流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范手冊(cè)一、總則本手冊(cè)旨在規(guī)范流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)操作流程，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性與可重復(fù)性，保障實(shí)驗(yàn)人員的安全，并延長(zhǎng)儀器使用壽命。本規(guī)范適用于所有使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作的科研人員及技術(shù)人員。使用者在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作前，必須熟悉本手冊(cè)內(nèi)容，并經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的操作培訓(xùn)，考核合格后方可獨(dú)立操作。二、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備2.1操作人員準(zhǔn)備操作人員應(yīng)穿著合適的實(shí)驗(yàn)服，佩戴一次性手套。長(zhǎng)發(fā)者需束發(fā)，禁止佩戴首飾。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)清潔雙手，避免污染實(shí)驗(yàn)樣本及試劑。2.2實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)與確認(rèn)實(shí)驗(yàn)前需明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，設(shè)計(jì)合理的實(shí)驗(yàn)方案，包括樣本類(lèi)型、數(shù)量、所需檢測(cè)的標(biāo)志物、熒光抗體組合、對(duì)照設(shè)置（如空白對(duì)照、同型對(duì)照、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、補(bǔ)償對(duì)照等）。確認(rèn)實(shí)驗(yàn)方案的可行性及科學(xué)性。2.3實(shí)驗(yàn)材料與試劑準(zhǔn)備2.3.1樣本根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案收集樣本，確保樣本的新鮮度與代表性。記錄樣本的基本信息，如編號(hào)、來(lái)源、采集時(shí)間等。2.3.2試劑抗體：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的熒光標(biāo)記抗體。確認(rèn)抗體的克隆號(hào)、熒光素類(lèi)型、特異性、效價(jià)及有效期?？贵w應(yīng)按照說(shuō)明書(shū)要求的條件（如溫度、避光）儲(chǔ)存和復(fù)蘇，避免反復(fù)凍融。使用前需平衡至室溫。緩沖液：如PBS、HBSS等，用于洗滌細(xì)胞及稀釋抗體。確保緩沖液在有效期內(nèi)，無(wú)渾濁、無(wú)沉淀。固定劑與破膜劑：如需要進(jìn)行胞內(nèi)染色，需準(zhǔn)備相應(yīng)的固定劑（如多聚甲醛）和破膜劑，確保其質(zhì)量合格。其他試劑：如紅細(xì)胞裂解液、臺(tái)盼藍(lán)染液（用于細(xì)胞活力檢測(cè)）等，按需準(zhǔn)備。2.4儀器與耗材準(zhǔn)備流式細(xì)胞儀：確認(rèn)儀器處于正常工作狀態(tài)，開(kāi)機(jī)前檢查電源、液路等連接是否正常。耗材：準(zhǔn)備干凈的離心管、流式管、移液槍及配套吸頭（建議使用帶濾芯吸頭，防止交叉污染）、注射器、針頭（如用于過(guò)濾樣本）等。流式管需為儀器兼容型號(hào)，確保透明、潔凈、無(wú)劃痕。輔助設(shè)備：離心機(jī)（水平轉(zhuǎn)子為佳）、渦旋混勻器、微量移液器、冰箱、孵育箱（如需要恒溫孵育）等。2.5實(shí)驗(yàn)環(huán)境準(zhǔn)備保持實(shí)驗(yàn)臺(tái)面清潔、整齊，通風(fēng)良好。實(shí)驗(yàn)區(qū)域禁止飲食、吸煙。生物樣本操作需在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，符合生物安全等級(jí)要求。三、樣本制備樣本制備是流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的質(zhì)量。應(yīng)根據(jù)樣本類(lèi)型選擇合適的制備方法，確保獲得高活性、單細(xì)胞、無(wú)粘連的細(xì)胞懸液。3.1外周血/骨髓樣本處理如樣本為全血，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求決定是否分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）。常用密度梯度離心法（如Ficoll-Hypaque分離液）。若直接裂解紅細(xì)胞，需選擇合適的紅細(xì)胞裂解液，按照說(shuō)明書(shū)操作，注意裂解時(shí)間和溫度，避免過(guò)度裂解導(dǎo)致白細(xì)胞損失或損傷。裂解后充分洗滌，去除殘留裂解液。3.2組織樣本處理實(shí)體組織需先進(jìn)行機(jī)械解離（如剪碎、研磨），再結(jié)合酶消化（如膠原酶、胰蛋白酶等）獲得單細(xì)胞懸液。酶的種類(lèi)、濃度、消化時(shí)間和溫度需根據(jù)組織類(lèi)型優(yōu)化。消化后的細(xì)胞懸液需通過(guò)濾網(wǎng)（如70μm或40μm細(xì)胞濾網(wǎng)）過(guò)濾，去除細(xì)胞團(tuán)塊和組織碎片。3.3培養(yǎng)細(xì)胞處理貼壁細(xì)胞需用胰蛋白酶或EDTA等消化液消化，終止消化后輕柔吹打，制成單細(xì)胞懸液。