CCSB41DB2312綏化市市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB2312/T088—2023本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由綏化市農業(yè)農村局歸口。本文件起草單位：黑龍江省百洲生物工程有限公司、明水縣農業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊。本文件主要起草人：張越、張洪楠、李山峰、汪洋、王海楠、王東升。DB2312/T088—2023本文件規(guī)定了禽用油乳劑滅活疫苗細菌內毒素含量檢驗方法，本法為凝膠法是利用鱟試劑檢測或量化由革蘭氏陰性菌產生的內毒素的方法。本文件適用于獸用生物制品生產企業(yè)以及經營企業(yè)對禽用油乳劑滅活疫苗細菌內毒素含量范圍的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件?！吨腥A人民共和國獸藥典》（2020版）一部附錄“細菌內毒素檢查法”。3術語和定義《中華人民共和國獸藥典》（2020版）一部附錄“細菌內毒素檢查法”界定的術語和定義適用于本文件。4主要技術內容4.1被檢疫苗處理隨機抽取油乳劑滅活疫苗1瓶，置-20℃以下條件下冷凍24h～48h，待其完全凍結后，將其取出置室溫條件下融化24h～48h，如此反復凍融3次～4次，使被檢疫苗破乳分層，取適量疫苗3500r/min離心15min后，用無熱源吸管吸取下層液體作為供試品溶液。4.2供試品溶液稀釋用細菌內毒素檢查用水（內毒素小于0.015EU/ml的無菌水）將供試品溶液做一系列稀釋，稀釋10倍、100倍、500倍、1000倍等不同系列，通過對供試品不同稀釋倍數下的細菌內毒素檢測，用相應稀釋倍數乘以鱟試劑靈敏度λ,計算供試品中所含細菌內毒素的范圍。4.2.1鱟試劑靈敏度復核實驗當使用新批號的鱟試劑或實驗條件發(fā)生了任何可改變實驗結果的改變時，應根據《中華人民共和國獸藥典》現行版一部附錄“細菌內毒素檢查法”進行靈敏度復核實驗，確定鱟試劑的靈敏度與標示值相符。4.2.2供試品干擾試驗供試品初次進行細菌內毒素實驗之前，需根據《中華人民共和國獸藥典》現行版一部附錄“細菌內毒素檢查法”先進行干擾試驗，以檢測供試品對內毒素檢測試驗是否有干擾或抑制作用，供試品如對實驗有干擾，可通過對供試品進行更大倍數的稀釋或通過其他適宜的方法(如過濾、中和、透析或加熱處理等)排除干擾。4.3檢測步驟DB2312/T088—20234.3.1實驗前準備4.3.1.1主要儀器超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、干燥箱、旋渦混合儀、離心機、移液槍、無熱源槍頭（或去熱源的刻度吸管）、耐高溫玻璃試管（外徑10×75mm，250℃干烤1h）。4.3.1.2試劑鱟試劑（0.1ml/支）、細菌內毒素工作標準品（10EU/支）、細菌內毒素檢查用水（內毒素小于4.3.2操作步驟按照《中華人民共和國獸藥典》現行版一部附錄“細菌內毒素檢查法”進行檢驗,制備供試品溶液、供試品陽性對照、陽性對照和陰性對照。按鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作。取0.1ml/支的鱟試劑原安瓿若干支，其中：①供試品溶液管：每個待測濃度系列各取2支，各加入0.1ml供試液；②供試品陽性對照管：根據供試品的不同目標稀釋倍數，每個目標稀釋倍數下選取2支，每個待測稀釋倍數下各加入0.1ml濃度為λ的內毒素供試液溶液（分別用相對應的待測稀釋倍數下的供試品溶液稀釋內毒素標準品，使其溶度為λ);③陽性對照管：2支，各加入0.1ml濃度為λ的內毒素標準溶液（用內毒素檢查用水稀釋內毒素標準品，使其溶度為λ);④陰性對照管：2支，各加入0.1ml內毒素檢查用水。將各瓶中溶液輕輕混勻后，封閉瓶口，垂直放入37℃±1℃的恒溫培養(yǎng)箱中，孵育60min±2min。將安瓿從恒溫培養(yǎng)箱中輕輕取出，緩緩倒轉180°。若管內形成凝膠并且凝膠不變形、不從管壁脫落者為陽性；未形成凝膠或形成的凝膠不堅實、變形并從管壁脫落者為陰性。記錄結果。4.4結果判定若陰性對照管均為陰性，陽性對照管均為陽性，供試品陽性對照管均為陽性，判定試驗有效。若供試品管均為陰性，判定供試品內毒素含量小于測定值。若供試品管均為陽性，則判定供試品內毒素含量大于測定值。若供試品出現陽性管和陰性管，需進行復試。復試時供試品管需做4支平行管，所有平行管需均為陰性或者均為陽性，則實驗