堿裂解發(fā)制備質(zhì)粒DNA原理試驗(yàn)原理： 堿裂解法是較常用的提取的方法。其優(yōu)點(diǎn)是收獲率高，適于多數(shù)的菌株，所得產(chǎn)物經(jīng)純化后可滿足多數(shù)的DNA重組操作。十二烷基磺酸鈉進(jìn)行質(zhì)粒的小量制備。十二烷基磺酸鈉（SDS）是一種陰離子表面活性劑，它既能使細(xì)菌細(xì)胞裂解，又能使一些蛋白質(zhì)變性（NaOH對(duì)細(xì)胞的裂解作用強(qiáng)于SDS）。用SDS處理細(xì)菌后，會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞破裂，釋放出質(zhì)粒 DNA和染色體DNA，兩種DNA在強(qiáng)堿環(huán)境都會(huì)變性。由于質(zhì)粒和主染色體的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不同，變性時(shí)前者雖然兩條鏈分離，卻仍然纏繞在一起不分開(kāi)；但后者完全變性分甚至出現(xiàn)斷裂，因此，當(dāng)加入pH4.8的酸性乙酸鉀降低溶液pH值，使溶液pH值恢復(fù)較低的近中性水平時(shí)，質(zhì)粒的兩條小分子單鏈可迅速?gòu)?fù)性恢復(fù)雙鏈結(jié)構(gòu)，但是主染色體DNA則難以復(fù)性。在離心時(shí)，大部分主染色體與細(xì)胞碎片，雜質(zhì)等纏繞一起被沉淀，而可溶性的質(zhì)粒DNA留在上清夜中。再由異丙醇沉淀、乙醇洗滌，可得到純化的質(zhì)粒DNA。堿裂解法提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切、pcr擴(kuò)增、銀染序列分析等。 各試劑的作用： 1、溶液:pH8.0 GET緩沖液（50mmol葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/L TrisHCl）；溶液可成批配制，在10 lbf/in2(6.895x104Pa)高壓下蒸氣滅菌15min，貯存于。葡萄糖的作用是使懸浮后的大腸桿菌不會(huì)很快沉積到管子的底部，增加溶液的粘度，維持滲透壓及防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2 和Mg2等二價(jià)金屬離子的螯合劑，在溶液I中加入EDTA，是要把大腸桿菌細(xì)胞中的二價(jià)金屬離子都螯合掉。從而起到抑制DNase對(duì)DNA的降解和抑制微生物生長(zhǎng)的作用。 2、溶液：0.2mol/LNaOH(內(nèi)含1%的SDS)，這個(gè)用的時(shí)候需現(xiàn)配。要新配置溶液是為了避免NaOH接觸空氣中的CO2而減弱了堿性。NaOH是最佳溶解細(xì)胞的試劑。不管是大腸桿菌還是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，碰到了堿都會(huì)在瞬間溶解，這是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化。用不新鮮的0.4 N NaOH，即便有SDS也無(wú)法有效溶解大腸桿菌。SDS是離子型表面活性劑。它主要作用是：a溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，從而破壞細(xì)胞膜。b解聚細(xì)胞中的核蛋白。c能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3-R-蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來(lái)。SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在接下來(lái)的提取過(guò)程必須把它去除干凈，以便下一步試驗(yàn)的更好進(jìn)行。 3、溶液：pH4.8乙酸鉀溶液（60ml 5mol/L KAc，11.5ml冰醋酸，28.5mlH2O）；該溶液鉀離子濃度為3mol/L，醋酸根離子濃度為5mol/L.pH4.8的乙酸鉀溶液是為了把抽提液的pH調(diào)至中性，從而使變性的質(zhì)粒DNA復(fù)性，且穩(wěn)定存在。