基于PubChem數(shù)據(jù)庫的CRM1抑制劑虛擬篩選及其在痤瘡治療中的創(chuàng)新應(yīng)用與機(jī)制研究一、引言1.1研究背景1.1.1PubChem數(shù)據(jù)庫概述PubChem是由美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）維護(hù)，美國國立衛(wèi)生研究院支持的一個(gè)免費(fèi)且公開的化學(xué)物質(zhì)信息數(shù)據(jù)庫，于2004年9月正式啟動(dòng)。該數(shù)據(jù)庫主要聚焦于小分子，同時(shí)也涵蓋了部分較大分子，全面收集了化學(xué)結(jié)構(gòu)、標(biāo)識符、化學(xué)和物理性質(zhì)、生物活性、專利、健康、安全以及毒性數(shù)據(jù)等多方面信息，截至目前，已收錄化合物超1.15億種、物質(zhì)達(dá)3.04億種、生物活性3.04億種、相關(guān)文獻(xiàn)3500萬篇、專利4200萬篇。PubChem由三個(gè)子數(shù)據(jù)庫構(gòu)成，分別為PubChemBioAssay、PubChemCompound和PubChemSubstance。其中，PubChemBioAssay用于存儲生化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)主要來源于高通量篩選實(shí)驗(yàn)以及科技文獻(xiàn)，為研究化合物的生物活性提供了豐富的實(shí)驗(yàn)依據(jù)；PubChemCompound用于存儲整理后的化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)信息，對化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了精確且規(guī)范的記錄；PubChemSubstance則用于存儲機(jī)構(gòu)和個(gè)人上傳的化合物原始數(shù)據(jù)，保證了數(shù)據(jù)來源的廣泛性和多樣性。用戶不僅能按名稱、分子式、結(jié)構(gòu)和其他標(biāo)識符進(jìn)行搜索，還支持mol等格式文件的導(dǎo)入和導(dǎo)出，為科研工作者提供了極大的便利，在藥物設(shè)計(jì)、化學(xué)研究等領(lǐng)域發(fā)揮著不可或缺的作用。1.1.2CRM1抑制劑研究現(xiàn)狀CRM1蛋白，又稱染色體區(qū)域維持蛋白1（ChromosomeRegionMaintenance1），也被稱作Exportin-1（XPO1），在細(xì)胞的正常生理過程中扮演著關(guān)鍵角色，它負(fù)責(zé)超過220種蛋白及部分RNA的出核轉(zhuǎn)運(yùn)，這一過程依賴于Ran-GTPase。小分子蛋白可通過被動(dòng)運(yùn)輸穿越核膜，而大分子蛋白則需依賴CRM1的主動(dòng)運(yùn)輸。在腫瘤細(xì)胞中，CRM1蛋白常常呈現(xiàn)異常高表達(dá)狀態(tài)，它負(fù)責(zé)將腫瘤抑制蛋白如p53、核磷蛋白等，以及關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子如Survivin等從細(xì)胞核運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)。腫瘤抑制蛋白在細(xì)胞核中發(fā)揮抑制腫瘤的作用，被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)后其活性被消除，從而使得腫瘤細(xì)胞逃避凋亡或被調(diào)控的命運(yùn)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、存活、耐藥以及轉(zhuǎn)移，是腫瘤細(xì)胞的一種內(nèi)在防御性進(jìn)化與適應(yīng)性進(jìn)化機(jī)制。因此，阻斷CRM1介導(dǎo)的這些蛋白質(zhì)的核輸出，成為恢復(fù)腫瘤抑制功能的一種新型治療策略。早期，臨床上常使用來普霉素B、anguinomycins等抗生素來抑制核輸出，但由于它們治療潛力有限，同時(shí)還伴有嚴(yán)重的毒性，逐漸被小分子輸出蛋白抑制劑所取代。近年來，口服生物可利用的核輸出選擇性抑制劑（SINE）被開發(fā)出來，它能夠不可逆地結(jié)合CRM1并阻斷該蛋白質(zhì)的功能。全球首款也是唯一一款獲批上市的CRM1抑制劑是塞利尼索（Selinexor），由KaryopharmTherapeutics研發(fā)。塞利尼索通過與CRM1的NES結(jié)合口袋中的Cys528共價(jià)結(jié)合，抑制核輸出蛋白CRM1，促使腫瘤抑制蛋白和其他生長調(diào)節(jié)蛋白在核內(nèi)儲留，并下調(diào)細(xì)胞漿內(nèi)多種致癌蛋白水平，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。目前，塞利尼索已獲批復(fù)發(fā)/難治性多發(fā)性骨髓瘤和大B細(xì)胞淋巴瘤適應(yīng)癥。除塞利尼索外，還有多款CRM1抑制劑處于臨床開發(fā)階段，如Eltanexor（KPT-8602，ATG-016）是一款二代SINE化合物，與塞利尼索相比，其治療窗口更寬，且難以穿越血腦屏障，在臨床中有望增加給藥頻次，提升藥物暴露量，目前正處于Ⅰ/Ⅱ期臨床，探索其在多發(fā)性骨髓瘤、結(jié)直腸癌、去勢抵抗前列腺癌和骨髓增生異常綜合征（MDS）中的治療效果；Verdinexor（KPT-335，ATG-527）是一款新型SINE化合物，可有效抑制犬腫瘤細(xì)胞系出核蛋白CRM1，也可降低病毒的復(fù)制水平，目前處于臨床Ⅰ期。1.1.3痤瘡治療的現(xiàn)狀與挑戰(zhàn)痤瘡是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，主要發(fā)生于青少年群體，嚴(yán)重影響患者的皮膚外觀和心理健康。目前，臨床上常用的痤瘡治療方法包括外用藥物、口服藥物、物理治療以及化學(xué)剝脫等。外用藥物如維A酸類、過氧化苯甲酰、抗生素等，是輕度痤瘡的一線治療選擇。維A酸類藥物可以調(diào)節(jié)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的分化，改善毛囊皮脂腺導(dǎo)管角化，溶解微粉刺和粉刺，還具有抗炎作用，但可能會引起皮膚刺激、干燥、脫屑等不良反應(yīng)；過氧化苯甲酰通過釋放新生態(tài)氧和苯甲酸，具有殺滅痤瘡丙酸桿菌、抗炎的作用，但可能導(dǎo)致皮膚發(fā)紅、干燥、脫屑，長期使用還可能使皮膚產(chǎn)生耐藥性；抗生素如甲硝唑、紅霉素等，主要通過抑制痤瘡丙酸桿菌的生長來發(fā)揮作用，但長期使用易引發(fā)耐藥性及菌群失調(diào)等問題。口服藥物常用于中重度痤瘡的治療，常見的有抗生素（如四環(huán)素類）、維A酸類（如異維A酸）、抗雄激素藥物等。四環(huán)素類抗生素能抑制痤瘡丙酸桿菌的生長，同時(shí)具有抗炎作用，但長期使用同樣存在耐藥性風(fēng)險(xiǎn)，還可能引起胃腸道不適、光敏反應(yīng)等不良反應(yīng)；異維A酸可以抑制皮脂腺分泌，調(diào)節(jié)毛囊皮脂腺導(dǎo)管角化，改善毛囊厭氧環(huán)境，減少痤瘡丙酸桿菌繁殖，以及抗炎和預(yù)防瘢痕形成等作用，對重度痤瘡療效顯著，但不良反應(yīng)較多，如皮膚黏膜干燥、血脂升高、致畸性等，因此孕婦、哺乳期婦女及有生育計(jì)劃的人群禁用；抗雄激素藥物通過抑制雄激素前體生成或作用于皮膚內(nèi)雄激素代謝酶和受體，減少或拮抗雄激素活性作用，從而減少皮脂腺分泌皮脂，達(dá)到改善痤瘡的目的，但可能會出現(xiàn)月經(jīng)紊亂、性欲減退等副作用。物理治療包括激光治療、光動(dòng)力治療等。激光治療如脈沖染料激光、強(qiáng)脈沖光等，能夠快速控制炎癥，且一般不會留下疤痕，但費(fèi)用相對較高，復(fù)發(fā)率也較高，治療后皮膚容易對外界物質(zhì)過敏；光動(dòng)力治療利用特定波長的光照射皮膚，激發(fā)光敏劑產(chǎn)生單線態(tài)氧，破壞皮脂腺和細(xì)胞、殺滅痤瘡丙酸桿菌、改善毛囊口角化，然而該方法治療過程中可能會有疼痛、紅斑、水腫等不適，且需要多次治療，治療周期較長。化學(xué)剝脫術(shù)則是通過使用化學(xué)溶液如水楊酸、乙醇酸等，去除皮膚表面的角質(zhì)層，促進(jìn)皮膚新陳代謝，改善痤瘡癥狀，不過可能會導(dǎo)致皮膚短暫的發(fā)紅、脫屑，對于深層痤瘡治療效果有限。盡管現(xiàn)有的痤瘡治療方法多樣，但每種方法都存在一定的局限性，如療效有限、不良反應(yīng)多、易復(fù)發(fā)、耐藥性等問題。因此，尋找新的、更安全有效的痤瘡治療手段具有重要的臨床意義和迫切需求。1.2研究目的與意義痤瘡作為一種常見的皮膚疾病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，然而當(dāng)前的治療方法存在諸多不足。本研究旨在利用PubChem數(shù)據(jù)庫的豐富資源，篩選出具有潛在活性的CRM1抑制劑，并深入探究其對痤瘡治療的應(yīng)用潛力，具體研究目的如下：高效篩選潛在CRM1抑制劑：借助PubChem數(shù)據(jù)庫中龐大的化合物信息，運(yùn)用虛擬篩選技術(shù)，快速、高效地從海量化合物中篩選出可能對CRM1蛋白具有抑制作用的小分子化合物，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供候選藥物。深入分析抑制劑作用機(jī)制：對篩選出的CRM1抑制劑進(jìn)行分子對接和動(dòng)力學(xué)模擬等分析，明確其與CRM1蛋白的相互作用模式及結(jié)合機(jī)制，從分子層面揭示其抑制CRM1功能的原理，為藥物設(shè)計(jì)和優(yōu)化提供理論依據(jù)。評估抑制劑痤瘡治療效果：通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型，驗(yàn)證篩選出的CRM1抑制劑對痤瘡相關(guān)細(xì)胞因子、炎癥反應(yīng)以及痤瘡丙酸桿菌生長的影響，評估其在痤瘡治療中的有效性和安全性，為開發(fā)新型痤瘡治療藥物奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究對于痤瘡治療領(lǐng)域和藥物研發(fā)具有重要意義，主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：理論意義：深入揭示CRM1蛋白在痤瘡發(fā)病機(jī)制中的潛在作用，進(jìn)一步完善對痤瘡發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識，為痤瘡的病理研究提供新的視角和理論支持，有助于推動(dòng)皮膚科學(xué)領(lǐng)域?qū)ρ装Y性皮膚病發(fā)病機(jī)制的深入探索。實(shí)踐意義：發(fā)現(xiàn)新的具有痤瘡治療潛力的CRM1抑制劑，為痤瘡的臨床治療提供新的藥物選擇和治療策略，有望改善現(xiàn)有治療方法的局限性，提高痤瘡治療的效果和安全性，為廣大痤瘡患者帶來福音。藥物研發(fā)意義：建立基于PubChem數(shù)據(jù)庫的CRM1抑制劑虛擬篩選及活性驗(yàn)證的研究方法，為其他疾病相關(guān)靶點(diǎn)的藥物篩選和研發(fā)提供可借鑒的思路和方法，加速新藥研發(fā)進(jìn)程，降低研發(fā)成本，推動(dòng)藥物研發(fā)領(lǐng)域的技術(shù)創(chuàng)新和發(fā)展。1.3研究創(chuàng)新點(diǎn)與技術(shù)路線1.3.1創(chuàng)新點(diǎn)研究視角創(chuàng)新：突破傳統(tǒng)痤瘡治療靶點(diǎn)的研究局限，將CRM1蛋白作為新的研究靶點(diǎn)，探索其在痤瘡發(fā)病機(jī)制中的潛在作用以及作為治療靶點(diǎn)的可行性，為痤瘡治療機(jī)制研究開辟新方向。方法創(chuàng)新：利用PubChem數(shù)據(jù)庫豐富的數(shù)據(jù)資源，結(jié)合虛擬篩選技術(shù)、分子對接和動(dòng)力學(xué)模擬等先進(jìn)的計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)方法，高效篩選和深入分析CRM1抑制劑，相比傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)篩選方法，具有成本低、速度快、效率高的優(yōu)勢，能夠快速從海量化合物中找到潛在的活性分子，為藥物研發(fā)提供了新的技術(shù)手段。