第八章微生物遺傳與育種 遺傳 親代與子代相似 變異 親代與子代 子代間不同個(gè)體不完全相同 遺傳 inheritance 和變異 variation 是生命的最本質(zhì)特性之一 遺傳型 genotype 表型 phenotype 生物的全部遺傳因子所攜帶的遺傳信息 具有一定遺傳型的個(gè)體 在特定環(huán)境條件下通過生長(zhǎng)發(fā)育所表現(xiàn)出來的外表特征和內(nèi)在特征的總和 表型是由遺傳型所決定 但也和環(huán)境有關(guān) 遺傳和變異的幾個(gè)概念 變異 Variation 是生物體在某種外因或內(nèi)因作用下引起的遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變 亦即遺傳型的改變 特點(diǎn) 幾率極低 一般為10 5 10 6 性狀變化幅度大 變化后的新性狀是穩(wěn)定的 可遺傳的 細(xì)菌變異 變異 variation 在一定條件下 子代與親代之間以及子代與子代之間的生物學(xué)性狀出現(xiàn)的差異 形態(tài)結(jié)構(gòu)的變異毒力變異耐藥性變異菌落變異 一 形態(tài)結(jié)構(gòu)的變異 細(xì)菌的大小和形態(tài)在不同的生長(zhǎng)時(shí)期可不同 生長(zhǎng)過程中受外界環(huán)境的影響也可發(fā)生變異 如 鼠疫耶氏菌在陳舊培養(yǎng)物上細(xì)菌的多形態(tài)性 細(xì)菌L型 細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)如 莢膜 肺炎鏈球菌 芽胞 炭疽芽孢桿菌 鞭毛 變形桿菌H O變異 也可發(fā)生變異 形態(tài)結(jié)構(gòu)變異 3 6 食鹽鼠疫桿菌 多形態(tài)性 衰殘型 瓊脂培基 形態(tài)結(jié)構(gòu)變異 青霉素 溶菌酶正常形態(tài)細(xì)菌 L型變異抗體或補(bǔ)體 部分或完全失去胞壁 正常霍亂弧菌 霍亂弧菌L型 毒力變異 增強(qiáng) 無(wú)毒力的白喉棒狀桿菌常寄居在咽喉部 不致病 當(dāng)感染了 棒狀噬菌體后變成溶原性細(xì)菌 則獲得產(chǎn)生白喉毒素的能力 引起白喉 棒狀噬菌體白喉棒狀桿菌 獲得白喉毒素 毒力變異 減弱 有毒菌株長(zhǎng)期在人工培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng) 可使細(xì)菌的毒力減弱或消失 卡介苗 BCG 是有毒的牛分枝桿菌在含有膽汁的甘油 馬鈴薯培養(yǎng)基上 經(jīng)過13年 連續(xù)穿230代 獲得的一株毒力減弱但仍保持免疫原性的變異株 膽汁 甘油 馬鈴薯培養(yǎng)基牛型結(jié)核桿菌 卡介苗13年 230代 耐藥性變異 細(xì)菌對(duì)某種抗菌藥物由敏感變?yōu)槟退幍淖儺?金黃色葡萄球菌耐青霉素的菌株已從1946年的14 上升至目前的80 多重耐藥性 有些細(xì)菌還表現(xiàn)為同時(shí)耐受多種抗菌藥物 含鏈霉素培基痢疾桿菌 依鏈株 耐藥菌株 長(zhǎng)期培養(yǎng)從抗生素廣泛應(yīng)用以來 細(xì)菌對(duì)抗生素耐藥的不斷增長(zhǎng)是世界范圍內(nèi)的普遍趨勢(shì) 給臨床治療帶來很大的困難 并成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)上的重要問題 菌落變異 細(xì)菌的菌落主要有光滑 smooth S 型和粗糙 rough R 型兩種 S型菌落表面光滑 濕潤(rùn) 邊緣整齊 經(jīng)人工培養(yǎng)多次傳代后菌落表面邊為粗糙 干燥 邊緣不整齊 稱S R變異 在陳舊培養(yǎng)基中長(zhǎng)期培養(yǎng)光滑型菌落 粗糙型菌落S或在有免疫力的人體內(nèi)R R型菌落 S型菌落 突變 mutation 是細(xì)菌遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生突然而穩(wěn)定的改變 導(dǎo)致細(xì)菌性狀的遺傳性變異遺傳性變異 非遺傳性變異 遺傳性變異 是細(xì)菌的基因結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變 故又稱基因型變異 常發(fā)生于個(gè)別的細(xì)菌 不受環(huán)境因素的影響 變異發(fā)生后是不可逆的 產(chǎn)生的新性狀可穩(wěn)定地遺傳給后代 非遺傳性變異 細(xì)菌在一定的環(huán)境條件影響下產(chǎn)生的變異 其基因結(jié)構(gòu)未改變 稱為表型變異 易受到環(huán)境因素的影響 凡在此環(huán)境因素作用下的所有細(xì)菌都出現(xiàn)變異 而且當(dāng)環(huán)境中的影響因素去除后 變異的性狀又可復(fù)原 表型變異不能遺傳 表型飾變 表型的差異只與環(huán)境有關(guān)特點(diǎn) 暫時(shí)性 不可遺傳性 表現(xiàn)為全部個(gè)體的行為 橘生淮南則為橘 生于淮北則為枳 遺傳型變異 基因變異 基因突變 遺傳物質(zhì)改變 導(dǎo)致表型改變特點(diǎn) 遺傳性 群體中極少數(shù)個(gè)體的行為 自發(fā)突變頻率通常為10 6 10 9 Productionofaredpigment prodigiosin bySerratiamarcescens 粘質(zhì)沙雷氏菌 靈桿菌 Fromlefttoright slantculturegrownat25 C slantculturegrownat37 C brothculturegrownat25 C brothculturegrownat37 C 微生物是遺傳學(xué)研究中的明星 微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單 營(yíng)養(yǎng)體一般為單倍體 方便建立純系 很多常見微生物都易于人工培養(yǎng) 快速 大量生長(zhǎng)繁殖 對(duì)環(huán)境因素的作用敏感 易于獲得各類突變株 操作性強(qiáng) 第一節(jié)遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ) 一 三個(gè)證明DNA是遺傳物質(zhì)的經(jīng)典實(shí)驗(yàn) 二 RNA作為遺傳物質(zhì) 三 朊病毒的發(fā)現(xiàn)與思考 四 遺傳物質(zhì)在微生物細(xì)胞內(nèi)存在的部位和方式 1經(jīng)典轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) transformation F Griffith 研究對(duì)象 Streptococcuspneumoniae 肺炎雙球菌 SIII型菌株 有莢膜 菌落表面光滑 有致病性RII型菌株 無(wú)莢膜 菌落表面粗糙 無(wú)致病性 一 三個(gè)證明DNA是遺傳物質(zhì)的經(jīng)典實(shí)驗(yàn) 1928年 F Griffth作了3組實(shí)驗(yàn) 1944年 Avery精確重復(fù)了轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 確定了轉(zhuǎn)化因子 DNA純度越高 轉(zhuǎn)化效率也越高 這就說明 S型菌株轉(zhuǎn)移給R型菌株的 決不是某一遺傳性狀的本身 而是以DNA為物質(zhì)基礎(chǔ)的遺傳因子 DNA DNA以外的酶 2噬菌體感染實(shí)驗(yàn) A D Hershey和M Chase 1952年 10分鐘后用搗碎器使空殼脫離 吸附 離心 沉淀細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)后 可產(chǎn)生大量完整的子代噬菌體 沉淀中含25 放射性 上清液中含75 放射性 用35S 蛋白質(zhì)外殼 的噬菌體感染實(shí)驗(yàn) 1 含32P DNA的一組 