基于SP細胞分選法初步鑒定卵巢癌干細胞表面標(biāo)志 作者：張弦蔣翠蓮?fù)鯇殏苿⑺N左鵬飛趙楓姝竇駿【摘要】 目的： 基于側(cè)群（SP）細胞分選方法，初步鑒定卵巢癌干細胞（CSC) 表面標(biāo)志，為臨床靶向治療卵巢癌提供靶分子。方法： 檢測、分離卵巢癌細胞株A2780中的SP細胞，并對SP與NonSP細胞作細胞生物學(xué)鑒定，包括克隆形成能力、致瘤能力、耐藥性、定量ATP結(jié)合框蛋白家族G2蛋白 (ABCG2)檢測等；進一步用免疫磁選方法篩出ABCG2+及ABCG2-細胞，同樣作上述細胞生物學(xué)鑒定，探討ABCG2分子能否作為卵巢CSC的表面標(biāo)志。結(jié)果： 卵巢癌A2780細胞株中的SP細胞在體外強克隆形成能力、裸鼠體內(nèi)的高致瘤性、對化療藥物長春新堿較強耐受性及高表達ABCG2分子等生物學(xué)特性基本符合CSC的特征。ABCG2細胞的克隆增殖能力略強于ABCG2-細胞；ABCG2+細胞的耐藥性與SP細胞的耐藥性一致。結(jié)論： A2780細胞株中的SP細胞基本符合CSC的生物學(xué)特征，其高表達的ABCG2分子參與維持SP細胞表型，特別是多藥耐藥性。ABCG2分子可作為靶向治療CSC的靶分子，逆轉(zhuǎn)腫瘤的多藥耐藥性。 【關(guān)鍵詞】 側(cè)群細胞卵巢癌癌干細胞ABCG2分子靶向治療 Abstract： Objective To explore a target molecule for the clinical targeted therapy of ovarian cancer. Methods The SP cells and non SP cells were isolated respectively from the human ovarian cell 2780 strain by fluorescence activated cell sorting (FACS) and their biological characteristics were identified by analysis of their ability to form colonies in common media, tumorigenicity in Balb/c nude mice, and of their resistance to chemotherapeutic agents vinblastin. The expression of ABCG2 was detected with realtime quantitative RTPCR (qRTPCR). The specific ABCG2 phenotype cells were further isolated from the ovarian cell A2780 strain for the same identification as above by the monoantibody labeled with immune magnetic beads by magnetic activated cell sorting system. Results The SP cells proliferative potency, clone formation ability in the common media, the tumorigenicity in Balb/c nude mice, and resistance to vinblastin in vitro were basically coincident with characteristics of cancer stem cells（CSC）. The ABCG2cells proliferative potency and resistance to vinblastin in vitro were higher than those of the ABCG2-cells. Conclusion The SP cells in the ovarian cell 2780 strain possess the traits of ovarial CSC and expressed