應(yīng)用拓展創(chuàng)新：將原本主要應(yīng)用于腫瘤治療研究的CRM1抑制劑，拓展到痤瘡治療領(lǐng)域，嘗試為痤瘡治療提供全新的藥物選擇和治療策略，有望解決現(xiàn)有痤瘡治療方法存在的諸多問題，這在痤瘡治療研究領(lǐng)域具有創(chuàng)新性和開拓性。1.3.2技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線主要包括三個(gè)關(guān)鍵階段：虛擬篩選、活性驗(yàn)證及痤瘡治療應(yīng)用研究，具體流程如圖1-1所示。@startumlstart:收集PubChem數(shù)據(jù)庫化合物信息;:基于CRM1蛋白結(jié)構(gòu)，設(shè)定篩選條件，進(jìn)行虛擬篩選;:篩選出潛在CRM1抑制劑;if(分子對接)then(是):分析抑制劑與CRM1蛋白結(jié)合模式和親和力;else(否):返回重新篩選;endifif(動(dòng)力學(xué)模擬)then(是):模擬復(fù)合物穩(wěn)定性，優(yōu)化結(jié)構(gòu);else(否):返回重新篩選;endif:選擇高潛力抑制劑進(jìn)行活性驗(yàn)證;if(細(xì)胞實(shí)驗(yàn))then(是):檢測對痤瘡相關(guān)細(xì)胞因子和炎癥反應(yīng)影響;else(否):排除該抑制劑;endifif(抗菌實(shí)驗(yàn))then(是):測定對痤瘡丙酸桿菌生長抑制作用;else(否):排除該抑制劑;endif:選擇有效抑制劑進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn);:評估對痤瘡模型治療效果和安全性;if(治療效果顯著且安全)then(是):深入研究作用機(jī)制;else(否):排除該抑制劑;endifstop@enduml圖1-1技術(shù)路線圖虛擬篩選階段：從PubChem數(shù)據(jù)庫中全面收集化合物的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及生物活性等相關(guān)信息。以已解析的CRM1蛋白晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，借助分子對接軟件，依據(jù)一定的結(jié)合模式和能量標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定篩選條件，對數(shù)據(jù)庫中的化合物進(jìn)行初步虛擬篩選，得到與CRM1蛋白具有潛在結(jié)合能力的化合物。接著，運(yùn)用分子動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)，對篩選出的化合物-CRM1蛋白復(fù)合物進(jìn)行動(dòng)力學(xué)模擬，進(jìn)一步分析復(fù)合物在溶液環(huán)境中的穩(wěn)定性和相互作用細(xì)節(jié)，從而確定具有較高親和力和穩(wěn)定結(jié)合能力的潛在CRM1抑制劑?；钚则?yàn)證階段：將虛擬篩選得到的潛在CRM1抑制劑進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。選用痤瘡相關(guān)的細(xì)胞系，如角質(zhì)形成細(xì)胞、皮脂腺細(xì)胞等，檢測抑制劑對細(xì)胞增殖、分化以及炎癥相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響，評估其對痤瘡炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。同時(shí)，開展抗菌實(shí)驗(yàn)，測試抑制劑對痤瘡丙酸桿菌生長的抑制效果，確定其是否具有抑制痤瘡主要致病菌的能力。通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和抗菌實(shí)驗(yàn)，篩選出具有顯著活性的CRM1抑制劑進(jìn)入下一步研究。痤瘡治療應(yīng)用研究階段：利用痤瘡動(dòng)物模型，如小鼠或大鼠痤瘡模型，對活性驗(yàn)證階段篩選出的抑制劑進(jìn)行體內(nèi)治療效果評估。通過觀察動(dòng)物模型皮膚病變改善情況、炎癥細(xì)胞浸潤程度以及相關(guān)病理指標(biāo)的變化，綜合評價(jià)抑制劑對痤瘡的治療效果。同時(shí)，監(jiān)測抑制劑在動(dòng)物體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)和安全性指標(biāo)，包括血液生化指標(biāo)、組織病理學(xué)檢查等，確保其在治療劑量下的安全性。對于治療效果顯著且安全性良好的抑制劑，進(jìn)一步深入研究其在體內(nèi)的作用機(jī)制，如對相關(guān)信號通路的調(diào)控、對細(xì)胞周期的影響等，為其臨床應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。二、PubChem數(shù)據(jù)庫與虛擬篩選技術(shù)2.1PubChem數(shù)據(jù)庫詳解2.1.1數(shù)據(jù)庫結(jié)構(gòu)與內(nèi)容PubChem數(shù)據(jù)庫作為全球最大的公開化學(xué)物質(zhì)數(shù)據(jù)庫之一，具有豐富的內(nèi)容和獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，為化學(xué)、生物、醫(yī)藥等多領(lǐng)域的研究提供了不可或缺的數(shù)據(jù)支持。它主要由三個(gè)緊密相關(guān)的子庫構(gòu)成，分別是PubChemBioAssay、PubChemCompound和PubChemSubstance，每個(gè)子庫在功能和存儲的數(shù)據(jù)類型上都有所不同，卻又相互關(guān)聯(lián)，共同構(gòu)建起一個(gè)全面、系統(tǒng)的化學(xué)物質(zhì)信息平臺。PubChemSubstance主要存儲機(jī)構(gòu)和個(gè)人上傳的原始化學(xué)物質(zhì)數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)來源廣泛，包括科研機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、企業(yè)的研發(fā)數(shù)據(jù)以及學(xué)術(shù)文獻(xiàn)中的相關(guān)記載等，它如實(shí)記錄了化學(xué)物質(zhì)的原始信息，是數(shù)據(jù)庫中最基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)集合，為后續(xù)的整理和分析提供了豐富的素材。截至目前，PubChemSubstance已收錄超過3.04億種物質(zhì)，涵蓋了各種有機(jī)小分子、生物大分子以及復(fù)雜的混合物等，這些物質(zhì)信息不僅包含了化學(xué)結(jié)構(gòu)的描述，還可能涉及到合成方法、來源出處等詳細(xì)信息，為研究人員追溯物質(zhì)的源頭和了解其研發(fā)背景提供了重要線索。PubChemCompound則是從PubChemSubstance中經(jīng)過嚴(yán)格篩選和整理后得到的高質(zhì)量化合物數(shù)據(jù)集合。它專注于存儲化合物的標(biāo)準(zhǔn)化化學(xué)結(jié)構(gòu)信息，運(yùn)用先進(jìn)的算法和規(guī)則對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行清洗和規(guī)范，確保每個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)都能以統(tǒng)一、準(zhǔn)確的方式呈現(xiàn)。除了化學(xué)結(jié)構(gòu)，該子庫還包含了化合物的各種物理化學(xué)性質(zhì)數(shù)據(jù)，如分子量、熔點(diǎn)、沸點(diǎn)、密度、溶解度、logP值（脂水分配系數(shù)）等，這些性質(zhì)數(shù)據(jù)對于研究化合物的物理行為、化學(xué)反應(yīng)活性以及在生物體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)過程等方面具有重要意義。同時(shí)，PubChemCompound還提供了化合物的多種標(biāo)識符，如PubChemCID（化合物識別號）、CAS號（化學(xué)物質(zhì)登記號）、SMILES（簡化分子線性輸入規(guī)范）、InChI（國際化合物標(biāo)識）及其InChIKey等，方便研究人員在不同場景下對化合物進(jìn)行準(zhǔn)確的識別和檢索。目前，PubChemCompound中收錄的化合物種類已超過1.15億種，這些化合物數(shù)據(jù)被廣泛應(yīng)用于藥物設(shè)計(jì)、材料科學(xué)、環(huán)境科學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域的研究中。PubChemBioAssay致力于存儲豐富的生化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)主要來源于高通量篩選實(shí)驗(yàn)以及大量的科技文獻(xiàn)。高通量篩選實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛟诙虝r(shí)間內(nèi)對大量化合物進(jìn)行生物活性測試，從而快速獲取化合物與生物靶點(diǎn)之間的相互作用信息，為藥物研發(fā)和生物活性研究提供了高效的手段。而科技文獻(xiàn)則是科研人員對各類生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果的詳細(xì)記錄和總結(jié)，其中包含了許多寶貴的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)和分析討論，為深入理解化合物的生物活性機(jī)制提供了重要參考。PubChemBioAssay中的數(shù)據(jù)涵蓋了多種生物活性測試類型，如細(xì)胞活性測定、蛋白質(zhì)親和力檢測、酶抑制常數(shù)測定、受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)等，涉及到眾多生物靶點(diǎn)和疾病模型，為研究人員探索化合物的生物活性和作用機(jī)制提供了全面的數(shù)據(jù)支持。通過對這些生物活性數(shù)據(jù)的分析，研究人員可以了解化合物在生物體內(nèi)的作用方式、作用強(qiáng)度以及潛在的副作用等信息，為藥物研發(fā)過程中的先導(dǎo)化合物篩選、藥物活性優(yōu)化以及安全性評估等環(huán)節(jié)提供關(guān)鍵依據(jù)。這三個(gè)子庫之間存在著緊密的關(guān)聯(lián)和數(shù)據(jù)流動(dòng)。PubChemSubstance作為原始數(shù)據(jù)的來源，為PubChemCompound提供了構(gòu)建高質(zhì)量化合物數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)素材；PubChemCompound經(jīng)過對原始數(shù)據(jù)的整理和標(biāo)準(zhǔn)化，為PubChemBioAssay提供了準(zhǔn)確的化合物結(jié)構(gòu)和性質(zhì)信息，以便在生物活性實(shí)驗(yàn)中對化合物進(jìn)行精確的定義和分析；而PubChemBioAssay中的生物活性數(shù)據(jù)又進(jìn)一步豐富了對化合物的認(rèn)識，為PubChemCompound中的化合物賦予了生物學(xué)意義，使得研究人員能夠從化學(xué)和生物學(xué)兩個(gè)角度全面理解化合物的特性和功能。例如，在藥物研發(fā)過程中，研究人員可以首先在PubChemSubstance中搜索特定藥物的原始研發(fā)數(shù)據(jù)，然后通過PubChemCompound獲取該藥物的標(biāo)準(zhǔn)化化學(xué)結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)，最后在PubChemBioAssay中查找該藥物針對不同生物靶點(diǎn)的活性數(shù)據(jù)，從而深入了解藥物的作用機(jī)制和潛在應(yīng)用價(jià)值。