放射性85 在沉淀中 2 含35S 蛋白質(zhì)的一組 放射性75 在上清液中所以 進(jìn)入細(xì)胞的是噬菌體的核酸而不是蛋白質(zhì) 3植物病毒的重建實(shí)驗(yàn) 選用TMV和霍氏車前花葉病毒 HRV 分別拆分取得各自的RNA和蛋白質(zhì) 將兩種RNA分別與對(duì)方的蛋白質(zhì)外殼重建形成兩種雜合病毒 1 RNA TMV 蛋白質(zhì) HRV 2 RNA HRV 蛋白質(zhì) TMV 用兩種雜合病毒感染寄主 1 表現(xiàn)TMV的典型癥狀病分離到正常TMV粒子 2 表現(xiàn)HRV的典型癥狀病分離到正常HRV粒子 上述結(jié)果說明 在RNA病毒中 遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)也是核酸 二 RNA作為遺傳物質(zhì) 生化提取分別獲得含RNA的煙草花葉病毒蛋白質(zhì)外殼 病毒1 和核酸 病毒2 抗血清處理 證明雜種病毒的蛋白質(zhì)外殼來自病毒1 而非病毒2 雜種病毒的后代的蛋白質(zhì)外殼表現(xiàn)為病毒2 而非病毒1 遺傳物質(zhì)是核酸 RNA 而非蛋白質(zhì) 三 朊病毒的發(fā)現(xiàn)和思考 朊病毒含有微量的核酸 仍未發(fā)現(xiàn) 朊病毒僅由蛋白質(zhì)構(gòu)成朊病毒的遺傳物質(zhì)為蛋白質(zhì) 三 朊病毒的發(fā)現(xiàn)與思考 亞病毒的一種 具有傳染性的蛋白質(zhì)致病因子 迄今為止尚為發(fā)現(xiàn)該蛋白內(nèi)含有核酸 其致病作用是由于動(dòng)物體內(nèi)正常的蛋白質(zhì)PrPc改變折疊狀態(tài)為PrPsc所致 而這二種蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)并沒有改變 人的庫(kù)魯病 kuru 克雅氏病 CreutzfeldtJakobdisease CJD 等 羊搔癢癥 scrapie 牛海綿狀腦病 spongiformencephalopathy 引起人與動(dòng)物的致死性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病 Prusiner 1982 提出羊搔癢病因子是一種蛋白質(zhì)侵染顆粒 proteinaceousinfectiousparticle 并將之稱做Prion或Virino 朊病毒 1997年 StanleyB Prusiner榮獲諾貝爾獎(jiǎng) 四 遺傳物質(zhì)在微生物細(xì)胞內(nèi)存在的部位和方式 細(xì)胞水平 細(xì)胞核水平 染色體水平 核酸水平 基因水平 密碼子水平 核苷酸水平 細(xì)胞水平真核微生物 細(xì)胞核原核微生物 核區(qū)細(xì)胞核或核區(qū)的數(shù)目在不同的微生物中是不同的 細(xì)胞核水平真核生物細(xì)胞核核染色體原核生物核區(qū)DNA鏈 核基因組 在核基因組之外 還存在各種形式的核外遺傳物質(zhì) 細(xì)胞核水平 核外染色體 真核生物的 質(zhì)粒 原核生物的質(zhì)粒 細(xì)胞質(zhì)基因 質(zhì)體 共生生物酵母菌的2 m質(zhì)粒 F因子R因子Col質(zhì)粒Ti質(zhì)粒巨大質(zhì)粒降解性質(zhì)粒 線粒體 葉綠體 染色體水平染色體是由組蛋白與DNA構(gòu)成的線狀結(jié)構(gòu)染色體的數(shù)目在不同的生物中是不同的染色體的倍數(shù)在同一生物的不同生活時(shí)期是不同的 核酸水平核酸種類 DNA RNA核酸結(jié)構(gòu) 雙鏈 單鏈 環(huán)狀 線狀 超螺旋狀DNA長(zhǎng)度 因種而異 微生物基因組測(cè)序工作是在人類基因組計(jì)劃的促進(jìn)下開始的 最開始是作為模式生物 后來不斷發(fā)展 已成為研究微生物學(xué)的最有力的手段 基因水平 原核生物與真核生物基因組的比較 操縱子 operon 的轉(zhuǎn)錄機(jī)制 密碼子水平 核苷酸水平核苷酸是最小突變單位和交換單位 第二節(jié)微生物的基因組結(jié)構(gòu) 一 概念 基因組 genome 一個(gè)物種的單倍體的所有染色體及其所包含的遺傳信息的總稱 原核生物 如細(xì)菌 多為單倍體 在一般情況下只有一條染色體 真核微生物 多條染色體 例如啤酒酵母有16條染色體 有時(shí)為雙倍體 二 微生物基因組結(jié)構(gòu)的特點(diǎn) 1 原核生物 細(xì)菌 古生菌 的基因組 a 染色體為雙鏈環(huán)狀的DNA分子 單倍體 鏈環(huán)狀的染色體在細(xì)胞中以緊密纏繞成的較致密的不規(guī)則小體形式存在于細(xì)胞中 該小體稱為擬核 nucliod 其上結(jié)合有類組蛋白蛋白質(zhì)和少量RNA分子 使其壓縮成一種手腳架形的致密結(jié)構(gòu) 1 原核生物 細(xì)菌 古生菌 的基因組 a 染色體為雙鏈環(huán)狀的DNA分子 單倍體 b 基因組上遺傳信息具有連續(xù)性 基因數(shù)基本接近由它的基因組大小所估計(jì)的基因數(shù) 微生物基因組DNA絕大部分用來編碼蛋白質(zhì) RNA 用作為復(fù)制起點(diǎn) 啟動(dòng)子 終止子和一些由調(diào)節(jié)蛋白識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)等信號(hào)序列 一般不含內(nèi)含子 遺傳信息是連續(xù)的而不是中斷的 真核生物基因組的一個(gè)重要特點(diǎn)就是含有內(nèi)含子 個(gè)別細(xì)菌 鼠傷寒沙門氏菌和犬螺桿菌 和古生菌的rRNA和tRNA中也發(fā)現(xiàn)有內(nèi)含子或間插序列 1 原核生物 細(xì)菌 古生菌 的基因組 a 染色體為雙鏈環(huán)狀的DNA分子 單倍體 b 基因組上遺傳信息具有連續(xù)性 c 功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因組成操縱子結(jié)構(gòu) d 結(jié)構(gòu)基因的單拷貝及rRNA基因的多拷貝 e 基因組的重復(fù)序列少而短 操縱子 operon 功能相關(guān)的幾個(gè)基因前后相連 再加上一個(gè)共同的調(diào)節(jié)基因和一組共同的控制位點(diǎn) 啟動(dòng)子 操作子等 在基因轉(zhuǎn)錄時(shí)協(xié)同動(dòng)作 2真核微生物 啤酒酵母 的基因組 a 典型的真核染色體結(jié)構(gòu) b 沒有明顯的操縱子結(jié)構(gòu) 啤酒酵母基因組大小為13 5 106bp 分布在16條染色體中 c 有間隔區(qū) 即非編碼區(qū) 和內(nèi)含子序列 d 重復(fù)序列多 三 質(zhì)粒 plasmid 一種獨(dú)立于染色體外 能進(jìn)行自主復(fù)制的細(xì)胞質(zhì)遺傳因子 主要存在于各種微生物細(xì)胞中 轉(zhuǎn)座因子 transposableelement 位于染色體或質(zhì)粒上的一段能改變自身位置的DNA序列 廣泛分布于原核和真核細(xì)胞中 質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座因子是細(xì)胞中除染色體以外的另外二類遺傳因子 1 質(zhì)粒的結(jié)構(gòu) 通常以共價(jià)閉合環(huán)狀 covalentlyclosedcircle 簡(jiǎn)稱CCC 的超螺旋雙鏈DNA分子存在于細(xì)胞中 也發(fā)現(xiàn)有線型雙鏈DNA質(zhì)粒和RNA質(zhì)粒 質(zhì)粒分子的大小范圍從1kb左右到1000kb 細(xì)菌質(zhì)粒多在10kb以內(nèi) 高拷貝數(shù) highcopynumber 質(zhì)粒 每個(gè)宿主細(xì)胞中可以有10 100個(gè)拷貝 松弛型質(zhì)粒 relaxedplasmid 低拷貝數(shù) lowcopynumber 質(zhì)粒 