ABCG2 molecule maintains the SP cells phenotype, especially in multidrug resistance. The ABCG2 molecule may be responsible for target molecule of the targeted therapy of ovarian cancer and for inversion of multidrug resistance in ovarian cancer. Key words：side population cells; ovarian cancer; cancer stem cells; ABCG2 molecule; target therapy 卵巢癌是女性生殖器官常見腫瘤，發(fā)病率在婦科惡性腫瘤中列居第三，但其致死率卻為各類婦科腫瘤之首1，因此，探索治療卵巢癌的新途徑，已成為進一步提高卵巢癌患者生存率的關(guān)鍵。隨著干細胞(stem cells, SC)研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)腫瘤是一種SC疾病。許多證據(jù)表明，大多數(shù)的腫瘤組織中存在著具有SC特征的“起始腫瘤細胞”(tumor initial cells, TIC)，稱為癌干細胞(cancer stem cells, CSC)，其是腫瘤增長、耐藥及復(fù)發(fā)的根源2。分離與鑒定是CSC研究的第一步，由于CSC缺乏已知的統(tǒng)一特異性標(biāo)記，分離和鑒定成為CSC研究的難點。本研究主要通過側(cè)群（side population，SP）細胞分選結(jié)合結(jié)合框蛋白家族2蛋白（binding cassette G2, ABCG2)等方法初步研究卵巢CSC，其中SP細胞是指可將熒光染料Hoechst33342泵出細胞外、表現(xiàn)弱熒光信號的細胞群，占總體細胞的很少部分3。在缺乏顯著CSC分子標(biāo)記的情況下，SP細胞的篩選分析可以作為CSC鑒定的一種實用而簡易的重要方法4。 1 材料與方法 1.1 動物及細胞株 Balb/c系的46周雌性裸鼠，購于上海動物模式中心。人卵巢癌細胞株A2780購于南京中醫(yī)藥大學(xué)，于加10%新生小牛血清的1640培養(yǎng)液中，在37 、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)。 1.2 實驗方法1.2.1 A2780細胞中SP/NonSP細胞流式檢測和分選實驗 取對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)細胞，制成單個細胞懸液，實驗組加入Hoechst33342至終濃度5 gml-1，對照組再加入Verapamil至終濃度50 gml-1，37 水浴90 min，重懸于冰冷的含2%小牛血清的PBS中，上流式細胞分選儀(fluorescenceactivated cell sorting, FACS)檢測。以355 nm UV激發(fā)光源、610 nm雙色短通反射濾鏡、450 nm和675 nm邊緣長通濾片分別檢測散射光藍光及紅光部分，線性模式采集信號，將細胞中熒光信號分為兩個部分，以Hoechst 紅點為X軸，Hoechst 藍點為Y軸作二維散點圖，將低Hoechst 紅點及低Hoechst 藍點且對照組缺失的區(qū)域設(shè)定為SP細胞的“門” 5，將只加入Hoechst33342的實驗組細胞分選出SP細胞及NonSP細胞。1.2.2 克?。洌┬纬蓪嶒?.2.2.1 平皿克隆形成實驗將分選的SP及NonSP細胞懸液按每皿含100個細胞接種于培養(yǎng)皿中。在37 、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時終止培養(yǎng)，甲醇固定，姬姆薩染液染色后計數(shù)，用肉眼直接計數(shù)克隆數(shù)，或在顯微鏡下計數(shù)大于50個細胞的克隆數(shù)。按公式“克隆形成率=克隆數(shù)/接種細胞數(shù)100%”計算克隆形成率。