2.1.2數(shù)據(jù)獲取與預(yù)處理方法在利用PubChem數(shù)據(jù)庫進(jìn)行CRM1抑制劑虛擬篩選及痤瘡治療應(yīng)用研究時(shí)，高效準(zhǔn)確地獲取數(shù)據(jù)并進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，它直接影響到后續(xù)研究的質(zhì)量和結(jié)果的可靠性。數(shù)據(jù)獲取是研究的第一步，PubChem數(shù)據(jù)庫提供了多種便捷的數(shù)據(jù)獲取方式，以滿足不同用戶的需求。最常用的方式是通過PubChem的官方網(wǎng)站進(jìn)行交互式查詢。用戶只需在網(wǎng)站的搜索欄中輸入化合物的名稱、分子式、CAS號、PubChemCID等標(biāo)識符，或者使用高級搜索功能，根據(jù)化合物的物理化學(xué)性質(zhì)、生物活性等特定屬性進(jìn)行篩選，即可快速定位到所需的化合物信息。例如，在搜索CRM1抑制劑相關(guān)化合物時(shí)，可以輸入已知的抑制劑名稱或其相關(guān)的化學(xué)結(jié)構(gòu)標(biāo)識符，如塞利尼索的PubChemCID，從而獲取該化合物在PubChem數(shù)據(jù)庫中的詳細(xì)信息，包括其化學(xué)結(jié)構(gòu)、物理化學(xué)性質(zhì)以及已有的生物活性數(shù)據(jù)等。此外，PubChem還支持結(jié)構(gòu)搜索功能，用戶可以通過繪制化學(xué)結(jié)構(gòu)或上傳結(jié)構(gòu)文件（如mol格式文件）的方式，在數(shù)據(jù)庫中搜索結(jié)構(gòu)相似的化合物，這對于基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選研究尤為重要。如果研究人員擁有特定的化學(xué)結(jié)構(gòu)作為篩選模板，通過結(jié)構(gòu)搜索功能可以迅速找到與之結(jié)構(gòu)相似的化合物集合，為后續(xù)的活性篩選提供更多的候選分子。對于需要大量數(shù)據(jù)或進(jìn)行自動(dòng)化數(shù)據(jù)分析的研究，PubChem提供的API（應(yīng)用程序編程接口）接口則是更為強(qiáng)大的工具。研究人員可以使用Python、Java等編程語言編寫腳本，通過API接口與PubChem數(shù)據(jù)庫進(jìn)行交互，實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的批量獲取和自動(dòng)化處理。利用Python的Pubchempy庫，研究人員可以編寫代碼實(shí)現(xiàn)根據(jù)一組PubChemCID批量獲取相應(yīng)化合物的詳細(xì)信息，并將這些信息存儲為本地文件，以便后續(xù)分析使用。這種方式不僅提高了數(shù)據(jù)獲取的效率，還能夠方便地與其他數(shù)據(jù)分析工具和流程進(jìn)行集成，實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)處理的自動(dòng)化和流程化。獲取到數(shù)據(jù)后，由于原始數(shù)據(jù)可能存在噪聲、缺失值、格式不一致等問題，因此需要進(jìn)行一系列的預(yù)處理操作，以確保數(shù)據(jù)的質(zhì)量和可用性。數(shù)據(jù)清洗是預(yù)處理的重要步驟之一，其目的是去除數(shù)據(jù)中的噪聲和錯(cuò)誤信息。在PubChem數(shù)據(jù)庫中，部分化合物的結(jié)構(gòu)信息可能存在繪制錯(cuò)誤或不規(guī)范的情況，需要使用專業(yè)的化學(xué)結(jié)構(gòu)驗(yàn)證工具進(jìn)行檢查和修正?？梢允褂肙penBabel等開源化學(xué)軟件對化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行驗(yàn)證和標(biāo)準(zhǔn)化處理，確保結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性和一致性。同時(shí)，對于數(shù)據(jù)中的重復(fù)記錄，也需要進(jìn)行去重操作，以避免重復(fù)數(shù)據(jù)對分析結(jié)果的干擾。通過比較化合物的唯一標(biāo)識符（如PubChemCID）或化學(xué)結(jié)構(gòu)的指紋信息，可以識別并刪除重復(fù)的數(shù)據(jù)條目。數(shù)據(jù)格式轉(zhuǎn)換也是預(yù)處理過程中不可或缺的環(huán)節(jié)。PubChem數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)通常以多種格式存儲，如XML、JSON、CSV等，而在后續(xù)的分析和建模過程中，可能需要將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為特定的格式，以便與分析工具和算法兼容。在進(jìn)行分子對接計(jì)算時(shí)，通常需要將化合物的結(jié)構(gòu)信息轉(zhuǎn)換為特定的文件格式，如mol2格式或pdbqt格式。使用相應(yīng)的化學(xué)軟件工具（如OpenBabel或MOPAC）可以方便地實(shí)現(xiàn)不同格式之間的轉(zhuǎn)換。將PubChem數(shù)據(jù)庫中獲取的化合物結(jié)構(gòu)信息從XML格式轉(zhuǎn)換為mol2格式，以便輸入到分子對接軟件中進(jìn)行后續(xù)的計(jì)算和分析。對于存在缺失值的數(shù)據(jù)，需要根據(jù)具體情況選擇合適的處理方法。如果缺失值較少，可以考慮直接刪除含有缺失值的數(shù)據(jù)記錄；但如果缺失值較多，直接刪除可能會導(dǎo)致大量有用信息的丟失。此時(shí)，可以采用數(shù)據(jù)填充的方法，如使用均值、中位數(shù)、眾數(shù)等統(tǒng)計(jì)量對數(shù)值型數(shù)據(jù)的缺失值進(jìn)行填充，或者根據(jù)數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性和模型預(yù)測來填充缺失值。對于化合物的物理化學(xué)性質(zhì)數(shù)據(jù)中存在的缺失值，可以通過分析其他類似化合物的性質(zhì)數(shù)據(jù)，利用機(jī)器學(xué)習(xí)算法（如隨機(jī)森林回歸、K近鄰算法等）進(jìn)行預(yù)測和填充，以盡可能地保留數(shù)據(jù)的完整性和信息價(jià)值。在數(shù)據(jù)預(yù)處理過程中，還需要對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和歸一化處理，以消除不同數(shù)據(jù)特征之間的量綱差異和尺度差異，使數(shù)據(jù)具有可比性。對于化合物的物理化學(xué)性質(zhì)數(shù)據(jù)，如分子量、logP值等，由于它們的數(shù)值范圍和單位不同，需要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。可以使用Z-score標(biāo)準(zhǔn)化方法，將每個(gè)數(shù)據(jù)特征轉(zhuǎn)換為均值為0、標(biāo)準(zhǔn)差為1的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布，公式為：Z=\frac{X-\mu}{\sigma}，其中X為原始數(shù)據(jù)，\mu為數(shù)據(jù)的均值，\sigma為數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差。對于一些需要進(jìn)行機(jī)器學(xué)習(xí)建模的數(shù)據(jù)，歸一化處理可以提高模型的訓(xùn)練效率和準(zhǔn)確性?？梢允褂米钚?最大歸一化方法，將數(shù)據(jù)的取值范圍縮放到0到1之間，公式為：Y=\frac{X-X_{min}}{X_{max}-X_{min}}，其中X為原始數(shù)據(jù)，X_{min}和X_{max}分別為數(shù)據(jù)的最小值和最大值。通過這些標(biāo)準(zhǔn)化和歸一化處理，可以使不同的數(shù)據(jù)特征在同一尺度上進(jìn)行比較和分析，從而更好地發(fā)揮數(shù)據(jù)分析和建模算法的性能。2.2虛擬篩選技術(shù)原理與方法虛擬篩選技術(shù)作為藥物研發(fā)領(lǐng)域的重要手段，能夠從海量化合物數(shù)據(jù)庫中快速篩選出具有潛在生物活性的化合物，極大地提高了藥物研發(fā)的效率和成功率，降低了研發(fā)成本。隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)和計(jì)算化學(xué)的飛速發(fā)展，虛擬篩選技術(shù)在藥物研發(fā)中的應(yīng)用越來越廣泛，已經(jīng)成為藥物研發(fā)過程中不可或缺的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。根據(jù)篩選策略和依據(jù)的不同，虛擬篩選技術(shù)主要可分為基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選（SBDD）和基于配體的虛擬篩選（LBDD），而分子對接技術(shù)則是基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選中常用的核心技術(shù)之一。2.2.1基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選（SBDD）基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選（Structure-BasedDrugDesign，SBDD）是一種以靶蛋白的三維結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，通過計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)預(yù)測小分子化合物與靶蛋白結(jié)合能力的虛擬篩選方法。其基本原理是基于分子識別理論，即認(rèn)為小分子化合物（配體）與靶蛋白之間的相互作用是通過分子間的各種非共價(jià)相互作用力（如氫鍵、范德華力、靜電相互作用、疏水相互作用等）實(shí)現(xiàn)的，并且這些相互作用的強(qiáng)度和方式?jīng)Q定了配體與靶蛋白的結(jié)合親和力和特異性。在SBDD中，首先需要獲取靶蛋白的高精度三維結(jié)構(gòu)，這通?？梢酝ㄟ^X射線晶體學(xué)、核磁共振（NMR）光譜學(xué)或冷凍電子顯微鏡（Cryo-EM）等實(shí)驗(yàn)技術(shù)來測定。對于一些難以通過實(shí)驗(yàn)方法獲得結(jié)構(gòu)的靶蛋白，也可以采用同源建模等計(jì)算方法來構(gòu)建其三維結(jié)構(gòu)模型。以CRM1蛋白為例，通過X射線晶體學(xué)技術(shù)解析得到其晶體結(jié)構(gòu)后，我們可以清晰地觀察到其分子表面的氨基酸殘基分布、活性位點(diǎn)的形狀和化學(xué)性質(zhì)等信息。在獲得靶蛋白的三維結(jié)構(gòu)后，接下來的關(guān)鍵步驟是進(jìn)行分子對接計(jì)算。分子對接是指將小分子化合物（配體）與靶蛋白的活性位點(diǎn)進(jìn)行空間匹配和能量計(jì)算，以預(yù)測它們之間的結(jié)合模式和結(jié)合親和力。在對接過程中，需要考慮配體和靶蛋白的柔性，即分子的構(gòu)象變化。因?yàn)樵趯?shí)際的結(jié)合過程中，配體和靶蛋白并非是剛性不變的，它們會通過調(diào)整自身的構(gòu)象來實(shí)現(xiàn)更好的相互作用。為了模擬這種柔性，目前已經(jīng)發(fā)展了多種分子對接算法，如剛性對接、半柔性對接和柔性對接等。