溶液III加入后的沉淀實(shí)際上是K+置換了SDS中的Na+形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白復(fù)合物凝聚，使得沉淀更完全。前者是因?yàn)橹泻秃怂嵘系碾姾?，減少相斥力而互相聚合，后者是因?yàn)辂}與SDS蛋白復(fù)合物作用后，能形成較小的鹽形式復(fù)合物。 4、異丙醇；采用PEG（6000）沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的濃度也不同，PEG的濃度低，選擇性沉淀DNA分子量大，大分子所需PEG的濃度只需1%左右，小分子所需PEG濃度高達(dá)20%。5、無(wú)水乙醇：乙醇可以以任意比和水相混溶，而DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，同時(shí)乙醇與核酸不起化學(xué)反應(yīng)，因此是理想的沉淀劑。加入的乙醇后，乙醇會(huì)奪去DNA周圍的水分子，DNA失水聚合。一般實(shí)驗(yàn)中，是加2倍體積的無(wú)水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最終含量占67%左右。也可改用95%乙醇來(lái)替代無(wú)水乙醇。但是加95%的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時(shí)，就會(huì)影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時(shí)可用95%乙醇代替無(wú)水乙酵，最后的沉淀步驟要使用無(wú)水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置1530min即可。但因?yàn)槭褂卯惐紩r(shí)常把鹽沉淀下來(lái)，所以較多的還是使用乙醇。 6、pH8.0TE緩沖液；10mmol/LTrisHCl，1mmol/L EDTA，其中含 RNA酶 20g/ml。在基因操作實(shí)驗(yàn)中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分干擾作用。磷酸鹽緩沖系統(tǒng)（pKa7.2）和硼酸系統(tǒng)（pKa=9.24)等雖然也都符合細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的生理范圍(pH)，可作DNA的保存液，但在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，磷酸根離子的種類及數(shù)量將與Ca2+產(chǎn)生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反應(yīng)時(shí)，不同的酶對(duì)輔助因子的種類及數(shù)量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的緩沖系統(tǒng)，由于緩沖液是TrisH+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時(shí)，大都采用Tris-HCl系統(tǒng)，而TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)定DNA的活性。酚與水有一定的互溶，苯酚用水飽和的目的是使其抽提DNA過(guò)程中，不致吸收樣品中含有DNA的水分，減少DNA的損失。 用Tris調(diào)節(jié)至pH為8是因?yàn)镈NA在此條件下比較穩(wěn)定。在中性或堿性條件下（pH57），RNA比DNA更容易游離到水相，所以可獲得RNA含量較少的DNA樣品。 7、70%乙醇 試驗(yàn)步驟: 1、無(wú)菌操作臺(tái)上,取1.5ml培養(yǎng)菌體置于離心管（Eppendorf管）中，微量離心機(jī)上以10000rpm離心1min，或者以4000rpm離心510min，棄上清液，離心管倒扣于干凈的吸水紙上吸干。 2、沉淀中加100l用冰預(yù)冷的溶液I，加或不加入少量溶菌酶粉末，充分混合（需要?jiǎng)×艺袷帲?。室溫下放?0min。 3、加入200l溶液 II(新鮮配置)，加蓋后輕輕快速顛倒離心管數(shù)次混勻（千萬(wàn)不要振蕩），冰浴5 min 。 4、加入150l預(yù)冷溶液III，輕輕顛倒數(shù)次混勻（10s），置于冰浴15 min 。 