懸浮細(xì)胞直接收集，離心后用緩沖液重懸。3.4細(xì)胞計(jì)數(shù)與活力檢測(cè)采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法或其他活力檢測(cè)方法評(píng)估細(xì)胞活力，活細(xì)胞比例應(yīng)大于一定值（通常>90%）以保證實(shí)驗(yàn)質(zhì)量。使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板或自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，用于調(diào)整染色時(shí)的細(xì)胞濃度。3.5樣本保存與運(yùn)輸新鮮樣本應(yīng)盡快進(jìn)行染色和檢測(cè)。若無(wú)法立即處理，需根據(jù)樣本類(lèi)型選擇合適的保存方法（如短期冷藏），并避免反復(fù)凍融。長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)臉颖拘枋褂眠m當(dāng)?shù)倪\(yùn)輸培養(yǎng)基和溫控條件，確保細(xì)胞活性。四、免疫熒光染色4.1單細(xì)胞懸液調(diào)整將制備好的單細(xì)胞懸液離心，棄上清，用適量染色緩沖液（如含BSA和NaN?的PBS）重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至合適范圍（通常為1×10?-5×10?cells/mL）。4.2表面抗原染色取適量細(xì)胞懸液于流式管中，加入預(yù)先設(shè)計(jì)好的熒光標(biāo)記抗體組合?？贵w的用量需根據(jù)說(shuō)明書(shū)或預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。充分混勻，在適宜溫度（通常為4℃，避光）下孵育一定時(shí)間（通常為20-30分鐘）。孵育結(jié)束后，加入適量染色緩沖液洗滌，離心，棄上清。重復(fù)洗滌1-2次，以去除未結(jié)合的游離抗體。用適量染色緩沖液或固定液重懸細(xì)胞，待測(cè)。4.3胞內(nèi)/胞核抗原染色通常在完成表面抗原染色后進(jìn)行。先使用固定劑（如4%多聚甲醛）在室溫或4℃下固定細(xì)胞，使細(xì)胞膜通透性增加，同時(shí)保存細(xì)胞形態(tài)和抗原。固定后，用破膜劑（如含皂素或TritonX-100的緩沖液）處理細(xì)胞，以增加細(xì)胞膜對(duì)胞內(nèi)抗體的通透性。破膜步驟需嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。加入針對(duì)胞內(nèi)或胞核抗原的熒光標(biāo)記抗體，在適宜條件下孵育。孵育后，用破膜緩沖液或染色緩沖液洗滌，離心，棄上清。用適量染色緩沖液重懸細(xì)胞，待測(cè)。4.4對(duì)照設(shè)置同型對(duì)照：使用與一抗來(lái)源、亞型、熒光標(biāo)記相同的非特異性抗體，用于評(píng)估抗體的非特異性結(jié)合。陰性對(duì)照：未染色細(xì)胞或僅用二抗（若使用間接法）染色的細(xì)胞，用于設(shè)定熒光本底。陽(yáng)性對(duì)照：已知表達(dá)目標(biāo)抗原的細(xì)胞，用于驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)體系的有效性。補(bǔ)償對(duì)照：為每個(gè)熒光通道單獨(dú)設(shè)置單染的補(bǔ)償微球或細(xì)胞，用于調(diào)節(jié)流式細(xì)胞儀的熒光補(bǔ)償。4.5染色過(guò)程注意事項(xiàng)整個(gè)染色過(guò)程應(yīng)注意避光，尤其對(duì)于光敏性熒光素（如FITC）。嚴(yán)格控制孵育溫度和時(shí)間，避免溫度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致非特異性結(jié)合增加。洗滌充分，以減少背景熒光。操作輕柔，避免劇烈吹打?qū)е录?xì)胞損傷或死亡。五、流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)與數(shù)據(jù)分析5.1儀器開(kāi)機(jī)與校準(zhǔn)按照儀器操作規(guī)程開(kāi)機(jī)，預(yù)熱儀器至穩(wěn)定狀態(tài)。每日開(kāi)機(jī)后或更換激光器、流動(dòng)室后，需使用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球進(jìn)行儀器校準(zhǔn)，包括光路對(duì)準(zhǔn)、PMT電壓校準(zhǔn)、熒光補(bǔ)償設(shè)置等，確保儀器處于最佳工作狀態(tài)。5.2樣本上樣與數(shù)據(jù)獲取檢查待檢測(cè)樣本狀態(tài)，確保無(wú)沉淀、無(wú)聚集。若有少量聚集，可通過(guò)30-40μm濾網(wǎng)過(guò)濾后上機(jī)。將流式管正確放入樣本架，避免樣本溢出。根據(jù)樣本類(lèi)型和實(shí)驗(yàn)需求，設(shè)置合適的流速（低速、中速或高速）。對(duì)于稀有細(xì)胞群體，可能需要低速長(zhǎng)時(shí)間獲取以保證足夠的事件數(shù)。設(shè)定數(shù)據(jù)獲取的參數(shù)，包括前向散射光（FSC）、側(cè)向散射光（SSC）及各熒光通道的PMT電壓。PMT電壓的設(shè)置應(yīng)使陰性細(xì)胞群位于坐標(biāo)軸左下角，陽(yáng)性信號(hào)清晰可辨，避免信號(hào)溢出。開(kāi)始獲取數(shù)據(jù)前，先觀察散點(diǎn)圖，調(diào)整閾值（通常基于FSC或SSC）以排除碎片和噪音信號(hào)。獲取足夠數(shù)量的細(xì)胞事件。