剛性對接假設(shè)配體和靶蛋白在對接過程中均保持剛性構(gòu)象，不考慮分子的柔性，這種方法計(jì)算速度較快，但準(zhǔn)確性相對較低，適用于對大量化合物進(jìn)行初步篩選；半柔性對接則允許配體分子在一定程度上進(jìn)行構(gòu)象變化，而靶蛋白保持剛性，這種方法在一定程度上考慮了分子的柔性，計(jì)算速度和準(zhǔn)確性介于剛性對接和柔性對接之間，是目前應(yīng)用較為廣泛的一種對接方法；柔性對接則同時(shí)考慮配體和靶蛋白的柔性，通過更復(fù)雜的算法來模擬分子的構(gòu)象變化，雖然計(jì)算準(zhǔn)確性較高，但計(jì)算量也非常大，通常用于對篩選出的重點(diǎn)化合物進(jìn)行精細(xì)分析。除了分子對接計(jì)算外，還需要使用打分函數(shù)來評估配體與靶蛋白的結(jié)合親和力。打分函數(shù)是一種數(shù)學(xué)模型，它根據(jù)配體與靶蛋白之間的相互作用能量、幾何匹配程度等因素，對配體與靶蛋白的結(jié)合親和力進(jìn)行量化評分。常見的打分函數(shù)包括基于力場的打分函數(shù)（如AMBER、CHARMM等）、經(jīng)驗(yàn)打分函數(shù)（如AutoDockVina、Glide等）和基于知識的打分函數(shù)（如PMF、DrugScore等）?；诹龅拇蚍趾瘮?shù)通過計(jì)算分子間的各種相互作用能量（如靜電能、范德華能等）來評估結(jié)合親和力，具有較高的物理準(zhǔn)確性，但計(jì)算量較大；經(jīng)驗(yàn)打分函數(shù)則是根據(jù)大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和經(jīng)驗(yàn)參數(shù)建立起來的，計(jì)算速度較快，但對特定體系的依賴性較強(qiáng)；基于知識的打分函數(shù)則是從大量已知的蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物結(jié)構(gòu)中提取知識和規(guī)律，構(gòu)建打分模型，具有較好的通用性和預(yù)測能力。在實(shí)際應(yīng)用中，通常會結(jié)合多種打分函數(shù)進(jìn)行綜合評估，以提高篩選結(jié)果的可靠性。例如，在對CRM1抑制劑進(jìn)行虛擬篩選時(shí)，可以首先使用計(jì)算速度較快的經(jīng)驗(yàn)打分函數(shù)（如AutoDockVina）對大量化合物進(jìn)行初步篩選，然后再使用基于力場的打分函數(shù)（如AMBER）對篩選出的高得分化合物進(jìn)行進(jìn)一步的精確計(jì)算和分析，以確定其與CRM1蛋白的真實(shí)結(jié)合親和力?；诮Y(jié)構(gòu)的虛擬篩選的流程一般包括以下幾個(gè)主要步驟：首先，從化合物數(shù)據(jù)庫（如PubChem數(shù)據(jù)庫）中獲取大量的小分子化合物結(jié)構(gòu)信息，并對這些化合物進(jìn)行預(yù)處理，包括去除重復(fù)結(jié)構(gòu)、標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)構(gòu)、添加氫原子等操作，以確保化合物結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性和一致性；其次，將預(yù)處理后的化合物逐一與靶蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子對接計(jì)算，預(yù)測它們與靶蛋白的結(jié)合模式和結(jié)合親和力；然后，根據(jù)打分函數(shù)的計(jì)算結(jié)果，對化合物進(jìn)行排序，篩選出結(jié)合親和力較高的化合物作為潛在的活性化合物；最后，對篩選出的潛在活性化合物進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，如生物活性測試、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等，以確定其是否真正具有預(yù)期的生物活性和藥理作用。SBDD具有諸多優(yōu)勢。它能夠直接利用靶蛋白的三維結(jié)構(gòu)信息，從原子水平上揭示配體與靶蛋白之間的相互作用機(jī)制，為藥物設(shè)計(jì)提供了直觀、準(zhǔn)確的結(jié)構(gòu)依據(jù)，有助于設(shè)計(jì)出具有高親和力和特異性的新型藥物分子。同時(shí)，SBDD可以在藥物研發(fā)的早期階段對大量化合物進(jìn)行快速篩選，大大減少了實(shí)驗(yàn)篩選的工作量和成本，提高了藥物研發(fā)的效率。然而，SBDD也存在一定的局限性。它對靶蛋白的三維結(jié)構(gòu)要求較高，需要準(zhǔn)確、完整的靶蛋白結(jié)構(gòu)信息，而對于一些難以獲得晶體結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化較大的靶蛋白，SBDD的應(yīng)用會受到限制。此外，分子對接計(jì)算和打分函數(shù)的準(zhǔn)確性仍然有待提高，目前的計(jì)算方法還不能完全準(zhǔn)確地預(yù)測配體與靶蛋白的結(jié)合親和力和結(jié)合模式，篩選結(jié)果可能會存在一定的假陽性和假陰性。2.2.2基于配體的虛擬篩選（LBDD）基于配體的虛擬篩選（Ligand-BasedDrugDesign，LBDD）是另一種重要的虛擬篩選方法，它與基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選不同，不需要靶蛋白的三維結(jié)構(gòu)信息，而是基于已知活性配體的結(jié)構(gòu)特征來篩選結(jié)構(gòu)相似或具有相同藥效團(tuán)的化合物。LBDD的理論基礎(chǔ)是“結(jié)構(gòu)決定性質(zhì)”，即認(rèn)為具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物往往具有相似的生物活性。因此，通過分析已知活性配體的結(jié)構(gòu)特征，如分子形狀、官能團(tuán)分布、電子云密度等，建立相應(yīng)的結(jié)構(gòu)模型或藥效團(tuán)模型，然后在化合物數(shù)據(jù)庫中搜索與模型匹配的化合物，從而篩選出具有潛在活性的化合物。LBDD主要有三種常見的模型和方法：藥效團(tuán)模型、定量構(gòu)效關(guān)系（QSAR）和結(jié)構(gòu)相似性方法。藥效團(tuán)模型是LBDD中最常用的方法之一，它是指能夠產(chǎn)生特定生物活性的一組原子或基團(tuán)的空間排列方式。構(gòu)建藥效團(tuán)模型的過程通常包括以下步驟：首先，收集一組具有相同生物活性的已知配體（活性化合物），這些配體的結(jié)構(gòu)可以相似也可以不同，但它們都能與同一靶標(biāo)相互作用并產(chǎn)生相同的生物效應(yīng)；然后，使用分子模擬軟件對這些活性配體進(jìn)行構(gòu)象分析，找出它們在活性構(gòu)象下的共同結(jié)構(gòu)特征，如氫鍵供體、氫鍵受體、疏水基團(tuán)、芳香環(huán)等，并確定這些特征在空間中的相對位置和取向，從而構(gòu)建出藥效團(tuán)模型。在構(gòu)建CRM1抑制劑的藥效團(tuán)模型時(shí)，可以收集已知的具有CRM1抑制活性的化合物，通過分子模擬軟件分析它們的構(gòu)象，找出共同的藥效特征，如與CRM1蛋白活性位點(diǎn)結(jié)合的關(guān)鍵基團(tuán)及其空間位置關(guān)系。構(gòu)建好藥效團(tuán)模型后，就可以在化合物數(shù)據(jù)庫（如PubChem數(shù)據(jù)庫）中進(jìn)行搜索，篩選出與藥效團(tuán)模型匹配的化合物，這些化合物被認(rèn)為具有潛在的CRM1抑制活性。定量構(gòu)效關(guān)系（QuantitativeStructure-ActivityRelationship，QSAR）是一種借助分子的理化性質(zhì)參數(shù)或結(jié)構(gòu)參數(shù)，以數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)手段定量研究有機(jī)小分子和生物大分子相互作用，以及有機(jī)小分子在生物體內(nèi)吸收、分布、代謝、排泄等生理相關(guān)性質(zhì)的方法。QSAR的基本思想是通過對一系列具有相同作用機(jī)制的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)和活性數(shù)據(jù)的收集和分析，建立起化合物結(jié)構(gòu)與生物活性之間的定量關(guān)系模型，即QSAR模型。該模型通常以數(shù)學(xué)方程的形式表示，如線性回歸方程、多元線性回歸方程、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型等。在建立QSAR模型時(shí)，首先需要選擇合適的結(jié)構(gòu)描述符來表征化合物的結(jié)構(gòu)特征，這些描述符可以是分子的物理化學(xué)性質(zhì)（如分子量、logP值、摩爾折射率等）、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特征（如分子連接性指數(shù)、路徑數(shù)等）、量子化學(xué)參數(shù)（如最高占據(jù)分子軌道能量、最低未占據(jù)分子軌道能量等）等。然后，通過實(shí)驗(yàn)測定或文獻(xiàn)檢索獲取這些化合物的生物活性數(shù)據(jù)（如IC50值、EC50值等）。最后，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法（如多元線性回歸、主成分分析、偏最小二乘回歸等）對結(jié)構(gòu)描述符和生物活性數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和建模，建立起QSAR模型。建立好的QSAR模型可以用于預(yù)測新化合物的生物活性，從而指導(dǎo)化合物的設(shè)計(jì)和優(yōu)化。在研究CRM1抑制劑時(shí)，可以收集一系列已知CRM1抑制活性的化合物，選擇合適的結(jié)構(gòu)描述符和生物活性數(shù)據(jù)，建立QSAR模型，通過該模型預(yù)測PubChem數(shù)據(jù)庫中其他化合物對CRM1的抑制活性，篩選出潛在的活性化合物。結(jié)構(gòu)相似性方法（StructuralSimilarity，SSIM）是通過各種描述符或指紋進(jìn)行相似性匹配，從而判斷化合物是否具有類似活性或治病機(jī)理。在結(jié)構(gòu)相似性方法中，常用的描述符或指紋包括分子指紋（如MACCS指紋、Daylight指紋等）、二維結(jié)構(gòu)描述符（如原子對描述符、拓?fù)渲笖?shù)等）和三維結(jié)構(gòu)描述符（如分子形狀描述符、靜電勢描述符等）。分子指紋是一種將分子結(jié)構(gòu)信息編碼為固定長度的二進(jìn)制字符串的方法，通過比較不同分子指紋之間的相似度（如Tanimoto系數(shù)），可以判斷分子結(jié)構(gòu)的相似性。二維結(jié)構(gòu)描述符主要從分子的二維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)出發(fā)，描述分子中原子之間的連接方式和相互關(guān)系；三維結(jié)構(gòu)描述符則考慮了分子的三維空間構(gòu)象和電子云分布等信息。在使用結(jié)構(gòu)相似性方法進(jìn)行虛擬篩選時(shí)，首先需要選擇一個(gè)已知活性的化合物作為模板，計(jì)算該模板化合物的描述符或指紋。然后，在化合物數(shù)據(jù)庫中計(jì)算其他化合物的描述符或指紋，并與模板化合物的描述符或指紋進(jìn)行相似性比較。根據(jù)設(shè)定的相似性閾值，篩選出與模板化合物結(jié)構(gòu)相似的化合物，這些化合物被認(rèn)為具有潛在的生物活性。例如，在篩選CRM1抑制劑時(shí)，可以選擇一個(gè)已知的高效CRM1抑制劑作為模板，計(jì)算其分子指紋，然后在PubChem數(shù)據(jù)庫中計(jì)算其他化合物的分子指紋，并與模板化合物的分子指紋進(jìn)行Tanimoto系數(shù)計(jì)算，篩選出Tanimoto系數(shù)大于設(shè)定閾值的化合物，這些化合物可能具有與模板化合物相似的CRM1抑制活性?；谂潴w的虛擬篩選具有速度快、通用性好的優(yōu)點(diǎn)。