1.2.2.2 軟瓊脂克隆形成實驗24孔培養(yǎng)板中每孔分別澆入含0.5%低熔點瓊脂的底層瓊脂0.8 ml以及含0.3%瓊脂和一定細胞密度（分別含有100個細胞）的上層瓊脂0.8 ml，置于室溫使瓊脂凝固。在37 、5%CO2及飽和濕度環(huán)境下靜止培養(yǎng)。第10天鏡下計數(shù)直徑大于75 m或含50個細胞以上的克隆，并計算克隆形成率。1.2.3 裸鼠體內(nèi)致瘤實驗1.2.3.1 SP/NonSP細胞裸鼠體內(nèi)致瘤實驗46周齡Balb/c系雌裸鼠隨機分為SP細胞組及NonSP細胞組，每組3只裸鼠，背部皮下注射對應(yīng)的細胞懸液100 l 5104個細胞，隨后監(jiān)測各組小鼠腫瘤生長時間。1.2.3.2 ABCG2+/ABCG2-細胞裸鼠體內(nèi)致瘤實驗46周齡Balb/c系雌性裸鼠隨機分為ABCG2+細胞組及ABCG2-細胞組，每組6只，背部皮下注射對應(yīng)的細胞懸液100 l 5104個細胞，隨后監(jiān)測各組小鼠腫瘤生長時間。1.2.4 MTT法檢測SP和NonSP細胞對長春新堿耐受性 取分選得到的SP/NonSP細胞接種于96孔板，實驗組加入濃度為10 gml-1的長春新堿溶液10 l至終濃度0.5 gml-1， 培養(yǎng)72 h后 MTT法檢測細胞的存活率。1.2.5 實時熒光定量PCR檢測SP/NonSP細胞ABCG2基因表達 檢測ABCG2：PCR上游引物5GGCAGATGCCTTCTTCGTTATGATG3，下游引物5TGGTTGTGAGATTGACCAACAGACC3。 檢測actin：PCR上游引物5GGACTTCGAGCAAGAGATGG3，下游引物5AGCACTGTGTTGGCGTACAG3。 反應(yīng)體系置入ABI 7300 RealTime PCR儀按如下程序進行PCR擴增：94 預(yù)變性4 min，進入3步循環(huán)(94 30 s，57 30 s，72 35 s，共45個循環(huán))，在3步循環(huán)中的每個反應(yīng)循環(huán)結(jié)束時，RealTime PCR儀記錄SYBRGreen釋放的熒光。以逆轉(zhuǎn)錄合成樣品的cDNA產(chǎn)物作為模板，按相同的反應(yīng)體系進行目的基因ABCG2和內(nèi)參actin的Real TimePCR擴增反應(yīng)，并以ddH2O為模板設(shè)陰性對照，電腦采集每個循環(huán)的數(shù)值。使用7300 System SDS Software進行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計學(xué)處理。1.2.6 利用免疫磁選技術(shù)分離獲取ABCG2+表型細胞 制備A2780單細胞懸液，每107 個細胞加20 l一抗，混勻后612 孵育1015 min。每107個細胞再加20 l磁珠二抗，混勻后612 孵育15 min或冰育2030 min。然后用1000 l緩沖液洗滌細胞兩次以去除多余的抗體，每107個細胞重懸于100 l Buffer中過柱，在磁場力的作用下，未能標(biāo)記上ABCG2分子抗體的細胞不會在磁場中停留，用1500 l Buffer沖洗柱子。收集陰性細胞培養(yǎng)，移開分離柱收集陽性細胞。1.2.7 ABCG2+/ABCG2-/經(jīng)抗體孵育ABCG2+細胞對長春新堿耐受性 取分選得到的ABCG2+/ABCG2-，接種于96孔板，實驗組加入濃度為10 gml-1的長春新堿溶液10 l至終濃度0.5 gml-1，經(jīng)抗體孵育ABCG2+細胞組同時加入ABCG2單抗2 l孔-1，培養(yǎng)72 h后MTT法檢測細胞的存活率。 2 結(jié) 果 2.1 SP/NonSP細胞流式檢測、分選及細胞生物學(xué)功能的鑒定FACS檢測出A2780 細胞中的SP細胞比例約為2.6%（B值2.7%減去A值0.1%，圖1）。將圖1B中門區(qū)域的細胞分選下來，分選所得的SP/NonSP細胞分別行相關(guān)的細胞生物學(xué)鑒定。克隆形成實驗是測定單個細胞增殖能力的有效方法之一6，常見的方法有平板克?。▓D2A）和軟瓊脂克?。▓D2B）形成實驗。