每個(gè)宿主細(xì)胞中可以有1 4個(gè)拷貝 嚴(yán)緊型質(zhì)粒 stringentplasmid 窄宿主范圍質(zhì)粒 narrowhostrangeplasmid 只能在一種特定的宿主細(xì)胞中復(fù)制 廣宿主范圍質(zhì)粒 broadhostrangeplasmid 可以在許多種細(xì)菌中復(fù)制 在某些特殊條件下 質(zhì)粒有時(shí)能賦予宿主細(xì)胞以特殊的機(jī)能 從而使宿主得到生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì) 質(zhì)粒所含的基因?qū)λ拗骷?xì)胞一般是非必需的 2 質(zhì)粒在基因工程中的應(yīng)用質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn) 1 體積小 易分離和操作 2 環(huán)狀 穩(wěn)定 3 獨(dú)立復(fù)制 4 拷貝數(shù)多 5 存在抗藥性基因等標(biāo)記位點(diǎn) 易篩選E coli的pBR322質(zhì)粒是一個(gè)常用的克隆載體 3 質(zhì)粒的檢測(cè) 提取所有胞內(nèi)DNA后電鏡觀察 超速離心或瓊脂糖凝膠電泳后觀察 對(duì)于實(shí)驗(yàn)室常用菌 可用質(zhì)粒所帶的某些特點(diǎn) 如抗藥性初步判斷 4 質(zhì)粒的主要類型 質(zhì)粒所編碼的功能和賦予宿主的表型效應(yīng) 致育因子 Fertilityfactor F因子 抗性因子 Resistancefactor R因子 產(chǎn)細(xì)菌素的質(zhì)粒 Bacteriocinproductionplasmid 毒性質(zhì)粒 virulenceplasmid 代謝質(zhì)粒 Metabolicplasmid 隱秘質(zhì)粒 crypticplasmid 1 致育因子 Fertilityfactor F因子 又稱F質(zhì)粒 其大小約100kb 這是最早發(fā)現(xiàn)的一種與大腸桿菌的有性生殖現(xiàn)象 接合作用 有關(guān)的質(zhì)粒 攜帶F質(zhì)粒的菌株稱為F 菌株 相當(dāng)于雄性 無(wú)F質(zhì)粒的菌株稱為F 菌株 相當(dāng)于雌性 F因子能以游離狀態(tài) F 和以與染色體相結(jié)合的狀態(tài) Hfr 存在于細(xì)胞中 所以又稱之為附加體 episome 第三節(jié)質(zhì)粒 2 抗性因子 Resistancefactor R因子 包括抗藥性和抗重金屬二大類 簡(jiǎn)稱R質(zhì)粒 R100質(zhì)粒 89kb 可使宿主對(duì)下列藥物及重金屬具有抗性 汞 mercuricion mer 四環(huán)素 tetracycline tet 鏈霉素 Streptomycin Str 磺胺 Sulfonamide Su 氯霉素 Chlorampenicol Cm 夫西地酸 fusidicacid fus 并且負(fù)責(zé)這些抗性的基因是成簇地存在于抗性質(zhì)粒上 抗性質(zhì)粒在細(xì)菌間的傳遞是細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性的重要原因之一 3 產(chǎn)細(xì)菌素的質(zhì)粒 Bacteriocinproductionplasmid 細(xì)菌素結(jié)構(gòu)基因 涉及細(xì)菌素運(yùn)輸及發(fā)揮作用 processing 的蛋白質(zhì)的基因 賦予宿主對(duì)該細(xì)菌素具有 免疫力 的相關(guān)產(chǎn)物的基因 一般都位于質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子上 因此 細(xì)菌素可以殺死同種但不攜帶該質(zhì)粒的菌株 3 產(chǎn)細(xì)菌素的質(zhì)粒 Bacteriocinproductionplasmid 細(xì)菌素一般根據(jù)產(chǎn)生菌的種類進(jìn)行命名 大腸桿菌 E coli 產(chǎn)生的細(xì)菌素為colicins 大腸桿菌素 而質(zhì)粒被稱為Col質(zhì)粒 由G 細(xì)菌產(chǎn)生的細(xì)菌素或與細(xì)菌素類似的因子與colicins有所不同 但通常也是由質(zhì)?；蚓幋a 有些甚至有商業(yè)價(jià)值 例如一種乳酸細(xì)菌產(chǎn)生的細(xì)菌素NisinA能強(qiáng)烈抑制某些G 細(xì)菌的生長(zhǎng) 而被用于食品工業(yè)的保藏 4 毒性質(zhì)粒 virulenceplasmid 許多致病菌的致病性是由其所攜帶的質(zhì)粒引起的 這些質(zhì)粒具有編碼毒素的基因 其產(chǎn)物對(duì)宿主 動(dòng)物 植物 造成傷害 產(chǎn)毒素大腸桿菌是引起人類和動(dòng)物腹瀉的主要病原菌之一 其中許多菌株含有為一種或多種腸毒素編碼的質(zhì)粒 蘇云金桿菌含有編碼 內(nèi)毒素 伴孢晶體中 的質(zhì)粒 根癌土壤桿菌所含Ti質(zhì)粒是引起雙子葉植物冠癭瘤的致病因子 5 代謝質(zhì)粒 Metabolicplasmid 質(zhì)粒上攜帶有有利于微生物生存的基因 如能降解某些基質(zhì)的酶 進(jìn)行共生固氮 或產(chǎn)生抗生素 某些放線菌 等 將復(fù)雜的有機(jī)化合物降解成能被其作為碳源和能源利用的簡(jiǎn)單形式 環(huán)境保護(hù)方面具有重要的意義 假單胞菌 具有降解一些有毒化合物 如芳香簇化合物 苯 農(nóng)藥 2 4 dichlorophenoxyaceticacid 辛烷和樟腦等的能力 降解質(zhì)粒 6 隱秘質(zhì)粒 crypticplasmid 隱秘質(zhì)粒不顯示任何表型效應(yīng) 它們的存在只有通過物理的方法 例如用凝膠電泳檢測(cè)細(xì)胞抽提液等方法才能發(fā)現(xiàn) 它們存在的生物學(xué)意義 目前幾乎不了解 在應(yīng)用上 很多隱秘質(zhì)粒被加以改造作為基因工程的載體 一般加上抗性基因 5 質(zhì)粒的不親和性 質(zhì)粒之間的不親和性 以及質(zhì)?？截悢?shù)的多少 能適應(yīng)的宿主范圍的寬窄等特性均與質(zhì)粒的復(fù)制控制類型有關(guān) 欲了解詳細(xì)內(nèi)容請(qǐng)選修 微生物遺傳學(xué) 第三節(jié)基因突變和誘變育種 一 基因突變一個(gè)基因內(nèi)部遺傳結(jié)構(gòu)或DNA序列的任何改變 可遺傳 自發(fā)或誘變產(chǎn)生 一 突變的類型 從突變的效應(yīng)看 同義突變 錯(cuò)義突變 無(wú)義突變 從突變的表型看 1 營(yíng)養(yǎng)缺陷型 auxotroph 一種缺乏合成其生存所必須的營(yíng)養(yǎng)物 包括氨基酸 維生素 堿基等 的突變型 只有從周圍環(huán)境或培養(yǎng)基中獲得這些營(yíng)養(yǎng)或其前體物 precursor 才能生長(zhǎng) 營(yíng)養(yǎng)缺陷型是微生物遺傳學(xué)研究中重要的選擇標(biāo)記和育種的重要手段 表型判斷的標(biāo)準(zhǔn) 在基本培養(yǎng)基上能否生長(zhǎng) 1 營(yíng)養(yǎng)缺陷型 auxotroph 特點(diǎn) 在選擇培養(yǎng)基 一般為基本培養(yǎng)基 上不生長(zhǎng) 負(fù)選擇標(biāo)記 突變株不能通過選擇平板直接獲得 Positiveselection正選擇標(biāo)記 Inpositiveselection onlythosemutantcellsthatcansurviveinamediumcontainingaselectiveagentsuchaspenicillincansurvive negativeselection負(fù)選擇標(biāo)記 Innegativeselection