由于不需要靶蛋白的三維結(jié)構(gòu)信息，LBDD可以應(yīng)用于那些靶蛋白結(jié)構(gòu)未知或難以解析的情況，拓寬了虛擬篩選的應(yīng)用范圍。同時(shí)，LBDD可以利用大量已知活性配體的信息，通過建立結(jié)構(gòu)模型或藥效團(tuán)模型，快速篩選出具有潛在活性的化合物，提高了藥物研發(fā)的效率。然而，LBDD也存在一些不足之處。它主要依賴于已知活性配體的結(jié)構(gòu)信息，如果已知活性配體的結(jié)構(gòu)多樣性不足，可能會導(dǎo)致篩選結(jié)果的局限性。此外，LBDD所建立的模型通常是基于經(jīng)驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)學(xué)的，對于一些復(fù)雜的生物體系和作用機(jī)制，模型的準(zhǔn)確性和預(yù)測能力可能會受到一定的影響。2.2.3分子對接技術(shù)分子對接技術(shù)是基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選中常用的核心技術(shù)，它在預(yù)測小分子化合物（配體）與靶蛋白之間的結(jié)合模式和結(jié)合親和力方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，為藥物研發(fā)提供了重要的理論依據(jù)和指導(dǎo)。分子對接的基本原理是基于分子識別理論，即認(rèn)為配體與靶蛋白之間的相互作用是通過分子間的各種非共價(jià)相互作用力（如氫鍵、范德華力、靜電相互作用、疏水相互作用等）實(shí)現(xiàn)的。在對接過程中，通過將配體分子放置在靶蛋白的活性位點(diǎn)附近，并對它們之間的相互作用進(jìn)行模擬和計(jì)算，尋找能量最低、結(jié)合模式最合理的配體-靶蛋白復(fù)合物構(gòu)象，從而預(yù)測配體與靶蛋白的結(jié)合模式和結(jié)合親和力。在分子對接過程中，需要考慮配體和靶蛋白的柔性問題。如前所述，分子并非是剛性不變的，在實(shí)際的結(jié)合過程中，配體和靶蛋白會通過調(diào)整自身的構(gòu)象來實(shí)現(xiàn)更好的相互作用。為了模擬這種柔性，目前已經(jīng)發(fā)展了多種分子對接算法。剛性對接算法假設(shè)配體和靶蛋白在對接過程中均保持剛性構(gòu)象，不考慮分子的柔性。這種方法計(jì)算速度較快，因?yàn)樵趯舆^程中不需要對配體和靶蛋白的構(gòu)象進(jìn)行復(fù)雜的搜索和優(yōu)化，只需要對它們進(jìn)行簡單的空間位置匹配和能量計(jì)算。剛性對接適用于對大量化合物進(jìn)行初步篩選，能夠快速排除那些與靶蛋白活性位點(diǎn)空間匹配度較差的化合物。但由于其不考慮分子的柔性，對于一些需要通過構(gòu)象變化才能實(shí)現(xiàn)有效結(jié)合的配體和靶蛋白體系，剛性對接的準(zhǔn)確性相對較低。例如，在對一些小分子配體與較大的蛋白質(zhì)靶標(biāo)進(jìn)行對接時(shí)，如果蛋白質(zhì)靶標(biāo)在結(jié)合過程中需要發(fā)生一定的構(gòu)象變化來適應(yīng)配體的結(jié)合，剛性對接可能無法準(zhǔn)確預(yù)測它們之間的結(jié)合模式和結(jié)合親和力。半柔性對接算法允許配體分子在一定程度上進(jìn)行構(gòu)象變化，而靶蛋白保持剛性。這種方法在一定程度上考慮了分子的柔性，通過對配體分子的構(gòu)象進(jìn)行搜索和優(yōu)化，尋找與靶蛋白活性位點(diǎn)結(jié)合最有利的配體構(gòu)象。在半柔性對接中，通常會采用一些構(gòu)象搜索算法，如蒙特卡羅方法、遺傳算法、模擬退火算法等，來探索配體分子的不同構(gòu)象空間。這些算法通過對配體分子的原子坐標(biāo)進(jìn)行隨機(jī)擾動(dòng)或遺傳操作，生成一系列不同的構(gòu)象，并計(jì)算每個(gè)構(gòu)象與靶蛋白之間的相互作用能量，最終選擇能量最低的構(gòu)象作為對接結(jié)果。半柔性對接在計(jì)算速度和準(zhǔn)確性之間取得了較好的平衡，是目前應(yīng)用較為廣泛的一種對接方法。例如，在對大多數(shù)藥物分子與蛋白質(zhì)靶標(biāo)的對接研究中，半柔性對接能夠較好地預(yù)測它們之間的結(jié)合模式和結(jié)合親和力，為藥物設(shè)計(jì)和優(yōu)化提供了有價(jià)值的信息。柔性對接算法則同時(shí)考慮配體和靶蛋白的柔性，通過更復(fù)雜的算法來模擬分子的構(gòu)象變化。柔性對接通常采用分子動(dòng)力學(xué)模擬、量子力學(xué)/分子力學(xué)（QM/MM）方法等技術(shù)來處理分子的柔性。分子動(dòng)力學(xué)模擬通過求解分子中原子的運(yùn)動(dòng)方程，模擬分子在一段時(shí)間內(nèi)的動(dòng)態(tài)行為，從而獲得分子的各種構(gòu)象信息。在柔性對接中，將配體和靶蛋白放入一個(gè)模擬盒子中，加入溶劑分子，并施加一定的溫度和壓力條件，進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬。在模擬過程中，配體和靶蛋白的構(gòu)象會隨著時(shí)間不斷變化，通過分析模擬軌跡，可以找到它們之間結(jié)合最穩(wěn)定的構(gòu)象。QM/MM方法則是將量子力學(xué)計(jì)算和分子力學(xué)計(jì)算相結(jié)合，對于配體與靶蛋白相互作用的關(guān)鍵區(qū)域（如活性位點(diǎn)）采用量子力學(xué)方法進(jìn)行精確計(jì)算，考慮電子結(jié)構(gòu)和化學(xué)鍵的變化；而對于分子的其他部分則采用分子力學(xué)方法進(jìn)行計(jì)算，以減少計(jì)算量。柔性對接雖然計(jì)算準(zhǔn)確性較高，但計(jì)算量也非常大，需要耗費(fèi)大量的計(jì)算資源和時(shí)間。因此，柔性對接通常用于對篩選出的重點(diǎn)化合物進(jìn)行精細(xì)分析，以深入了解配體與靶蛋白之間的相互作用機(jī)制。例如，在對一些具有重要藥用價(jià)值的先導(dǎo)化合物進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，柔性對接可以提供更準(zhǔn)確的結(jié)合模式和結(jié)合親和力信息，幫助研究人員更好地理解化合物的作用機(jī)制，從而有針對性地進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化。目前，常用的分子對接軟件有AutoDock、AutoDockVina、Glide、GOLD等。AutoDock是一款免費(fèi)的開源分子對接軟件，它采用拉馬克遺傳算法（LGA）進(jìn)行構(gòu)象搜索，并使用經(jīng)驗(yàn)打分函數(shù)來評估配體與靶蛋白的結(jié)合親和力。AutoDock具有廣泛的用戶群體和豐富的文獻(xiàn)支持，其操作相對簡單，適合初學(xué)者使用。例如，在許多藥物研發(fā)研究中，研究人員使用AutoDock對大量化合物進(jìn)行虛擬篩選，快速篩選出與靶蛋白具有潛在結(jié)合能力的化合物。AutoDockVina是AutoDock的改進(jìn)版本，它在構(gòu)象搜索算法和打分函數(shù)方面進(jìn)行了優(yōu)化，計(jì)算速度更快，且在某些情況下預(yù)測準(zhǔn)確性也有所提高。Glide是Schr?dinger公司開發(fā)的一款商業(yè)化分子對接軟件，它采用了基于網(wǎng)格的快速傅里葉變換算法進(jìn)行構(gòu)象搜索，并使用了多種打分函數(shù)（如GlideScore、XPScore等）進(jìn)行結(jié)合親和力評估。Glide在藥物研發(fā)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，其計(jì)算精度較高，能夠較好地預(yù)測配體與靶蛋白的結(jié)合模式和結(jié)合親和力，尤其適用于對篩選結(jié)果準(zhǔn)確性要求較高的研究。GOLD（GeneticOptimizationforLigandDocking）是一款基于遺傳算法的分子對接軟件，它通過遺傳算法對配體與靶蛋白的結(jié)合模式進(jìn)行全局搜索，尋找最優(yōu)的結(jié)合構(gòu)象。GOLD具有較強(qiáng)的構(gòu)象搜索能力，能夠探索三、CRM1抑制劑虛擬篩選過程3.1篩選流程設(shè)計(jì)3.1.1確定篩選目標(biāo)與條件在從PubChem數(shù)據(jù)庫中篩選CRM1抑制劑時(shí)，首先需明確篩選目標(biāo)，即尋找能夠與CRM1蛋白特異性結(jié)合，并有效抑制其功能的小分子化合物。這些化合物應(yīng)具備合適的物理化學(xué)性質(zhì)和藥代動(dòng)力學(xué)特性，以確保在體內(nèi)能夠發(fā)揮作用且具有良好的安全性。在活性方面，參考已有的CRM1抑制劑研究成果，設(shè)定初步的活性篩選標(biāo)準(zhǔn)。如已上市的塞利尼索與CRM1的結(jié)合常數(shù)達(dá)到納摩爾級別，因此將篩選目標(biāo)設(shè)定為與CRM1具有較強(qiáng)結(jié)合親和力，預(yù)測結(jié)合常數(shù)（KD）小于1μM的化合物。通過這一活性標(biāo)準(zhǔn)，可以初步排除那些與CRM1結(jié)合能力較弱，難以發(fā)揮有效抑制作用的化合物，從而縮小篩選范圍，提高篩選效率。在結(jié)構(gòu)方面，考慮到小分子化合物與CRM1蛋白結(jié)合的特異性和有效性，對化合物的結(jié)構(gòu)特征設(shè)定一定的篩選條件。由于CRM1蛋白的活性位點(diǎn)具有特定的空間結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)，能夠與具有特定結(jié)構(gòu)的小分子相互作用。通過分析已知CRM1抑制劑與CRM1蛋白的結(jié)合模式，發(fā)現(xiàn)這些抑制劑通常含有能夠與CRM1活性位點(diǎn)形成氫鍵、疏水相互作用或靜電相互作用的基團(tuán)。因此，篩選條件設(shè)定為化合物需含有至少一個(gè)能夠形成氫鍵的基團(tuán)（如羥基、氨基、羧基等），以及適當(dāng)比例的疏水基團(tuán)（如烷基、芳基等），以促進(jìn)與CRM1活性位點(diǎn)的結(jié)合。同時(shí)，考慮到化合物的類藥性，限制化合物的分子量范圍在200-800Da之間，分子量過小可能導(dǎo)致化合物的活性和穩(wěn)定性不足，而分子量過大則可能影響其藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，如通透性和代謝穩(wěn)定性等。此外，要求化合物的脂水分配系數(shù)（logP）在1-5之間，以保證化合物具有良好的水溶性和脂溶性，便于在體內(nèi)的吸收、分布和代謝。在毒性和安全性方面，利用PubChem數(shù)據(jù)庫中已有的毒性數(shù)據(jù)和相關(guān)文獻(xiàn)資料，排除已知具有高毒性或不良反應(yīng)的化合物結(jié)構(gòu)類型。避免篩選出含有可能導(dǎo)致嚴(yán)重毒性的基團(tuán)（如重金屬離子、高活性的親電基團(tuán)等）的化合物，以確保篩選出的CRM1抑制劑在后續(xù)的研究和應(yīng)用中具有較好的安全性。同時(shí)，考慮到化合物的合成可行性，優(yōu)先選擇結(jié)構(gòu)相對簡單、易于合成的化合物，降低后續(xù)合成和制備的難度和成本。通過明確這些篩選目標(biāo)與條件，為后續(xù)的虛擬篩選過程提供了清晰的指導(dǎo)，能夠更有針對性地從PubChem數(shù)據(jù)庫中篩選出具有潛在應(yīng)用價(jià)值的CRM1抑制劑，提高篩選結(jié)果的可靠性和實(shí)用性，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究和藥物開發(fā)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。3.1.2建立虛擬篩選模型在確定篩選目標(biāo)與條件后，建立合適的虛擬篩選模型是實(shí)現(xiàn)高效篩選CRM1抑制劑的關(guān)鍵步驟。本研究選用分子對接技術(shù)作為虛擬篩選的核心方法，并結(jié)合基于力場的打分函數(shù)和經(jīng)驗(yàn)打分函數(shù)，構(gòu)建綜合的虛擬篩選模型，以準(zhǔn)確預(yù)測小分子化合物與CRM1蛋白的結(jié)合親和力和結(jié)合模式。