dǎo)致的炎癥發(fā)生發(fā)展的分子機制提供理論依據(jù)。這是本項目研究的創(chuàng)新之處。可行性： （1）立項依據(jù)充分，預(yù)實驗結(jié)果明確，課題研究理論可行。前期的研究發(fā)現(xiàn)TAK1蛋白質(zhì)的糖基化修飾參與巨噬細胞炎癥的發(fā)展，而TAK1也被報道參與炎癥的發(fā)生發(fā)展。課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)TAK1可以發(fā)生呢個O-糖基化修飾，并在前期的研究中發(fā)現(xiàn)炎癥情況下O-GlcNAc明顯增加，這提示在巨噬細胞炎癥發(fā)生發(fā)展過程中，TAK1的糖基化修飾促進炎癥的發(fā)生與發(fā)展。（2）成員隊伍合理，學(xué)科層次全面，項目研究人員可行。項目研究組成員來自外科學(xué)、分子生物學(xué)、組織病理學(xué)等多學(xué)科，擁有多學(xué)科的而研究背景，為項目的完成提供理論支持；同時項目組中有多位成員主持及參加國家自然科學(xué)基金的研究，具有完成本課題的能力。（3）研究方法多樣，研究的技術(shù)可行。項目組在前期的研究中已經(jīng)系統(tǒng)的掌握細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、組織病理學(xué)、實驗動物學(xué)、表觀遺傳學(xué)等多學(xué)科的研究技術(shù)及方法，可為本課題的研究提供技術(shù)支持。4、 研究工作的總體安排及進度2013年01月-2015年12月分析TAK1存在糖基化修飾；在此基礎(chǔ)上分析TAK1的O-GlcNAc修飾位點。參加國內(nèi)學(xué)術(shù)會議1人/次。2015年01月-2015年10月分析TAK1的O-GlcNAc修飾對巨噬細胞炎癥的改變；在此基礎(chǔ)上分析其對NF-kB通路的影響。參加國內(nèi)學(xué)術(shù)會議1人/次。2015年11月-2016年03月分析TAK1的O-GlcNAc修飾對TAK1調(diào)節(jié)的靶基因表達改變；在此基礎(chǔ)上分析其對巨噬細胞炎癥因子的影響。參加國內(nèi)學(xué)術(shù)會議1人/次；參加國際學(xué)術(shù)會議1人/次?？偨Y(jié)結(jié)果，發(fā)表論文1-2篇。2016年04月-2016年12月分析巨噬細胞中TAK1的O-GlcNAc修飾與巨噬細胞炎癥微環(huán)境的關(guān)系；構(gòu)建炎癥模型干預(yù)TAK1的O-GlcNAc糖基化修飾，分析對巨噬細胞炎癥發(fā)生及發(fā)展的影響。參加國內(nèi)學(xué)術(shù)會議1人/次；參加國際學(xué)術(shù)會議1人/次?？偨Y(jié)結(jié)果，發(fā)表論文1-2篇?？偨Y(jié)課題研究內(nèi)容，撰寫項目結(jié)題報告。五、研究工作的預(yù)期成果及成果提交形式1.在293T細胞中，運用免疫共沉淀結(jié)合western blot,檢測TAK1分子本身存在糖基化修飾2. 在293T細胞中，用OGA的抑制劑GlcNAcstatin處理以后，明顯增強了TAK1的糖基化水平。3. 在巨噬細胞中，分別用不同濃度的LPS對巨噬細胞進行刺激，檢測TAK1的糖基化變化，發(fā)現(xiàn)明顯增加。 六、研究基礎(chǔ)和工作條件（申請人與本課題有關(guān)的研究成果，含承擔項目、發(fā)表論文、獲獎、國內(nèi)外評價與引用情況；現(xiàn)有的主要儀器設(shè)備、研究技術(shù)及協(xié)作條件等）1工作基礎(chǔ)（與本項目相關(guān)的研究工作積累和已取得的研究工作成績）。課題組多年來從事炎癥發(fā)生及發(fā)展機制的研究。目前已經(jīng)有的與本課題研究相關(guān)的基礎(chǔ)有：（1）在前期的研究中，課題組已經(jīng)對炎癥的發(fā)生及發(fā)展機制展開大量的研究，已經(jīng)積累豐富的研究基礎(chǔ)（課題組前期發(fā)表的相關(guān)論文1-4）；（2）課題組多年來一直從事蛋白質(zhì)功能調(diào)節(jié)及其相互作用的研究，已經(jīng)積累本課題研究必須的方法（課題組前期發(fā)表的相關(guān)論文5-8）；（3）課題組在前期研究中已經(jīng)對蛋白質(zhì)糖基化修飾展開研究，并積累豐富基礎(chǔ)（課題組前期發(fā)表的相關(guān)論文9-10）；（4）課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)TAK1存在糖基化修飾；（5）課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)干預(yù)TAK1糖基化的表達后，明顯抑制了巨噬細胞炎癥的發(fā)生。1.1 課題組前期發(fā)表的與本項目研究內(nèi)容相關(guān)的論文:1 Wu H, Chen P, Liao R, Li YW, Yi Y, Wang JX, Cai XY, He HW, Jin JJ, Cheng YF, Fan J, Sun J*, Qiu SJ*. Intratumoral regulatory T cells with higher prevalence and more suppressive activity in hepatocellular carcinoma patients. J Gastroenterol Hepatol. 2013;28(9):1555-1564.2 Wu H, Chen P, Liao R, Li YW, Yi Y, Wang JX, Sun TW, Zhou J, Shi YH, Yang XR, Jin JJ, Cheng YF, Fan J*, Qiu SJ*. Overexpression of galectin-1 is associated with poor prognosis in human hepatocellular carcinoma following resection. J Gastroenterol Hepatol. 2012;27(8):1312-1319.3 Liao R, Wu H, Yi Y, Wang JX, Cai XY, He HW, Cheng YF, Zhou J, Fan J, Sun J*, Qiu SJ*. Clinical significance and gene expression study of human hepatic stellate cells in HBV related-hepatocellular carcinoma. J Exp Clin Cancer Res. 2013;32:22. 4 Yi Y, Wu H, Gao Q, He HW, Li YW, Cai XY, Wang JX, Zhou J, Cheng YF, Jin JJ，F(xiàn)an J*, Qiu SJ*. Interferon regulatory factor (IRF)-1 and IRF-2 are associated with prognosis and tumor invasion in HCC. Ann Surg Oncol. 2013;20(1):267-276.5 Shen M, Ji Y, Zhang S, Shi H, Chen G, Gu X*, Ding F*. A proteome map of primary cultured rat Schwann cells. Proteome Sci. 2012;10(1):20.6 Ji Y, Shen M, Wang X, Zhang S, Yu S, Chen G, Gu X*, Ding F*. Comparative Proteomic Analysis of Primary Schwann Cells and a Spontaneously Immortalized Schwann Cell Line RSC 96: A Comprehensive Overview with a Focus on Cell Adhesion and Migration Related Proteins. J Proteome Res. 2012;11(6):3186-3198.7 Li M, Yang X, Zhang J, Shi H, Hang Q, Huang X,