nutritionalmutantscalledauxotrophscannotgrowonaminimalmediumlackingakeynutrient Themutantsareidentifiedbythereplicateorganismdirectagarcontact RODAC technique 影印平板 Replicaplating 法是Lederberg夫婦在1952年建立 1 營(yíng)養(yǎng)缺陷型 auxotroph 營(yíng)養(yǎng)缺陷型的表示方法 1 營(yíng)養(yǎng)缺陷型 auxotroph 基因型 所需營(yíng)養(yǎng)物的前三個(gè)英文小寫斜體字母表示 hisC 組氨酸缺陷型 其中的大寫字母C同一表型中不同基因的突變 表型 同上 但第一個(gè)字母大寫 且不用斜體 HisC 在具體使用時(shí)多用hisC 和hisC 分別表示缺陷型和野生型 2 抗藥性突變型 resistantmutant 基因突變使菌株對(duì)某種或某幾種藥物 特別是抗生素 產(chǎn)生抗性 特點(diǎn) 正選擇標(biāo)記 突變株可直接從抗性平板上獲得 在加有相應(yīng)抗生素的平板上 只有抗性突變能生長(zhǎng) 所以很容易分離得到 表示方法 所抗藥物的前三個(gè)小寫斜體英文字母加上 r 表示strr和strs分別表示對(duì)鏈霉素的抗性和敏感性 3 條件致死突變型 conditionallethalmutant 在某一條件下具有致死效應(yīng) 而在另一條件下沒有致死效應(yīng)的突變型 常用的條件致死突變是溫度敏感突變 用ts temperature sensitive 表示 這類突變?cè)诟邷叵?如42 是致死的 但可以在低溫 如25 30 下得到這種突變 特點(diǎn) 負(fù)選擇標(biāo)記 這類突變型常被用來分離生長(zhǎng)繁殖必需的突變基因 4 形態(tài)突變型 morphologicalmutant 造成形態(tài)改變的突變型 特點(diǎn) 非選擇性突變突變株和野生型菌株均可生長(zhǎng) 但可從形態(tài)特征上進(jìn)行區(qū)分 舉例 產(chǎn)蛋白酶缺陷突變株的篩選 菌落顏色變化 半乳糖苷酶基因的插入失活 使重組子菌落為白色而與蘭色的非重組子分開 形成芽孢缺陷菌株 細(xì)胞水平上的形態(tài)突變 突變株的檢出更加困難 5 其它突變類型 毒力 生產(chǎn)某種代謝產(chǎn)物的發(fā)酵能力的變化等在實(shí)際應(yīng)用中具有重要意義突變類型一般都不具有很明顯或可直接檢測(cè)到的表型 其突變株的獲得往往需要較大的工作量 1 特點(diǎn) 1 自發(fā)性2 非對(duì)應(yīng)性3 稀有性4 穩(wěn)定性5 獨(dú)立性6 可誘變性7 可逆性 二 基因突變的特點(diǎn) 證明突變的性狀與引起突變的原因間無(wú)直接對(duì)應(yīng)關(guān)系 如何證明基因突變的非對(duì)應(yīng)性 三個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn) 變量實(shí)驗(yàn) 涂布實(shí)驗(yàn) 影印實(shí)驗(yàn) 2 實(shí)驗(yàn)證據(jù) 變量實(shí)驗(yàn) fluctuationanalysis SalvadorLuriaandMaxDelbruck 1943 SalvadorLuria MaxDelbruck TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1969 Newcombe的涂布實(shí)驗(yàn) 1949 影印實(shí)驗(yàn) replicaplating JoshuaLederbergandEstherLederberg 1952 JoshuaLederberg J LederbergisawardedtheNoblePrizeinMedicineandPhysiologyin1958 點(diǎn)突變 pointmutaion 染色體畸變 chromosomalaberration 三 基因突變及其機(jī)制 1 誘發(fā)突變 物理 化學(xué)核生物的因素 提高突變率的人為的作法 1 堿基的置換 同義突變 有時(shí)DNA的一個(gè)堿基對(duì)的改變并不會(huì)影響它所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列 這是因?yàn)楦淖兒蟮拿艽a子和改變前的密碼子是簡(jiǎn)并密碼子 它們編碼同一種氨基酸 這種基因突變稱為同義突變 堿基的置換引起的突變 錯(cuò)義突變 由于一對(duì)或幾對(duì)堿基對(duì)的改變而使決定某一氨基酸的密碼子變?yōu)闆Q定另一種氨基酸的密碼子的基因突變叫錯(cuò)義突變 無(wú)義突變 被改變的密碼子為終止符號(hào) 它不能編碼任何一種氨基酸 是蛋白質(zhì)合成提前終止 因此為無(wú)義突變 ChemicalAgentsthatModifyDNA EffectsofNitrousAcid Base AnalogMutagens 5 Bromo uracilcansubstituteforT andthenwindupbindingwithG ratherthanA thusinducingaTRANSITION G A mutation 2 移碼突變 添加或缺失核苷酸 引起閱讀錯(cuò)誤 錯(cuò)誤 錯(cuò)誤 正常 正常 正常 3 染色體畸變 缺失 重復(fù) 插入 易位 倒位 Chromosomaldeletion Adeletionoccurswhenachromosomebreaksandsomegeneticmaterialislost Chromosomalduplication Aduplicationoccurswhenpartofachromosomeiscopied duplicated abnormally resultinginextrageneticmaterialfromtheduplicatedsegment Balancedtranslocation Inabalancedtranslocation piecesofchromosomesarerearrangedbutnogeneticmaterialisgainedorlostinthecell Unbalancedtranslocation Anunbalancedtranslocationoccurswhenachildinheritsachromosomewithextraormissinggeneticmaterialfromaparentwithabalancedtranslocation Inversion InversionsoccurwhenachromosomebreaksintwoplacesandtheresultingpieceofDNAisreversedandre insertedintothechromosome Inversionsthatinvolvethecentromerearecalledpericentricinversions thosethatdonotinvolvethecentromerearecalledparacentricinversions Dicentricchromosome Dicentricchromosomesresultfromtheabnormalfusionoftwochromosomepieces eachofwhichincludesacentromere Ringchromosome Ringchromosomesusuallyoccurwhenachromosomebreaksintwoplacesandtheendsofthechromosomearmsfusetogethertoformacircularstructure Isochromosomes Anisochromosomeisanabnormalchromosomewithtwoidenticalarms eithertwoshort p armsortwolong q arms 2 自發(fā)突變 無(wú)人為因素下的低頻率突變?cè)?1 背景輻射 2 有害產(chǎn)物積累 3 堿基錯(cuò)配 六 紫外線對(duì)DNA的損傷及其修復(fù) 紫外線的作用機(jī)制 1 紫外線可引起DNA鏈斷裂2 可引起嘧啶發(fā)生水合作用 造成氫鏈的斷裂 3 可引起DNA分子內(nèi)或分子間交聯(lián)4 引起胸腺嘧啶 T 之間形成二聚體 TT 這是引起突變最主要的原因 六 紫外線對(duì)DNA的損傷及其修復(fù) 嘧啶 嘧啶二聚體 UV 1 光復(fù)活作用 嘧啶二聚體 嘧啶 光解酶 2 切除修復(fù) 二 突變與育種 一 自發(fā)突變與育種 選育定向培育 二 誘變育種1 誘變育種的基本環(huán)節(jié) 誘變育種的步驟 出發(fā)菌株培養(yǎng)液?