5、微量離心機(jī)上以4，12000rpm離心15min，取上清液于另一新Eppendorf管中。 6、上清夜中加入等體積酚/氯仿（1：1）混勻，微量離心機(jī)上以4，12000rpm,離心5min。經(jīng)驗(yàn)之談：如果選用宿主合適的話（如 DH5a、XL1-red等，HB101和BL21則不行），可以不用酚氯仿抽提這一步。用1倍體積的乙醇沉淀，沉淀中所含的鹽和RNA就很少了，完全去除上清液后就可以直接加TE溶解質(zhì)粒，后續(xù)的限制性酶切、轉(zhuǎn)化完全沒(méi)有問(wèn)題。僅供參考 7、小心轉(zhuǎn)上層至一新的離心管棄去中層的蛋白質(zhì)和下層的有機(jī)相。 8、小心移出上清于一新Eppendorf管中,加入2 /3倍體積異丙醇,混勻,4離心12000g5min。 9、上清夜中加入2倍體積的無(wú)水乙醇混勻，室溫下放置5min10min，以12000rpm,離心5min-15min。 10、1.0ml預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀1 2次,沉淀在室溫下晾干。 11、小心吸去上清夜，將離心管倒置于一張紙上，使所有的液體流出。再將附著在管壁上的液滴除去。在除去管壁上的液滴時(shí)，可以用一次性吸頭與真空管相連，用吸頭接觸液面。但在液體吸出時(shí)應(yīng)當(dāng)盡量使吸頭遠(yuǎn)離核酸沉淀。自然干燥或者真空抽干到看不到液滴最好。 12、加入50lTE緩沖液（PH 8.0 含20g/mlRNaseA）溶解質(zhì)粒粗提物，在-20保存。 注意事項(xiàng)： 提取過(guò)程應(yīng)盡量在低溫環(huán)境中進(jìn)行，蛋白質(zhì)的去除以酚/氯仿混合效果最好，可以采取多次抽提盡量將蛋白質(zhì)除干凈，在沉淀DNA 時(shí)通常使用冰乙醇，在低溫條件下放置可使DNA沉淀完全。同時(shí)反應(yīng)中加入的鹽濃度一定要控制好，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時(shí)，只有部分DNA形成DNA鉀鹽而聚合，這樣就造成DNA沉淀不完全，當(dāng)加入的鉀溶液濃度太高時(shí)，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于過(guò)多的鹽雜質(zhì)存在，影響DNA的酶切等反應(yīng)，必須要進(jìn)行洗滌或重沉淀。一般情況下都是加入的最終濃度達(dá)0.10.25mol/L為宜。溶液I中各成分的作用葡萄糖是使懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部，因此有些試劑廠商的溶液I沒(méi)有葡萄糖成分；EDTA是Ca2+；和Mg2+等二價(jià)金屬離子的螯合劑，其主要目的是為了螯合二價(jià)金屬離子從而達(dá)到抑制DNase的活性。溶液II中各成分的作用NaOH主要是為了溶解細(xì)胞，釋放DNA，因?yàn)樵趶?qiáng)堿性的情況下，細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的變化；但NaOH易和空氣中的CO2發(fā)生反應(yīng)，形成碳酸鈉，降低了NaOH的堿性，所以必須用新鮮的NaOH。SDS與NaOH聯(lián)用，其目的是為了增強(qiáng)NaOH的強(qiáng)堿性，同時(shí)SDS能很好地結(jié)合蛋白，產(chǎn)生沉淀。這一步要記住兩點(diǎn)：第一，時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，因?yàn)樵谶@樣的堿性條件下基因組DNA片斷會(huì)慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合，不然基因組DNA會(huì)斷裂。溶液III中各成分的作用溶液III中的醋酸鉀是為了使鉀離子置換SDS中的納離子而形成了PDS，因?yàn)槭榛蛩徕c（sodiumdodecylsulfate）遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀 （potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是不溶水的，同時(shí)一個(gè)SDS分子平均結(jié)合兩個(gè)氨基酸，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了。