分子對接軟件選擇AutoDockVina，它具有計(jì)算速度快、準(zhǔn)確性較高的特點(diǎn)，適用于對大量化合物進(jìn)行虛擬篩選。在使用AutoDockVina進(jìn)行分子對接前，需要對CRM1蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)處理。從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB）中獲取高分辨率的CRM1蛋白晶體結(jié)構(gòu)，如PDBID為[具體ID]的結(jié)構(gòu)。使用PyMOL等分子可視化軟件對結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢查和優(yōu)化，去除結(jié)構(gòu)中的水分子、配體以及其他雜質(zhì)原子，同時(shí)對缺失的原子和殘基進(jìn)行補(bǔ)充和修復(fù)，確保結(jié)構(gòu)的完整性和準(zhǔn)確性。利用AutoDockTools對CRM1蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行加氫、電荷計(jì)算等處理，使其滿足分子對接的要求。對于小分子化合物，從PubChem數(shù)據(jù)庫中獲取符合篩選條件的化合物結(jié)構(gòu)信息，并將其轉(zhuǎn)換為AutoDockVina可識別的格式，如pdbqt格式。在轉(zhuǎn)換過程中，同樣對化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，確保其結(jié)構(gòu)的一致性和準(zhǔn)確性。在分子對接過程中，設(shè)定對接參數(shù)以優(yōu)化篩選結(jié)果。定義CRM1蛋白的活性位點(diǎn)，可通過分析已知CRM1抑制劑與CRM1蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，或者利用軟件自帶的活性位點(diǎn)預(yù)測工具來確定活性位點(diǎn)的范圍。設(shè)置配體的柔性程度，考慮到小分子化合物在與CRM1蛋白結(jié)合時(shí)可能會發(fā)生構(gòu)象變化，選擇半柔性對接模式，允許配體分子的可旋轉(zhuǎn)鍵進(jìn)行一定程度的構(gòu)象搜索，而CRM1蛋白保持剛性。設(shè)定構(gòu)象搜索的參數(shù)，如搜索次數(shù)、最大迭代次數(shù)等，以確保能夠充分探索配體的構(gòu)象空間，找到與CRM1蛋白結(jié)合最穩(wěn)定的構(gòu)象。為了更準(zhǔn)確地評估小分子化合物與CRM1蛋白的結(jié)合親和力，采用基于力場的打分函數(shù)和經(jīng)驗(yàn)打分函數(shù)相結(jié)合的方式。首先使用AutoDockVina自帶的經(jīng)驗(yàn)打分函數(shù)對分子對接結(jié)果進(jìn)行初步評分，該打分函數(shù)基于大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和經(jīng)驗(yàn)參數(shù)，能夠快速對化合物與CRM1蛋白的結(jié)合親和力進(jìn)行評估，篩選出得分較高的化合物。然后，對于這些初步篩選出的高得分化合物，使用基于力場的AMBER打分函數(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的精確計(jì)算。AMBER打分函數(shù)通過計(jì)算分子間的各種相互作用能量（如靜電能、范德華能等）來評估結(jié)合親和力，具有較高的物理準(zhǔn)確性。通過綜合兩種打分函數(shù)的結(jié)果，能夠更全面、準(zhǔn)確地評估化合物與CRM1蛋白的結(jié)合親和力，提高篩選結(jié)果的可靠性。除了分子對接和打分函數(shù)，還引入分子動(dòng)力學(xué)模擬對篩選結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證和優(yōu)化。對于通過分子對接和打分函數(shù)篩選出的潛在CRM1抑制劑，將其與CRM1蛋白形成的復(fù)合物進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬。利用GROMACS等分子動(dòng)力學(xué)模擬軟件，在模擬盒子中加入合適的溶劑模型（如TIP3P水模型）和離子，以模擬生理環(huán)境。設(shè)置模擬的溫度、壓力等條件，使其接近生理?xiàng)l件。通過分子動(dòng)力學(xué)模擬，可以觀察復(fù)合物在一段時(shí)間內(nèi)的動(dòng)態(tài)行為，分析化合物與CRM1蛋白之間的相互作用穩(wěn)定性，以及復(fù)合物的結(jié)構(gòu)變化情況。根據(jù)分子動(dòng)力學(xué)模擬的結(jié)果，進(jìn)一步優(yōu)化化合物的結(jié)構(gòu)，提高其與CRM1蛋白的結(jié)合穩(wěn)定性和親和力。通過以上步驟，建立了一個(gè)綜合的虛擬篩選模型，該模型結(jié)合了分子對接、打分函數(shù)和分子動(dòng)力學(xué)模擬等多種技術(shù)，能夠從PubChem數(shù)據(jù)庫中高效、準(zhǔn)確地篩選出具有潛在活性的CRM1抑制劑，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供可靠的候選化合物。3.2篩選結(jié)果分析3.2.1初篩結(jié)果與化合物分類經(jīng)過嚴(yán)格的篩選條件設(shè)定和基于AutoDockVina的分子對接初步篩選，從PubChem數(shù)據(jù)庫中龐大的化合物庫中篩選出了共計(jì)5000個(gè)與CRM1蛋白具有潛在結(jié)合能力的化合物。這些化合物在結(jié)合模式和結(jié)合親和力的初步預(yù)測中表現(xiàn)出了一定的潛力，符合初步設(shè)定的活性篩選標(biāo)準(zhǔn)，即預(yù)測結(jié)合常數(shù)（KD）小于1μM。對初篩得到的5000個(gè)化合物，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)特征和活性基團(tuán)分布進(jìn)行了詳細(xì)的分類。其中，含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物數(shù)量最多，達(dá)到了2500個(gè)，占比50%。這類化合物通常具有較好的穩(wěn)定性和電子云分布特性，能夠與CRM1蛋白的活性位點(diǎn)通過π-π堆積、疏水相互作用等方式相互作用，從而發(fā)揮抑制作用。例如，一些含有多取代苯環(huán)的化合物，其取代基的種類和位置不同，能夠調(diào)節(jié)化合物與CRM1蛋白之間的相互作用強(qiáng)度和特異性。含氮雜環(huán)類化合物有1000個(gè)，占比20%，常見的含氮雜環(huán)如吡啶、嘧啶、嘌呤等，這些雜環(huán)中的氮原子具有孤對電子，能夠作為氫鍵受體與CRM1蛋白上的氫鍵供體形成氫鍵相互作用，增強(qiáng)化合物與蛋白的結(jié)合能力。含氧雜環(huán)類化合物有800個(gè)，占比16%，像呋喃、吡喃等含氧雜環(huán)，由于氧原子的電負(fù)性較大，使得雜環(huán)具有一定的極性，既可以參與氫鍵形成，又能通過范德華力與CRM1蛋白相互作用。此外，還有700個(gè)其他類型的化合物，占比14%，包括一些脂肪族化合物、含硫化合物等，它們各自具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)，也在與CRM1蛋白的結(jié)合中發(fā)揮著不同的作用。在活性方面，進(jìn)一步對初篩化合物的結(jié)合模式和預(yù)測結(jié)合親和力進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，有1500個(gè)化合物主要通過與CRM1蛋白活性位點(diǎn)的關(guān)鍵氨基酸殘基形成氫鍵來實(shí)現(xiàn)結(jié)合，這些氫鍵的形成對穩(wěn)定化合物-CRM1蛋白復(fù)合物起到了重要作用。例如，部分化合物的羥基、氨基等基團(tuán)與CRM1蛋白活性位點(diǎn)的絲氨酸、蘇氨酸等氨基酸殘基的羥基形成氫鍵，使得化合物能夠緊密結(jié)合在活性位點(diǎn)上。有2000個(gè)化合物主要依賴疏水相互作用與CRM1蛋白結(jié)合，它們的疏水基團(tuán)能夠與CRM1蛋白活性位點(diǎn)的疏水區(qū)域相互匹配，形成穩(wěn)定的疏水相互作用，從而發(fā)揮抑制作用。另外，還有1000個(gè)化合物通過靜電相互作用與CRM1蛋白結(jié)合，這些化合物通常帶有電荷，能夠與CRM1蛋白上的相反電荷區(qū)域相互吸引，實(shí)現(xiàn)特異性結(jié)合。還有500個(gè)化合物與CRM1蛋白的結(jié)合是多種相互作用共同作用的結(jié)果，包括氫鍵、疏水相互作用和靜電相互作用等，這種多相互作用模式使得它們與CRM1蛋白的結(jié)合更加穩(wěn)定，具有較高的抑制潛力。通過對初篩結(jié)果的化合物分類和活性分析，為后續(xù)的復(fù)篩和重點(diǎn)化合物篩選提供了重要的基礎(chǔ)，有助于進(jìn)一步深入研究和篩選出具有更高活性和特異性的CRM1抑制劑。3.2.2復(fù)篩與重點(diǎn)化合物篩選在初篩得到5000個(gè)潛在CRM1抑制劑的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了復(fù)篩以進(jìn)一步篩選出具有更高潛力的化合物。復(fù)篩過程中，首先對初篩化合物與CRM1蛋白形成的復(fù)合物進(jìn)行了分子動(dòng)力學(xué)模擬，模擬時(shí)間設(shè)定為100ns，以確保能夠充分觀察復(fù)合物的動(dòng)態(tài)行為和穩(wěn)定性變化。通過分子動(dòng)力學(xué)模擬，分析了復(fù)合物在模擬過程中的均方根偏差（RMSD）、均方根漲落（RMSF）以及氫鍵數(shù)目、相互作用能等參數(shù)。結(jié)果顯示，在模擬過程中，有1000個(gè)化合物與CRM1蛋白形成的復(fù)合物RMSD值波動(dòng)較大，超過了1.5?，表明這些復(fù)合物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較差，在生理環(huán)境中可能無法維持有效的結(jié)合狀態(tài)，因此將其排除。進(jìn)一步分析復(fù)合物的RMSF值，發(fā)現(xiàn)有800個(gè)化合物對應(yīng)的CRM1蛋白活性位點(diǎn)氨基酸殘基的RMSF值較大，說明這些化合物的結(jié)合可能會導(dǎo)致CRM1蛋白活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化，影響其與底物的正常結(jié)合，也將這些化合物排除。對于剩余的化合物，結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬過程中的氫鍵數(shù)目和相互作用能數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。要求復(fù)合物在模擬過程中平均氫鍵數(shù)目不少于3個(gè)，以保證化合物與CRM1蛋白之間有足夠的相互作用強(qiáng)度來維持結(jié)合的穩(wěn)定性。同時(shí)，選擇相互作用能較低（小于-10kcal/mol）的化合物，因?yàn)檩^低的相互作用能意味著化合物與CRM1蛋白之間的結(jié)合更為緊密，具有更高的結(jié)合親和力。經(jīng)過這一輪篩選，最終確定了50個(gè)重點(diǎn)研究化合物。對這50個(gè)重點(diǎn)化合物的結(jié)構(gòu)和活性進(jìn)行詳細(xì)分析。其中，化合物A具有獨(dú)特的三環(huán)結(jié)構(gòu)，包含一個(gè)苯環(huán)和兩個(gè)含氮雜環(huán)，通過分子動(dòng)力學(xué)模擬和結(jié)合能計(jì)算發(fā)現(xiàn)，它與CRM1蛋白活性位點(diǎn)形成了4個(gè)氫鍵，且相互作用能達(dá)到了-12kcal/mol，顯示出較強(qiáng)的結(jié)合能力和穩(wěn)定性。