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞或孢子懸液誘變劑處理平板分離 2 誘變育種工作中應(yīng)考慮的幾個(gè)原則 1 選擇簡(jiǎn)便有效的誘變劑 2 挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株 3 處理單孢子 或單細(xì)胞 懸液 4 選用最適劑量 5 充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng) 6 利用和創(chuàng)造形態(tài) 生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo) 7 設(shè)計(jì)高效篩選方案 8 創(chuàng)造新型篩選方法 誘變育種中的幾個(gè)注意事項(xiàng) 1 出發(fā)菌株的選擇 選擇合適的出發(fā)菌株相當(dāng)重要出發(fā)菌株 用來育種處理的起始菌株出發(fā)菌株應(yīng)具備對(duì)誘變劑的敏感性高 具有特定生產(chǎn)性狀的能力或潛力 出發(fā)菌株的來源自然界直接分離到的野生型菌株歷經(jīng)生產(chǎn)考驗(yàn)的菌株已經(jīng)歷多次育種處理的菌株 2 單孢子懸液 在誘變育種中 所處理的細(xì)胞必須是單細(xì)胞 均勻的懸液狀態(tài) 分散狀態(tài)的細(xì)胞可以均勻地接觸誘變劑 要求 菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 并使細(xì)胞處于同步生細(xì)胞分散且為單細(xì)胞 以避免表型遲延現(xiàn)象方法 玻璃珠打散10 15min 加 3 吐溫80 表面活性劑 用無(wú)菌脫脂棉過濾 3 誘變劑的選擇 選擇簡(jiǎn)便有效的誘變劑 物理誘變劑 X射線 射線 快中子 紫外線 射線 射線和超聲波 化學(xué)誘變劑 種類較多 根據(jù)作用機(jī)制分3類 與一個(gè)或多個(gè)核酸堿基起化學(xué)變化 引起DNA復(fù)制時(shí)堿基配對(duì)的轉(zhuǎn)換而發(fā)生變異如亞硝酸 硫酸二乙酯等 與DNA中堿基十分接近的類似物 摻入到DNA分子中而引起變異 如5 溴尿嘧啶 在DNA上減少或增加一 二個(gè)堿基 引起堿基突變點(diǎn)后全部密碼轉(zhuǎn)錄 轉(zhuǎn)譯的錯(cuò)誤 如吖啶類物質(zhì) 常用的物理和化學(xué)誘變劑 紫外線15W紫外燈 照射距離30cm 無(wú)可見光的接種室或箱體中 只有紅光 照射時(shí)間10 20秒 10 20min 小培養(yǎng)皿亞硝基胍 超誘變劑涂布平板上添加誘變劑顆?；蚪姓T變劑溶液的濾紙片 誘變劑的作用 提高突變的頻率擴(kuò)大產(chǎn)量變異的幅度使產(chǎn)量變異朝著正突變或負(fù)突變移動(dòng)最適劑量的選擇 產(chǎn)量性狀的育種中多傾向于低劑量 致死率在70 80 4 選擇合適的誘變劑量 由于誘變劑常常是用來提高突變率 突變率往往隨劑量的增高而提高 正突變較多出現(xiàn)在偏低的劑量中 負(fù)突變則較多出現(xiàn)在偏高的劑量中 所以要選擇最適的劑量在育種工作中 常采用殺菌率表示殺菌的劑量 殺菌率的計(jì)算是取同樣量的被處理菌體和未被處理的菌體分別在完全培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng) 檢測(cè)各自的生長(zhǎng)的菌落 劑量的表示法 不同種類和不同生長(zhǎng)階段的微生物對(duì)誘變劑的敏感程度不同 所以在誘變處理前 一般應(yīng)預(yù)先作誘變劑用量對(duì)菌體死亡數(shù)量的致死曲線 選擇合適的處理劑量 不同誘變劑劑量的表達(dá)方式不同致死率是最好的誘變劑相對(duì)劑量的表示方法UV劑量 強(qiáng)度 作用時(shí)間化學(xué)殺菌劑的劑量 在一定的外界條件下 誘變劑的濃度與作用時(shí)間常用殺菌率作各種誘變劑的相對(duì)劑量 誘變過程中的兩條重要曲線 劑量存活率曲線以誘變劑的劑量為橫坐標(biāo) 以細(xì)胞存活數(shù)的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)繪制的曲線劑量誘變率曲線以誘變劑的劑量為橫坐標(biāo) 以誘變后獲得的突變細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪制的曲線 艾姆斯試驗(yàn) Amestest 利用細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變檢出環(huán)境或食品中是否存在化學(xué)致癌劑的一種簡(jiǎn)便有效方法Strainusedinamestest DNA修復(fù)酶缺陷型Salmonellatyphimuriumhis E colitry 噬菌體的誘導(dǎo)作用原理his 在基本培養(yǎng)基上不長(zhǎng) 而發(fā)生回復(fù)突變則長(zhǎng)應(yīng)用檢測(cè)食品 飲料 藥物和飲水和環(huán)境中的致癌物質(zhì)快速 準(zhǔn)確 費(fèi)用低 艾姆斯試驗(yàn)方法示意圖 ReversionmutationsintheAmesTest Thedishontheleftwasplatedwithabout109his bacteria Inthiscontrolexperiment intheabsenceofaddedhistidine suchbacteriawillnotgrow exceptforasmallnumber 102 ofwhitecoloniesderviedfromsinglebacteriathathaveundergonespontaneousreversionmutationstohis Intheexperimentontheright thediscinthemiddleofthedishcontainsamutagenicchemical 菌種篩選 篩選是最為艱難的也是最為重要的步驟 實(shí)際工作中 為了提高篩選效率 往往將篩選工作分為初篩和復(fù)篩兩步進(jìn)行 初篩的目的 刪去明確不符合要求的大部分菌株 把生產(chǎn)性狀類似的菌株盡量保留下來 使優(yōu)良性狀的菌株不至于漏網(wǎng)初篩工作以量為主 測(cè)定的精確性還在其次 初篩手段應(yīng)盡可能快速 簡(jiǎn)單 復(fù)篩的目的 確認(rèn)符合要求的菌株 復(fù)篩以質(zhì)為主 應(yīng)精確測(cè)定每個(gè)菌株的生產(chǎn)指標(biāo) 新型篩選方法 產(chǎn)量突變株 初篩 搖瓶 平板 快速 簡(jiǎn)便 直觀 平皿快速檢測(cè)法變色圈法透明圈法生長(zhǎng)圈法抑菌圈法梯度平板法復(fù)篩 對(duì)產(chǎn)量突變株作生產(chǎn)性能的精確測(cè)定搖瓶 臺(tái)式自動(dòng)發(fā)酵罐 3 3類突變株的篩選方法 1 產(chǎn)量突變株的篩選2 抗藥性突變株的篩選3 營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選 