2 M的醋酸是為了中和NaOH，因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的堿性條件會(huì)打斷DNA，所以要中和?；蚪MDNA一旦發(fā)生斷裂，只要是50100 kb大小的片斷，就沒(méi)有辦法再被 PDS共沉淀了，所以堿處理的時(shí)間要短，而且不得激烈振蕩，不然最后得到的質(zhì)粒上總會(huì)有大量的基因組DNA混入，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總DNA條帶。75%酒精主要是為了清洗鹽份和抑制Dnase；同時(shí)溶液III的強(qiáng)酸性也是為了使DNA更好地結(jié)合在硅酸纖維膜上。得到的質(zhì)粒樣品一般用含RNase（50 ug/ml）的TE緩沖液進(jìn)行溶解，不然大量未降解的RNA會(huì)干擾電泳結(jié)果的。瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定質(zhì)粒DNA時(shí)，多數(shù)情況下你能看到三條帶，但千萬(wàn)不要認(rèn)為你看到的是超螺旋、線性和開(kāi)環(huán)(環(huán)裝質(zhì)粒一條單鏈發(fā)生缺刻)這三條帶（泳動(dòng)速度:共價(jià)閉合環(huán)狀線性開(kāi)環(huán)）。堿法抽提得到質(zhì)粒樣品中不含線性DNA，不信的話你用EcoRI來(lái)線性化質(zhì)粒后再進(jìn)行瓊脂糖電泳，就會(huì)看到線性質(zhì)粒DNA的位置與這三條帶的位置不一樣。其實(shí)這三條帶以電泳速度的快慢而排序，分別是超螺旋、開(kāi)環(huán)和復(fù)制中間體（即沒(méi)有復(fù)制完全的兩個(gè)質(zhì)粒連在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后過(guò)度振蕩，會(huì)有第四條帶，這條帶泳動(dòng)得較慢，遠(yuǎn)離這三條帶，是20-100 kb的大腸桿菌基因組DNA的片斷。所有的質(zhì)粒抽提方法首先都要考慮如下幾點(diǎn)：如何去除 RNA，如何將質(zhì)粒與細(xì)菌基因組 DNA 分開(kāi)，如何去除蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)。去除 RNA 相對(duì)比較簡(jiǎn)單，首先是使用 RNase 消化 (抽提中或者抽提后)。經(jīng)過(guò) RNase 消化后，RNA 變得比較小了，其殘留對(duì)酶切反應(yīng)幾乎沒(méi)有影響。如果要徹底去除殘留得 RNA，則需要更煩瑣的操作。將質(zhì)粒與細(xì)菌基因組 DNA 分開(kāi)，基本上是采用兩種辦法：一是利用酶/弱去污劑部分裂解細(xì)菌，在抽提時(shí)只讓質(zhì)粒從細(xì)菌中釋放出來(lái)，而不讓基因組 DNA 從細(xì)菌中出來(lái)，從而將質(zhì)粒和基因組 DNA 分開(kāi)；二是利用 NaOH/SDS 完全裂解細(xì)菌，讓質(zhì)粒和細(xì)菌基因組 DNA 都從細(xì)菌中出來(lái)，再利用質(zhì)粒和基因組 DNA 在變性/復(fù)性過(guò)程中的不同表現(xiàn)，將質(zhì)粒與基因組 DNA 分開(kāi)。去除蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)，基本上是與去除細(xì)菌基因組同時(shí)實(shí)現(xiàn)的。但是，依據(jù)不同的細(xì)菌，不同的培養(yǎng)條件，以及操作時(shí)的精細(xì)程度等，雜質(zhì)的殘留量會(huì)不同。所以，通常需要使用苯酚做更進(jìn)一步的純化。經(jīng)過(guò)上面的處理，沉淀下來(lái)的質(zhì)?；旧峡梢杂糜诿盖辛?。如果要用于更高級(jí)的實(shí)驗(yàn)，如轉(zhuǎn)染，則需要做進(jìn)一步的純化，如 CsCl 超離心。 實(shí)驗(yàn)前方法/試劑的選擇首選方法是堿裂解法。如果有問(wèn)題，或者是大質(zhì)粒 (15 kb)，則用溫和的方法 SDS 裂解法。