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮图?xì)胞亞群比例確定最小獲取細(xì)胞數(shù)，對(duì)于稀有亞群，可能需要獲取更多事件。記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，包括樣本信息、獲取日期、儀器參數(shù)、獲取細(xì)胞數(shù)等。5.3數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)導(dǎo)入：將流式細(xì)胞儀獲取的數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入專(zhuān)業(yè)的流式數(shù)據(jù)分析軟件（如FlowJo,BDFACSDiva?等）。設(shè)門(mén)（Gating）策略：根據(jù)FSC和SSC設(shè)門(mén)排除碎片、死細(xì)胞和粘連體，圈定目標(biāo)細(xì)胞群體。然后基于熒光強(qiáng)度對(duì)特定亞群進(jìn)行進(jìn)一步分析。設(shè)門(mén)策略應(yīng)客觀、可重復(fù)，并在實(shí)驗(yàn)記錄中詳細(xì)說(shuō)明。熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)：利用之前設(shè)置的補(bǔ)償對(duì)照樣本，在軟件中調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償矩陣，消除不同熒光素之間的光譜重疊干擾。統(tǒng)計(jì)分析：計(jì)算目標(biāo)細(xì)胞亞群的百分比、平均熒光強(qiáng)度（MFI）等參數(shù)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果展示：選擇合適的圖形（如散點(diǎn)圖、直方圖、等高線圖等）展示分析結(jié)果，確保圖表清晰、規(guī)范。5.4儀器使用后維護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，按照儀器操作規(guī)程進(jìn)行關(guān)機(jī)，包括沖洗管路、關(guān)閉激光器、關(guān)閉軟件和主機(jī)電源等。及時(shí)清理實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，妥善處理廢棄樣本和耗材。填寫(xiě)儀器使用記錄，包括使用時(shí)間、樣本類(lèi)型、儀器運(yùn)行狀況等。六、實(shí)驗(yàn)后處理6.1實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)管理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)及時(shí)備份，存儲(chǔ)在安全可靠的位置，避免數(shù)據(jù)丟失。實(shí)驗(yàn)記錄應(yīng)完整、規(guī)范，包括實(shí)驗(yàn)日期、樣本信息、試劑信息（批號(hào)、來(lái)源）、實(shí)驗(yàn)條件、儀器參數(shù)、原始數(shù)據(jù)文件路徑等，確保實(shí)驗(yàn)的可追溯性。6.2試劑與耗材處理剩余試劑按照說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行保存，已開(kāi)封的試劑需注明開(kāi)封日期。廢棄的試劑、樣本（尤其是生物危害樣本）和耗材需按照實(shí)驗(yàn)室安全規(guī)定和環(huán)保要求進(jìn)行分類(lèi)處理。6.3實(shí)驗(yàn)區(qū)域清潔清理實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，用75%酒精或其他合適的消毒劑擦拭，確保無(wú)樣本殘留和污染。生物安全柜內(nèi)進(jìn)行的操作，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后需開(kāi)啟紫外燈照射消毒一定時(shí)間。七、質(zhì)量控制與質(zhì)量保證定期對(duì)實(shí)驗(yàn)所用的關(guān)鍵試劑（如抗體）進(jìn)行效價(jià)測(cè)定和特異性驗(yàn)證。參與實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制（IQC）和必要的外部質(zhì)量評(píng)估（EQA）活動(dòng)，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。定期對(duì)儀器進(jìn)行維護(hù)保養(yǎng)和性能驗(yàn)證，由專(zhuān)業(yè)工程師或經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的技術(shù)人員執(zhí)行。建立實(shí)驗(yàn)SOP的定期審核和更新機(jī)制，確保其符合最新的技術(shù)發(fā)展和規(guī)范要求。八、安全注意事項(xiàng)生物安全：嚴(yán)格遵守生物安全操作規(guī)程，處理具有潛在生物危害的樣本時(shí)，必須在相應(yīng)級(jí)別的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，防止樣本泄露和人員感染。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，徹底消毒雙手和實(shí)驗(yàn)臺(tái)面。化學(xué)安全：正確使用和儲(chǔ)存化學(xué)試劑（如固定劑、破膜劑、熒光染料等），了解其安全數(shù)據(jù)表（SDS），佩戴適當(dāng)?shù)膫€(gè)人防護(hù)裝備（如護(hù)目鏡、手套）。儀器安全：嚴(yán)格按照儀器操作規(guī)程進(jìn)行操作，避免違規(guī)操作導(dǎo)致儀器損壞或人員傷害。如遇儀器故障，應(yīng)立即