1 產(chǎn)量突變株的篩選春日霉素生產(chǎn)菌的篩選 瓊脂塊培養(yǎng)法 2 抗藥性突變株的篩選 用梯度平板法篩選抗代謝拮抗物突變株作為生產(chǎn)菌種 結(jié)構(gòu)類似物抗性變異株 作為菌株的遺傳標(biāo)記 3 營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株 auxotroph 的篩選 相關(guān)培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基 完全培養(yǎng)基 補(bǔ)充培養(yǎng)基 三類遺傳型 野生型 A B 營(yíng)養(yǎng)缺陷型型 A B 原養(yǎng)型 A B A 或 B 與突變株的篩選相關(guān)的幾個(gè)概念 野生型 從自然界分離到的任何微生物在其發(fā)生營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變前的原始菌株 lys bio 可在MM上生長(zhǎng) 如 A B 營(yíng)養(yǎng)缺陷型 野生型菌株經(jīng)誘變處理后 由于發(fā)生了喪失某種酶合成能力的突變 因而只能在加有該酶合成產(chǎn)物的培養(yǎng)基中才能生長(zhǎng) lys bio 只能在CM或相應(yīng)的SM上生長(zhǎng) 如 A B 原養(yǎng)型 指營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變菌株經(jīng)回復(fù)或重組后產(chǎn)生的菌株 其營(yíng)養(yǎng)要求在表現(xiàn)型上與野生型相同 2 與篩選有關(guān)的三種培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基 MM 僅能滿足某種微生物的野生型菌株生長(zhǎng)需要的最低成分組合培養(yǎng)基用 表示 完全培養(yǎng)基 CM 凡可滿足一切營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株?duì)I養(yǎng)需要的天然或半組合培養(yǎng)基 用 表示 補(bǔ)充培養(yǎng)基 SM 凡可滿足相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株生長(zhǎng)需要的組合培養(yǎng)基 在MM上添加有某一微生物營(yíng)養(yǎng)缺陷型所不能合成的代謝物即構(gòu)成SM 用 A 或 B 表示 補(bǔ)充培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基 缺陷的代謝物 3 營(yíng)養(yǎng)缺陷型的篩選步驟 營(yíng)養(yǎng)缺陷型的鑒定 誘變處理 營(yíng)養(yǎng)缺陷型的濃縮 營(yíng)養(yǎng)缺陷型的檢出 營(yíng)養(yǎng)缺陷型的篩選步驟 1 誘變劑的處理 略 2 淘汰野生型 又稱濃縮 a 抗生素法 青霉素法 適合于細(xì)菌 制霉菌素法 適用于真菌 原理 青霉素 制霉菌素等抗生素作用于生長(zhǎng)著的微生物細(xì)胞 對(duì)休止態(tài)細(xì)胞無(wú)作用 方法 將菌培養(yǎng)在含抗生素的MM基中 b 菌絲過濾法 適用于絲狀生長(zhǎng)的真菌或放線菌原理 基本培養(yǎng)基上只有發(fā)育成菌絲 auxo孢子可通過濾膜 野生型菌絲不能通過 3 營(yíng)養(yǎng)缺陷型的檢出 同一培養(yǎng)皿上有夾層培養(yǎng)法限量補(bǔ)充培養(yǎng)法不同的培養(yǎng)皿上有逐個(gè)檢出法影印接種法 影印培養(yǎng)法 完全培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基 a b c 基本培養(yǎng)基 完全培養(yǎng)基 夾層培養(yǎng)法及其結(jié)果 中間一層含菌 4 鑒定缺陷型 生長(zhǎng)譜法 Auxanography 在混有供試菌的平板表面點(diǎn)加微量營(yíng)養(yǎng)物 視某營(yíng)養(yǎng)物的周圍是否長(zhǎng)菌來確定該供試菌的營(yíng)養(yǎng)要求的一種快速直觀的方法 操作過程營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞培養(yǎng)制備菌種懸液平板傾注 區(qū)域劃分添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)粉末培養(yǎng)觀察類似方法可以測(cè)定雙重或多重營(yíng)養(yǎng)缺陷型 5 缺陷型的應(yīng)用 作為菌株的遺傳標(biāo)記 進(jìn)行基因工程 誘變育種研究代謝過程時(shí)用作親本標(biāo)記 作為生產(chǎn)菌種 氨基酸 核苷酸等生產(chǎn)菌種 作為氨基酸 維生素 堿基的測(cè)定菌株 基因重組 兩個(gè)獨(dú)立基因組內(nèi)的遺傳基因 通過一定的途徑轉(zhuǎn)移到一起 形成新的穩(wěn)定基因組的過程 稱為基因重組 雜交 指在細(xì)胞水平上進(jìn)行的一種遺傳重組方式 第四節(jié)基因重組和雜交育種 細(xì)菌的三種水平基因轉(zhuǎn)移形式 接合 轉(zhuǎn)導(dǎo) 自然轉(zhuǎn)化 原核微生物基因重組的特點(diǎn) 1 片段性 僅一小段DNA參與重組2 單向性 即從供體菌向受體菌作單方向轉(zhuǎn)移3 轉(zhuǎn)移機(jī)制獨(dú)特而多樣 接合 conjugation 細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸 由F因子介導(dǎo) 轉(zhuǎn)導(dǎo) transduction 由噬菌體介導(dǎo) 自然遺傳轉(zhuǎn)化 naturalgenetictransformation 游離DNA分子 感受態(tài)細(xì)胞 一 細(xì)菌的接合作用 conjugation 通過細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸而產(chǎn)生的遺傳信息的轉(zhuǎn)移和重組過程 1 實(shí)驗(yàn)證據(jù) 1946年 JoshuaLederberg和EdwardL Tatum細(xì)菌的多重營(yíng)養(yǎng)缺陷型雜交實(shí)驗(yàn) 中間平板上長(zhǎng)出的原養(yǎng)型菌落是兩菌株之間發(fā)生了遺傳交換和重組所致 證實(shí)接合過程需要細(xì)胞間的直接接觸的 U 型管實(shí)驗(yàn) BernardDavis 1950 BernardDavisUtubeexpreiment 1950 2 機(jī)制 大腸桿菌的接合機(jī)制 接合作用是由一種被稱為F因子的質(zhì)粒介導(dǎo) F因子的分子量通常為5 107 上面有編碼細(xì)菌產(chǎn)生性菌毛 sexpili 及控制接合過程進(jìn)行的20多個(gè)基因 含有F因子的細(xì)胞 雄性 菌株 F 其細(xì)胞表面有性菌毛 不含F(xiàn)因子的細(xì)胞 雌性 菌株 F 細(xì)胞表面沒有性菌毛 F因子為附加體質(zhì)粒既可以脫離染色體在細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立存在 也可插入 整合 到染色體上 F因子的四種細(xì)胞形式 a F 菌株 不含F(xiàn)因子 沒有性菌毛 但可以通過接合作用接收F因子而變成雄性菌株 F b F 菌株 F因子獨(dú)立存在 細(xì)胞表面有性菌毛 c Hfr菌株 F因子插入到染色體DNA上 細(xì)胞表面有性菌毛 d F 菌株 Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離染色體時(shí) 