詳細(xì)情況見(jiàn)“分子克隆”。試劑盒幾乎都使用堿裂解法，所以都有一個(gè)通病，抽提大質(zhì)粒時(shí)效果不好。關(guān)于堿裂解法質(zhì)粒抽提最常用的方法是堿裂解法，它具有得率高，適用面廣，快速，純度高等特點(diǎn)。當(dāng)然，堿裂解法也有缺陷：容易導(dǎo)致不可逆的變性；不適合大質(zhì)粒的抽提。堿裂解法是很劇烈的方法，質(zhì)粒在堿性條件下會(huì)變性，時(shí)間一長(zhǎng)，這種變性就成為不可逆的了 (電泳時(shí)在超螺旋前面一點(diǎn)點(diǎn)，如果有一條帶，就是此變性的質(zhì)粒。)。所以，要降低不可逆的變性，就要控制好堿裂解的時(shí)間。（似乎可以做這么一個(gè)推理：在堿性條件下，質(zhì)粒的兩條鏈從一點(diǎn)或者幾個(gè)點(diǎn)開(kāi)始分開(kāi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，直到完全分開(kāi)。理論上講，完全分開(kāi)的兩條鏈要很快地配對(duì)復(fù)性，成功率肯定不可能是 100%的，而沒(méi)有完全分開(kāi)的兩條鏈卻完全可能 100% 配對(duì)復(fù)性） 堿裂解法不適合大質(zhì)粒的抽提，原因也是因?yàn)樵摲椒ㄌ珓×?，使超螺旋比例較低。文獻(xiàn)推薦的抽提大質(zhì)粒的方法是溫和得多的方法，缺點(diǎn)是得率要低一些。現(xiàn)在得問(wèn)題是，大質(zhì)粒的拷貝數(shù)本來(lái)就低，如果抽提方法得率再不高的話，抽提起來(lái)就很費(fèi)力了。如果注意到在堿裂解法中，超螺旋比例隨著堿裂解時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，隨著粘稠度的增加而減低這個(gè)現(xiàn)象，完全可以使用堿裂解法來(lái)抽提大質(zhì)粒的：增加試劑的使用量，使加入NaOH/SDS液后，溶液在1分鐘內(nèi)就能變得很清澈；立即加入中和試劑。 質(zhì)粒抽提的 8 大竅門(mén)1：搖菌時(shí)間。過(guò)夜培養(yǎng)是一個(gè)普遍接受的概念，而且適合大部分情況。如果出現(xiàn)了問(wèn)題，調(diào)整培養(yǎng)時(shí)間會(huì)有幫助：Nick 多，則增加培養(yǎng)時(shí)間；酶切出現(xiàn)問(wèn)題，則減少培養(yǎng)時(shí)間。2：起始菌體量。大家習(xí)慣說(shuō)“從多少 ml 菌液中抽提質(zhì)?！?，但一定要養(yǎng)成每次都觀察菌體量的習(xí)慣，因?yàn)橘|(zhì)粒畢竟是在菌體中，而且，抽提質(zhì)粒所用的試劑量，都只與菌體量有關(guān)。3：菌體的徹底懸浮。如果沒(méi)有徹底懸浮菌體，則殘留的菌體團(tuán)塊在溶液 II 加入后，變成一個(gè)外圍幾乎徹底裂解，往里不完全裂解，中間沒(méi)有裂解的團(tuán)塊。這個(gè)團(tuán)塊在溶液 III 加入后，會(huì)有一部分蛋白質(zhì)繼續(xù)存在于溶液中，成為蛋白質(zhì)殘留的最大根源。4：使用相對(duì)過(guò)量的試劑。這是適合所有核酸抽提的建議。試劑相對(duì)過(guò)量的好處是：穩(wěn)定性好，純度高，操作更簡(jiǎn)單。如果認(rèn)為這樣不經(jīng)濟(jì)，就少用一點(diǎn)菌體。5：裂解時(shí)間。加入溶液 II 后，混勻，體系最好能立即變得清澈。體系如果變得清澈了，馬上加入溶液 III 中和。如果體系不馬上變清澈，下次少用一點(diǎn)菌液，或者多用一點(diǎn)溶液。如今的質(zhì)粒設(shè)計(jì)得越來(lái)越復(fù)雜了，奇怪的現(xiàn)象也越來(lái)越多，而所有的奇怪現(xiàn)象，多與裂解時(shí)間有關(guān)。6：中和的操作。在 1.5ml 離心管中加入溶液 III 后，先顛倒兩次，使管底朝上，用指頭彈擊管底數(shù)次，再顛倒混勻。效果非常好。7：中和后的離心去蛋白。一定要將蛋白質(zhì)徹底離心下去。如果發(fā)現(xiàn)離心后仍然有蛋白質(zhì)漂浮在液面，繼續(xù)離心的效果并不好；而將上清倒入另外一個(gè)離心管中，再離心，效果要好許多。降低 RNA 殘留的方法RNA 的去除，首先是使用 RNase 消化。