本實驗顯示，SP細胞的平板克隆率及軟瓊脂克隆率均明顯高于NonSP細胞（圖2C），兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.01）。在軟瓊脂克隆實驗中SP細胞多為克隆球形式存在，而NonSP細胞則很難形成克隆球，多以散在細胞存在（圖2B）。裸鼠體內(nèi)致瘤實驗中，2周內(nèi)SP細胞組2只裸鼠長出了腫瘤(2/3)，NonSP細胞組在8周后仍無腫瘤生長（0/3），余鼠在10周后均無腫瘤生長(圖2D)。 SP/NonSP細胞對長春新堿耐受性實驗中，0.5 gml-1濃度長春新堿作用于這兩種細胞72 h，用MTT法檢測發(fā)現(xiàn)，對SP細胞的生長抑制作用不明顯，其存活率約為81%，而對NonSP細胞的抑制作用明顯，其存活率僅為37%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.01，圖3）。用定量RTPCR檢測SP細胞與NonSP細胞ABCG2表達量，結(jié)果顯示，SP細胞約是NonSP細胞的5.8倍（圖4）。2.2 A2780細胞中ABCG2+/ABCG2-細胞生物學(xué)鑒定首先利用免疫磁珠分離技術(shù)獲取A2780細胞中的ABCG2+表型細胞，1107 個A2780 細胞可得到約2105個ABCG2+細胞，即A2780細胞中ABCG2+表型細胞占2%左右，其含量與SP細胞的比例相似。將分選所得的ABCG2+/ABCG2-細胞行相關(guān)的細胞生物學(xué)特性鑒定，在細胞體外克隆形成實驗中，ABCG2+細胞在平板克隆率及軟瓊脂克隆率均略高于ABCG2-細胞（圖5），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05)。在裸鼠體內(nèi)致瘤實驗中， ABCG2+細胞組在細胞接種后5周時6只裸鼠中2只長出了肉眼可見的腫瘤(2/6)， ABCG2-細胞組在細胞接種后第5周時6只裸鼠中1只長出了肉眼可見的腫瘤(1/6)，其余鼠在接種后10周始終沒有腫瘤的生長，兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。分別將A2780細胞株分選的ABCG2+/ABCG2-、ABCG2+加抗體孵育的各組細胞進行長春新堿耐受性比較，發(fā)現(xiàn)藥物對ABCG2+細胞的生長抑制不明顯，其細胞存活率約為79%，而對ABCG2-細胞組的生長抑制明顯，其細胞存活率僅為35%，對ABCG2+細胞且加入抗ABCG2抗體共同培養(yǎng)組的細胞生長抑制也很明顯，其細胞存活率約為38%，較未加抗體組明顯下降，反映了ABCG2分子可能介導(dǎo)了細胞對藥物的耐受（圖6）。 3 討 論 分離與鑒定是CSC研究的第一步，由于多數(shù)CSC缺乏明確的特異性標(biāo)記，分離和鑒定成為CSC研究的難點。目前，從形態(tài)學(xué)上很難區(qū)分CSC與腫瘤細胞間的差異，只能用功能學(xué)方法即從其自我更新能力和分化潛力來鑒定CSC。分離CSC主要有：SP細胞分選、無血清培養(yǎng)富集干細胞及通過CSC表面特異性標(biāo)志篩選3種方法7。其中SP細胞是1996年Goodell等3在用Hoechst33342染色法研究全骨髓時，發(fā)現(xiàn)有極少一部分細胞可以將進入細胞核的熒光染料排出胞外，在熒光顯微鏡下觀察或流式細胞儀檢測時表現(xiàn)為不著色，他們將這類細胞命名為“SP”細胞，將這種表型命名為“SP表型”，該表型細胞還表達干細胞標(biāo)志 Sca1+ Linneg/low?，F(xiàn)發(fā)現(xiàn)SP細胞廣泛存在于多種生物的多種正常組織中，并同時存在于多種腫瘤細胞系及腫瘤組織中89。隨著對SP細胞研究的深入，發(fā)現(xiàn)SP細胞的功能與正常干細胞相似，如SP細胞可發(fā)生不對稱分裂、進行自我更新等10。多項研究表明，部分腫瘤(乳腺癌、前列腺癌、腦膠質(zhì)瘤等)中SP細胞具有CSC特性，即表達干細胞相關(guān)表面標(biāo)志，具有自我更新、強致瘤能力和高表達轉(zhuǎn)運蛋白ABCG211等。研究顯示，在卵巢癌細胞中存在致瘤性較強的SP細胞1213，因此，我們利用SP細胞與干細胞、CSC具有許多共