形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子 特稱為F 因子 細(xì)胞表面同樣有性菌毛 1 F F 雜交 雜交的結(jié)果 給體細(xì)胞和受體細(xì)胞均成為F 細(xì)胞 理化因子的處理可將F因子消除而使F 菌株變成F 菌株 F 菌株的F因子向F 細(xì)胞轉(zhuǎn)移 但含F(xiàn)因子的宿主細(xì)胞的染色體DNA一般不被轉(zhuǎn)移 Hfr菌株的F因子插入到染色體DNA上 因此只要發(fā)生接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移過程 就可以把部分甚至全部細(xì)菌染色體傳遞給F 細(xì)胞并發(fā)生重組 由此而得名為高頻重組菌株 2 Hfr F 雜交 Hfr菌株仍然保持著F 細(xì)胞的特征 具有F性菌毛 并象F 一樣與F 細(xì)胞進(jìn)行接合 所不同的是 當(dāng)OriT序列被缺刻螺旋酶識(shí)別而產(chǎn)生缺口后 F因子的先導(dǎo)區(qū) leadingregion 結(jié)合著染色體DNA向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移 F因子除先導(dǎo)區(qū)以外 其余絕大部分是處于轉(zhuǎn)移染色體的末端 由于轉(zhuǎn)移過程常被中斷 因此F因子不易轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中 故Hfr F 雜交后的受體細(xì)胞 或接合子 大多數(shù)仍然是F 染色體上越靠近F因子的先導(dǎo)區(qū)的基因 進(jìn)入的機(jī)會(huì)就越多 在F 中出現(xiàn)重組子的的時(shí)間就越早 頻率也高 F因子不易轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中 故Hfr F 雜交后的受體細(xì)胞 或稱接合子 大多數(shù)仍然是F 3 F F 雜交 Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離染色體時(shí) 形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子 特稱為F 因子 F F 與F F 的不同 給體的部分染色體基因隨F 一起轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞 a 與染色體發(fā)生重組 b 繼續(xù)存在于F 因子上 形成一種部分二倍體 細(xì)胞基因的這種轉(zhuǎn)移過程又常稱為性導(dǎo) sexduction F因子轉(zhuǎn)導(dǎo) F duction 或F因子媒介的轉(zhuǎn)導(dǎo) F mediatedtransduction 二 細(xì)菌的轉(zhuǎn)導(dǎo) transduction 由噬菌體介導(dǎo)的細(xì)菌細(xì)胞間進(jìn)行遺傳交換的一種方式 一個(gè)細(xì)胞的DNA通過病毒載體的感染轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞中 能將一個(gè)細(xì)菌宿主的部分染色體或質(zhì)粒DNA帶到另一個(gè)細(xì)菌的噬菌體稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體 細(xì)菌轉(zhuǎn)導(dǎo)的二種類型 普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo) 局限性轉(zhuǎn)導(dǎo) 1 普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo) generalizedtransduction 噬菌體可以轉(zhuǎn)導(dǎo)給體染色體的任何部分到受體細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程 1 意外的發(fā)現(xiàn) 1951年 JoshuaLederberg和NortonZinder為了證實(shí)大腸桿菌以外的其它菌種是否也存在接合作用 用二株具不同的多重營(yíng)養(yǎng)缺陷型的鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行類似的實(shí)驗(yàn) 用 U 型管進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)時(shí) 在給體和受體細(xì)胞不接觸的情況下 同樣出現(xiàn)原養(yǎng)型細(xì)菌 沙門氏菌LT22A是攜帶P22噬菌體的溶源性細(xì)菌另一株是非溶源性細(xì)菌 一個(gè)表面看起來的常規(guī)研究卻導(dǎo)致一個(gè)驚奇和十分重要發(fā)現(xiàn)的重要例證 基因的傳遞很可能是由可透過 U 型管濾板的P22噬菌體介導(dǎo)的 普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)這一重要的基因轉(zhuǎn)移途徑的發(fā)現(xiàn) 轉(zhuǎn)導(dǎo)模型 2 普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo) 轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體為什么 錯(cuò) 將宿主的DNA包裹進(jìn)去 噬菌體的DNA包裝酶酶也能識(shí)別染色體DNA上類似pac的位點(diǎn)并進(jìn)行切割 以 headful 的包裝機(jī)制包裝進(jìn)P22噬菌體外殼 形成只含宿主DNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體顆粒 假噬菌體 因?yàn)槿旧w上的pac與P22DNA的pac序列不完全相同 利用效率較低 這種 錯(cuò)裝 機(jī)率一般僅約10 6 10 8 形成轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒的噬菌體可以是溫和的也可以是烈性的 但必須具有能偶爾識(shí)別宿主DNA的包裝機(jī)制并在宿主基因組完全降解以前進(jìn)行包裝 普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的基本要求 普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的三種后果 進(jìn)入受體的外源DNA通過與細(xì)胞染色體的重組交換而形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子 外源DNA被降解 轉(zhuǎn)導(dǎo)失敗 流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo) abortivetransduction DNA不能復(fù)制 因此群體中僅一個(gè)細(xì)胞含有DNA 而其它細(xì)胞只能得到其基因產(chǎn)物 形成微小菌落 轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA不能進(jìn)行重組和復(fù)制 但其攜帶的基因可經(jīng)過轉(zhuǎn)錄而得到表達(dá) 特點(diǎn) 在選擇培養(yǎng)基平板上形成微小菌落 流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo) abortivetransduction 2 局限性轉(zhuǎn)導(dǎo) specializedtransduction 溫和噬菌體感染 整合到細(xì)菌染色體的特定位點(diǎn)上宿主細(xì)胞發(fā)生溶源化 溶源菌因誘導(dǎo)而發(fā)生裂解時(shí) 