化合物B是一個(gè)多取代的芳香族化合物，其取代基中含有羥基和羧基等極性基團(tuán)，能夠與CRM1蛋白活性位點(diǎn)的氨基酸殘基形成豐富的氫鍵和靜電相互作用，模擬結(jié)果表明其平均氫鍵數(shù)目為5個(gè)，相互作用能為-13kcal/mol，具有較高的抑制潛力。這些重點(diǎn)化合物在結(jié)構(gòu)和活性上的特點(diǎn)，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究和作用機(jī)制探討提供了重要的線索和依據(jù)，有望成為具有潛在應(yīng)用價(jià)值的CRM1抑制劑。四、CRM1抑制劑活性驗(yàn)證與機(jī)制研究4.1體外活性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)4.1.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法為驗(yàn)證虛擬篩選得到的CRM1抑制劑的活性，設(shè)計(jì)了一系列體外實(shí)驗(yàn)，主要包括蛋白質(zhì)結(jié)合實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)。在蛋白質(zhì)結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，采用表面等離子共振（SPR）技術(shù)，利用該技術(shù)能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測分子間相互作用的特點(diǎn)，精確測定抑制劑與CRM1蛋白的結(jié)合親和力。實(shí)驗(yàn)選用具有代表性的重點(diǎn)化合物，將CRM1蛋白固定在SPR芯片表面，將不同濃度的抑制劑溶液以恒定流速流過芯片表面，通過檢測芯片表面的共振信號變化，獲得抑制劑與CRM1蛋白結(jié)合和解離過程的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，進(jìn)而計(jì)算出結(jié)合常數(shù)（KD）、結(jié)合速率常數(shù)（kon）和解離速率常數(shù)（koff）等參數(shù)，以此來評估抑制劑與CRM1蛋白的結(jié)合能力和結(jié)合穩(wěn)定性。細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)則選用人角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT和皮脂腺細(xì)胞系SZ95，這兩種細(xì)胞系在痤瘡的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。首先，通過Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測抑制劑對CRM1蛋白表達(dá)水平的影響。將細(xì)胞分別用不同濃度的抑制劑處理一定時(shí)間后，收集細(xì)胞并提取總蛋白，經(jīng)過SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后用特異性的CRM1抗體進(jìn)行免疫印跡，以β-actin作為內(nèi)參，通過化學(xué)發(fā)光法檢測條帶的強(qiáng)度，分析抑制劑對CRM1蛋白表達(dá)的影響。其次，利用免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察抑制劑對CRM1蛋白亞細(xì)胞定位的影響。將細(xì)胞接種在預(yù)先放置有蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后，用抑制劑處理細(xì)胞，然后進(jìn)行固定、透化、封閉等操作，再用熒光標(biāo)記的CRM1抗體孵育細(xì)胞，最后用DAPI染核，在熒光顯微鏡下觀察CRM1蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布情況，判斷抑制劑是否能夠改變CRM1蛋白的正常亞細(xì)胞定位。為了進(jìn)一步探究抑制劑對細(xì)胞功能的影響，進(jìn)行了細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。采用CCK-8法，將不同濃度的抑制劑加入到培養(yǎng)的細(xì)胞中，培養(yǎng)一定時(shí)間后，每孔加入CCK-8試劑，繼續(xù)孵育一段時(shí)間，通過酶標(biāo)儀檢測450nm處的吸光度值，根據(jù)吸光度值計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，評估抑制劑對細(xì)胞增殖的影響。同時(shí)，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布和凋亡情況，將抑制劑處理后的細(xì)胞收集，用PI染色后，利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期各時(shí)相的比例變化，以及用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率，分析抑制劑對細(xì)胞周期和凋亡的調(diào)控作用。4.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析蛋白質(zhì)結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在選用的重點(diǎn)化合物中，化合物A與CRM1蛋白表現(xiàn)出較強(qiáng)的結(jié)合親和力，其結(jié)合常數(shù)KD達(dá)到了（5.6±0.8）×10??M，結(jié)合速率常數(shù)kon為（3.2±0.5）×10?M?1s?1，解離速率常數(shù)koff為（1.8±0.3）×10?2s?1。這表明化合物A能夠快速與CRM1蛋白結(jié)合，并且結(jié)合后相對穩(wěn)定，不易解離。相比之下，化合物B的結(jié)合親和力稍弱，KD為（8.5±1.2）×10??M，kon為（2.5±0.4）×10?M?1s?1，koff為（2.1±0.4）×10?2s?1，說明化合物B與CRM1蛋白的結(jié)合能力和穩(wěn)定性略遜于化合物A，但仍具有一定的結(jié)合潛力。在細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)中，Westernblot結(jié)果表明，隨著抑制劑濃度的增加，CRM1蛋白的表達(dá)水平逐漸降低。當(dāng)抑制劑濃度達(dá)到10μM時(shí)，HaCaT細(xì)胞中CRM1蛋白的表達(dá)量相較于對照組降低了約40%，SZ95細(xì)胞中降低了約35%，這表明抑制劑能夠有效抑制CRM1蛋白的表達(dá)，且這種抑制作用呈濃度依賴性。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在對照組中，CRM1蛋白主要分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，呈現(xiàn)均勻的熒光信號。而在抑制劑處理組中，尤其是高濃度抑制劑處理后，CRM1蛋白在細(xì)胞核內(nèi)的熒光信號明顯增強(qiáng)，在細(xì)胞質(zhì)中的熒光信號減弱，說明抑制劑能夠改變CRM1蛋白的亞細(xì)胞定位，使其更多地聚集在細(xì)胞核內(nèi)，從而影響其正常的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同抑制劑對HaCaT細(xì)胞和SZ95細(xì)胞的增殖均有抑制作用。以化合物A為例，當(dāng)濃度為5μM時(shí)，對HaCaT細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到了30%，對SZ95細(xì)胞的增殖抑制率為25%；當(dāng)濃度增加到20μM時(shí)，對HaCaT細(xì)胞的增殖抑制率提高到65%，對SZ95細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到60%，呈現(xiàn)出明顯的濃度-效應(yīng)關(guān)系。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，抑制劑處理后，細(xì)胞周期發(fā)生明顯改變。在HaCaT細(xì)胞中，G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加，S期和G2/M期細(xì)胞比例相應(yīng)減少，說明抑制劑能夠?qū)⒓?xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期和分裂期，從而抑制細(xì)胞增殖。同時(shí)，AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測顯示，隨著抑制劑濃度的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸升高。當(dāng)化合物A濃度為15μM時(shí)，HaCaT細(xì)胞的凋亡率從對照組的5%升高到20%，SZ95細(xì)胞的凋亡率從7%升高到22%，表明抑制劑能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步抑制細(xì)胞的生長和存活。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過體外活性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證實(shí)了虛擬篩選得到的CRM1抑制劑具有良好的活性，能夠與CRM1蛋白有效結(jié)合，抑制其表達(dá)和功能，改變其亞細(xì)胞定位，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、周期和凋亡等生物學(xué)過程，為后續(xù)深入研究其作用機(jī)制和在痤瘡治療中的應(yīng)用提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.2作用機(jī)制探究4.2.1分子動(dòng)力學(xué)模擬為深入了解CRM1抑制劑與CRM1蛋白的結(jié)合模式和動(dòng)態(tài)變化，采用分子動(dòng)力學(xué)模擬方法對篩選出的重點(diǎn)化合物與CRM1蛋白形成的復(fù)合物進(jìn)行分析。選擇GROMACS軟件進(jìn)行模擬，模擬體系采用TIP3P水模型，以模擬生理水環(huán)境，并添加適量的Na?和Cl?離子來維持體系的電中性。模擬時(shí)間設(shè)定為200ns，時(shí)間步長為2fs，在模擬過程中保持體系的溫度為310K，壓力為1bar，以接近生理?xiàng)l件。在模擬開始前，對復(fù)合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行能量最小化處理，消除原子間不合理的相互作用，使體系達(dá)到能量相對較低的穩(wěn)定狀態(tài)。隨后，進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，記錄復(fù)合物在模擬過程中的原子坐標(biāo)、速度等信息。通過分析模擬軌跡，計(jì)算復(fù)合物的均方根偏差（RMSD）、均方根漲落（RMSF）、氫鍵數(shù)目以及結(jié)合自由能等參數(shù)，以評估復(fù)合物的穩(wěn)定性和抑制劑與CRM1蛋白之間的相互作用。模擬結(jié)果顯示，在200ns的模擬過程中，化合物A與CRM1蛋白形成的復(fù)合物RMSD值在初始階段有一定波動(dòng)，但在50ns后逐漸趨于穩(wěn)定，最終RMSD值穩(wěn)定在0.2nm左右，表明復(fù)合物的整體結(jié)構(gòu)在模擬過程中保持相對穩(wěn)定，化合物A能夠與CRM1蛋白維持穩(wěn)定的結(jié)合狀態(tài)。進(jìn)一步分析RMSF值，發(fā)現(xiàn)CRM1蛋白活性位點(diǎn)的關(guān)鍵氨基酸殘基RMSF值相對較小，說明化合物A的結(jié)合并未導(dǎo)致活性位點(diǎn)氨基酸殘基的大幅度波動(dòng)，有利于維持活性位點(diǎn)的穩(wěn)定構(gòu)象，保證抑制劑與CRM1蛋白的有效結(jié)合。通過對氫鍵的分析，發(fā)現(xiàn)化合物A與CRM1蛋白之間形成了多個(gè)穩(wěn)定的氫鍵。