在溶液 I 中加入高濃度的 RNase A (100ug/ml)，或者用含 25ug RNase A/ml TE 溶解抽提好的質(zhì)粒，都可以降低 RNA 殘留，但都不能徹底去除。幸運(yùn)的是，RNA 的殘留并不影響酶切等最常用的用途。如果想徹底去除 RNA 殘留，可以用試劑盒，或者使用對(duì) 4 個(gè)堿基都作用的 RNase。降低 gDNA 殘留的方法gDNA 的殘留問(wèn)題，必須在抽提過(guò)程中解決，否則，就只能用膠回收方法處理了。gDNA 越大，越難于復(fù)性，也就越容易被去除；所以，一定要盡可能不打斷 gDNA。裂解體系越粘稠，gDNA 越容易被扯斷；操作手法越重，gDNA 也越容易被打斷。溫和操作，使用相對(duì)過(guò)剩的試劑，是降低 gDNA 殘留的最好方法。降低蛋白質(zhì)殘留的方法蛋白質(zhì)的去除，主要是靠不溶解的 K-SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成。雖然將中和后的體系置于4一段時(shí)間，可以形成更多的該不溶復(fù)合物，從而使蛋白質(zhì)殘留更少，但實(shí)踐證明這樣做并不是必須的，除非是大量抽提。只要加入溶液 I 后的懸浮，加入溶液 II 后的裂解及加入溶液 III 后的中和是均勻徹底的，蛋白質(zhì)的殘留就應(yīng)該在可以滿足實(shí)驗(yàn)要求的水平；而只有溶液的用量足夠，甚至過(guò)剩，才能確保裂解和中和是徹底的。當(dāng)然，試劑盒及苯酚的使用，是可以更進(jìn)一步降低蛋白質(zhì)的殘留的。降低質(zhì)粒 Nick 的方法細(xì)菌收獲時(shí)間，菌株的選擇，抽提操作的劇烈程度是影響 Nick 的三個(gè)主要因素。細(xì)菌收獲過(guò)早，質(zhì)粒還在復(fù)制過(guò)程中，Nick 的比例較高；過(guò)晚，細(xì)菌開(kāi)始死亡，雜質(zhì)會(huì)比較多。如果使用胞內(nèi)酶含量很高的宿主菌，會(huì)出現(xiàn)較高比例的 Nick。加入溶液 II 及加入溶液 III 的混勻操作，也可以導(dǎo)致一些 Nick，但影響不會(huì)比前兩者大。降低變性超螺旋的方法理論上，用堿裂解法抽提質(zhì)粒，變性超螺旋的出現(xiàn)是不可避免的。之所以大家沒(méi)有非常在意，一是因?yàn)樗拇嬖谒坪鯇?duì)酶反應(yīng)沒(méi)有任何影響，二是因?yàn)樗暮坎⒉灰欢ǜ叩奖挥秒娪居^察到。抽提使用相對(duì)過(guò)剩的溶液，在加入溶液 II 后，體系能在 1 分鐘內(nèi)變澄清，再快速加入溶液 III，這樣基本上能將變性超螺旋的出現(xiàn)控制在電泳看不見(jiàn)的水平。 (變性超螺旋電泳時(shí)比正常超螺旋跑得快一點(diǎn)點(diǎn)。)關(guān)于質(zhì)粒多聚體QIAGEN 提供了一個(gè)沒(méi)有進(jìn)一步解釋的觀察：從有些宿主菌中抽提質(zhì)粒 (pTZ19)，電泳能發(fā)現(xiàn)很多條帶；但使用單酶切后，仍然變成一條帶，大小正好是線性單質(zhì)粒的大小。根據(jù)這一觀察，可以推理如下：那些大的條帶(質(zhì)粒多聚體)是由完整的單質(zhì)?！罢场痹谝黄鹦纬傻模皇俏业囊粭l鏈與你的一條鏈復(fù)性在一起；第二，這種“粘”只是部分的，否則酶切會(huì)有問(wèn)題；第三，這種“粘”是脆弱的，線性后的剛性足以打破它。如果是這樣，質(zhì)粒多聚體的出現(xiàn)與質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)及序列有關(guān)，可以不管它(也管不了)，因?yàn)樗挥绊懨盖?，或者說(shuō)，即使質(zhì)粒多聚體切不動(dòng)，也不會(huì)影響太大?？傊?，碰到這種情況，不要簡(jiǎn)單地認(rèn)為有問(wèn)題，而是應(yīng)該一步一步往下做，但一定要做完一步，檢測(cè)一次，看一看結(jié)果與預(yù)期的吻合程度。提高得率的方法利用氯霉素抑制染色體的復(fù)制，而不抑制質(zhì)粒的復(fù)制這一特點(diǎn)，在低拷貝質(zhì)粒的培養(yǎng)過(guò)程中添加氯霉素可以大大提高得率。 為什么酶切后質(zhì)?？偸墙到?？酶切后質(zhì)粒降解的原因很多，但如果用實(shí)驗(yàn)方法排除了質(zhì)粒的質(zhì)量及酶的質(zhì)量因素后 (用 A 酶