在前噬菌體二側(cè)的少數(shù)宿主基因因偶爾發(fā)生的不正常切割而連在噬菌體DNA上 部分缺陷的溫和噬菌體 把供體菌的少數(shù)特定基因轉(zhuǎn)移到受體菌中 2 局限性轉(zhuǎn)導(dǎo) specializedtransduction 溫和噬菌體 裂解時(shí)的不正常切割 包含gal或bio基因 幾率一般僅有10 6 局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)與普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要區(qū)別 a 局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)被轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因共價(jià)地與噬菌體DNA連接 與噬菌體DNA一起進(jìn)行復(fù)制 包裝以及被導(dǎo)入受體細(xì)胞中 而普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝的可能全部是宿主菌的基因 b 局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒攜帶特定的染色體片段并將固定的個(gè)別基因?qū)胧荏w 故稱為局限性轉(zhuǎn)導(dǎo) 而普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)攜帶的宿主基因具有隨機(jī)性 2 局限性轉(zhuǎn)導(dǎo) specializedtransduction 溶源轉(zhuǎn)變 lysogenicconversion 一個(gè)與轉(zhuǎn)導(dǎo)相似又不同的現(xiàn)象 溫和噬菌體感染細(xì)胞后使之發(fā)生溶源化 因噬菌體的基因整合到宿主染色體上 而使后者獲得了新性狀的現(xiàn)象 溶源轉(zhuǎn)變與轉(zhuǎn)導(dǎo)的不同 a 不攜帶任何供體菌的基因 b 這種噬菌體是完整的 而不是缺陷的 三 細(xì)菌的遺傳轉(zhuǎn)化 genetictransformation 定義 同源或異源的游離DNA分子 質(zhì)粒和染色體DNA 被自然或人工感受態(tài)細(xì)胞攝取 并得到表達(dá)的水平方向的基因轉(zhuǎn)移過程 自然遺傳轉(zhuǎn)化 naturalgenetictransformation 人工轉(zhuǎn)化 artificialtransformation 感受態(tài)細(xì)胞 具有攝取外源DNA能力的細(xì)胞 competentcell 自然感受態(tài)與人工感受態(tài)的不同 自然感受態(tài)的出現(xiàn)是細(xì)胞一定生長(zhǎng)階段的生理特性 受細(xì)菌自身的基因控制 人工感受態(tài)則是通過人為誘導(dǎo)的方法 使細(xì)胞具有攝取DNA的能力 或人為地將DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi) 該過程與細(xì)菌自身的遺傳控制無(wú)關(guān) 1 自然遺傳轉(zhuǎn)化 簡(jiǎn)稱自然轉(zhuǎn)化 1928年 Griffith發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌 Streptococcuspneumoniae 的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象 目前已知有二十多個(gè)種的細(xì)菌具有自然轉(zhuǎn)化的能力 進(jìn)行自然轉(zhuǎn)化 需要二方面必要的條件 建立了感受態(tài)的受體細(xì)胞 外源游離DNA分子 枯草芽孢桿菌的自然轉(zhuǎn)化過程 革蘭氏陽(yáng)性菌的轉(zhuǎn)化模型 Themechanismofbacterialtransformation 自然轉(zhuǎn)化過程的特點(diǎn) a 對(duì)核酸酶敏感 c 轉(zhuǎn)化是否成功及轉(zhuǎn)化效率的高低主要取決于轉(zhuǎn)化 DNA 給體菌株和轉(zhuǎn)化受體菌株之間的親源關(guān)系 d 通常情況下質(zhì)粒的自然轉(zhuǎn)化效率要低得多 b 不需要活的DNA給體細(xì)胞 噬菌體DNA被感受態(tài)細(xì)胞攝取并產(chǎn)生有活性的病毒顆粒 轉(zhuǎn)染 transfection 現(xiàn)在把DNA轉(zhuǎn)移至動(dòng)物細(xì)胞的過程也稱轉(zhuǎn)染 提純的噬菌體DNA以轉(zhuǎn)化的 而非感染 途徑進(jìn)入細(xì)胞并表達(dá)后產(chǎn)生完整的病毒顆粒 特點(diǎn) Conjugation Transformation Transduction 接合 conjugation 細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸 由F因子介導(dǎo) 轉(zhuǎn)導(dǎo) transduction 由噬菌體介導(dǎo) 自然遺傳轉(zhuǎn)化 naturalgenetictransformation 游離DNA分子 感受態(tài)細(xì)胞 接合 轉(zhuǎn)導(dǎo) 及 自然轉(zhuǎn)化 這三種在自然界中存在的細(xì)菌遺傳重組過程各自的特點(diǎn) a 外源DNA的來源及進(jìn)入途徑有差異 b 決定因素也各有不同 如何設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)三種途徑進(jìn)行區(qū)分 2 人工轉(zhuǎn)化 用CaCl2處理細(xì)胞 電穿孔等是常用的人工轉(zhuǎn)化手段 在自然轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上發(fā)展和建立的一項(xiàng)細(xì)菌基因重組手段 是基因工程的奠基石和基礎(chǔ)技術(shù) 不是由細(xì)菌自身的基因所控制 用多種不同的技術(shù)處理受體細(xì)胞 使其人為地處于一種可以攝取外源DNA的 人工感受態(tài) 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率高 四 原生質(zhì)體融合 原生質(zhì)體融合 定義 通過人為的方式 使遺傳性狀不同的兩細(xì)胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合 并進(jìn)而發(fā)生遺傳重組以產(chǎn)生同時(shí)帶有雙親性狀的遺傳性穩(wěn)定的融合子的過程 原生質(zhì)體與上述各種雜交方式的比較 1 雜交頻率高2 致育型的限制較少3 遺傳物質(zhì)的傳遞更完整原生質(zhì)體融合的對(duì)象 能進(jìn)行原生質(zhì)體融合的細(xì)胞有 細(xì)菌 放線菌 及各種真核細(xì)胞 如霉菌 酵母菌以及高等動(dòng)植物的細(xì)胞 原生質(zhì)體的融合步驟如下 1 原生質(zhì)體的制備 作為制備原生質(zhì)體的親本菌株必須具備兩個(gè)特點(diǎn) a 具有良好的生產(chǎn)性狀 以經(jīng)融合使優(yōu)點(diǎn)疊加 b 具有一些穩(wěn)定的明顯的遺傳標(biāo)記制備原生質(zhì)體時(shí)所選用的菌體一般為對(duì)數(shù)后期的微生物 不同微生物破壁所用的酶的種類 濃度以及破壁時(shí)處理的溫度 時(shí)間 PH均不同 2 原生質(zhì)體融合僅用等量的原生質(zhì)體混合時(shí) 融合的頻率很低 加入PEG及Ca2 Mg2 可使原生質(zhì)表面形成電極性 相互吸引 形成聚合物 3 再生成正常細(xì)胞4 鑒定 二 真核微生物的基因重組 真核微生物的基因重組主要有有性雜交 準(zhǔn)性雜交 原生質(zhì)體融合和轉(zhuǎn)化等