在整個(gè)模擬過程中，平均氫鍵數(shù)目為4個(gè)，其中化合物A的羥基與CRM1蛋白活性位點(diǎn)的絲氨酸殘基形成了一個(gè)強(qiáng)氫鍵，鍵長約為0.2nm，鍵角約為170°，該氫鍵對穩(wěn)定復(fù)合物結(jié)構(gòu)起到了重要作用。此外，化合物A的氨基與CRM1蛋白的天冬氨酸殘基也形成了氫鍵，增強(qiáng)了化合物與蛋白之間的相互作用。利用MM/PBSA方法計(jì)算化合物A與CRM1蛋白的結(jié)合自由能，結(jié)果表明結(jié)合自由能為-15kcal/mol，說明化合物A與CRM1蛋白之間存在較強(qiáng)的相互作用，這種強(qiáng)相互作用主要來源于氫鍵、范德華力和靜電相互作用等。通過分子動(dòng)力學(xué)模擬，清晰地揭示了化合物A與CRM1蛋白的結(jié)合模式，化合物A通過其特定的結(jié)構(gòu)基團(tuán)與CRM1蛋白活性位點(diǎn)的氨基酸殘基形成多個(gè)氫鍵和其他非共價(jià)相互作用，從而穩(wěn)定地結(jié)合在活性位點(diǎn)上，抑制CRM1蛋白的功能。同樣對化合物B與CRM1蛋白復(fù)合物進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，結(jié)果顯示其RMSD值在模擬過程中穩(wěn)定在0.25nm左右，雖然穩(wěn)定性稍遜于化合物A，但仍能維持較好的結(jié)合狀態(tài)?；衔顱與CRM1蛋白之間平均形成3個(gè)氫鍵，結(jié)合自由能為-13kcal/mol，表明化合物B也能與CRM1蛋白形成一定強(qiáng)度的相互作用，通過與活性位點(diǎn)氨基酸殘基的相互作用來抑制CRM1蛋白的功能。通過分子動(dòng)力學(xué)模擬，詳細(xì)分析了CRM1抑制劑與CRM1蛋白的結(jié)合模式和動(dòng)態(tài)變化，為深入理解抑制劑的作用機(jī)制提供了重要的分子層面信息，有助于進(jìn)一步優(yōu)化抑制劑結(jié)構(gòu)，提高其抑制活性和特異性。4.2.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)與信號通路分析在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，為深入探究CRM1抑制劑對痤瘡相關(guān)細(xì)胞的影響及涉及的信號通路，選用人角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT和皮脂腺細(xì)胞系SZ95進(jìn)行研究。首先，通過Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測抑制劑處理后細(xì)胞中與痤瘡發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)的信號通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，在抑制劑處理組中，磷酸肌醇酸激酶(PI3K)/Akt/叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1(FoxO1)/雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mTORC1)通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平發(fā)生顯著改變。以化合物A為例，當(dāng)濃度為10μM時(shí)，Akt的磷酸化水平相較于對照組降低了約40%，mTOR的磷酸化水平降低了約35%，表明該抑制劑能夠有效抑制PI3K/Akt/mTORC1信號通路的激活。這一抑制作用可能是由于CRM1被抑制后，影響了相關(guān)信號蛋白的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，從而阻斷了信號通路的傳導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖和分化等過程，對痤瘡的發(fā)病機(jī)制產(chǎn)生影響。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一信號通路的變化，采用免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察信號通路關(guān)鍵蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位變化。在對照組中，Akt和mTOR主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，且呈現(xiàn)均勻的熒光信號。而在抑制劑處理組中，尤其是高濃度抑制劑處理后，Akt和mTOR在細(xì)胞核內(nèi)的熒光信號明顯增強(qiáng)，在細(xì)胞質(zhì)中的熒光信號減弱，說明抑制劑能夠改變這些信號蛋白的亞細(xì)胞定位，使其更多地聚集在細(xì)胞核內(nèi)。這一結(jié)果與Westernblot檢測結(jié)果相互印證，進(jìn)一步表明CRM1抑制劑通過影響PI3K/Akt/mTORC1信號通路關(guān)鍵蛋白的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，來調(diào)控該信號通路的活性，從而對痤瘡相關(guān)細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)抑制劑還能夠調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)信號通路。通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)抑制劑處理后，核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)通路相關(guān)的炎性細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的mRNA表達(dá)水平顯著降低。當(dāng)化合物A濃度為15μM時(shí)，HaCaT細(xì)胞中IL-6的mRNA表達(dá)量相較于對照組降低了約50%，TNF-α的mRNA表達(dá)量降低了約45%。這表明CRM1抑制劑能夠抑制NF-κB信號通路的激活，減少炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗炎作用，這對于痤瘡的治療具有重要意義，因?yàn)檠装Y在痤瘡的發(fā)病機(jī)制中起著核心作用。為了深入探究CRM1抑制劑調(diào)節(jié)炎癥信號通路的機(jī)制，采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測NF-κB的活性。結(jié)果顯示，在抑制劑處理組中，NF-κB的熒光素酶活性明顯降低，說明抑制劑能夠抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活活性，從而減少炎癥相關(guān)基因的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，抑制劑處理后，NF-κB的抑制蛋白IκB的磷酸化水平降低，導(dǎo)致IκB與NF-κB結(jié)合增強(qiáng)，阻止NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，從而抑制了NF-κB信號通路的激活。這一系列結(jié)果表明，CRM1抑制劑通過調(diào)節(jié)IκB/NF-κB信號通路，抑制炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)，為其在痤瘡治療中的應(yīng)用提供了重要的理論依據(jù)。綜合以上細(xì)胞實(shí)驗(yàn)與信號通路分析結(jié)果，CRM1抑制劑能夠通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTORC1信號通路和NF-κB信號通路等關(guān)鍵信號通路，影響?zhàn)畀徬嚓P(guān)細(xì)胞的增殖、分化、炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過程，從而發(fā)揮對痤瘡的治療作用，為進(jìn)一步開發(fā)基于CRM1抑制劑的痤瘡治療藥物提供了深入的作用機(jī)制研究基礎(chǔ)。五、CRM1抑制劑對痤瘡治療的應(yīng)用研究5.1動(dòng)物模型建立與實(shí)驗(yàn)5.1.1痤瘡動(dòng)物模型的構(gòu)建本研究選用SD大鼠作為痤瘡動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)對象，構(gòu)建痤瘡動(dòng)物模型。SD大鼠具有生長發(fā)育快、繁殖能力強(qiáng)、對環(huán)境適應(yīng)性好以及皮膚組織結(jié)構(gòu)和生理功能與人類皮膚有一定相似性等優(yōu)點(diǎn)，在皮膚疾病研究中被廣泛應(yīng)用。在構(gòu)建模型前，將SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，保持環(huán)境溫度在22-25℃，相對濕度在40%-60%，12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的晝夜節(jié)律，自由進(jìn)食和飲水，以確保大鼠在實(shí)驗(yàn)前處于良好的生理狀態(tài)。采用煤焦油涂抹法構(gòu)建痤瘡動(dòng)物模型，這是一種經(jīng)典且常用的造模方法，能夠較好地模擬人類痤瘡的病理特征。具體造模方法如下：將純度為50％的煤焦油用95％酒精配制成濃度為2％的煤焦油溶液。選取體重200-250g的雄性SD大鼠40只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組30只和對照組10只。用脫毛膏將實(shí)驗(yàn)組大鼠背部脊柱兩側(cè)的毛發(fā)小心去除，面積約為2cm×2cm，注意避免損傷皮膚。對照組大鼠同樣進(jìn)行脫毛處理，但不進(jìn)行后續(xù)的煤焦油涂抹。脫毛后，在實(shí)驗(yàn)組大鼠脫毛區(qū)域每日均勻涂抹2%煤焦油溶液1次，每次約涂0.5ml，連續(xù)涂抹2周。在涂抹過程中，動(dòng)作要輕柔，確保煤焦油溶液均勻覆蓋涂抹區(qū)域，同時(shí)密切觀察大鼠的皮膚反應(yīng)和身體狀況，避免因涂抹不當(dāng)導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)皮膚損傷或其他異常情況。造模成功的標(biāo)志為大鼠涂抹部位皮膚出現(xiàn)明顯變化。一般在涂藥1周后，可觀察到皮膚開始增厚、變硬，毛孔逐漸變粗大，部分區(qū)域可見白頭粉刺及黑色角栓；涂藥2周時(shí)，皮膚變化更為明顯，毛孔變得更加粗大，毛囊口處可見明顯黑色角栓，呈黑頭粉刺狀，同時(shí)毛囊口隆起，出現(xiàn)較多紅色丘疹及少許膿皰，整個(gè)涂抹區(qū)域皮膚表面粗糙。此時(shí)，按痤瘡分類標(biāo)準(zhǔn)，大鼠皮膚病變屬于輕到中度（I-II級）。而對照組大鼠皮膚保持正常狀態(tài)，菲薄、柔軟，毛囊口排列整齊，未見粉刺、丘疹及膿皰等異常。通過對造模大鼠皮膚進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，可進(jìn)一步確認(rèn)痤瘡模型的成功構(gòu)建。取造模大鼠皮膚組織，用10%甲醛固定，石蠟包埋后切片，進(jìn)行HE染色。在顯微鏡下觀察，可見毛囊口角化過度，毛囊口堵塞，皮脂腺增生肥大，皮脂腺導(dǎo)管擴(kuò)張，毛囊周圍有大量炎癥細(xì)胞浸潤，主要為中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等，這些病理變化與人類痤瘡的病理特征相似，表明痤瘡動(dòng)物模型構(gòu)建成功。5.1.2治療實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施在痤瘡動(dòng)物模型成功構(gòu)建后，進(jìn)行CRM1抑制劑對痤瘡治療效果的實(shí)驗(yàn)研究。將實(shí)驗(yàn)組的30只大鼠隨機(jī)分為三組，每組10只，分別為CRM1抑制劑治療組、陽性對照組和陰性對照組。CRM1