第57講基因工程的基本工具與操作程序

【課標(biāo)要求】1.概述基因工程是在遺傳學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科基礎(chǔ)上發(fā)展而來

的；2.闡明重組DNA技術(shù)的實(shí)現(xiàn)需要利用限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具；3.闡

明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞和目

的基因及其表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)鑒定等步驟。

考點(diǎn)1基因工程的基本工具

考點(diǎn)透析

知識(shí)1基因工程概述

基因工程又叫作重組DNA技術(shù)。

項(xiàng)目?jī)?nèi)容

主要技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)

操作環(huán)境—

操作水平—

理論依據(jù)基因重組

供體提供_________

受體復(fù)制或表達(dá)目的基因

基本過程切割f改造和拼接一導(dǎo)入f表達(dá)

克服______________的障礙，

優(yōu)點(diǎn)

定向改造生物的________________

知識(shí)2基因工程的基本工具

1.限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)

圖中可見，限制酶在識(shí)別序列中心軸線兩側(cè)切開產(chǎn)生的是,在識(shí)別序列中心軸線處切開產(chǎn)

生的是o

2.DNA連接酶

(1)作用：在兩個(gè)核甘酸之間形成以連接兩個(gè)DNA片段。

(2)主要類型：①E.co〃DNA連接酶：從中分離；②____________：從T4噬菌體中分離。兩

者都能連接和平末端，但前者連接具有平末端的DNA片段的效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于后者。

歸納總結(jié)

與DNA有關(guān)的酹

酶作用作用相關(guān)“鍵”

切割DNA片段，產(chǎn)生兩個(gè)（具有相同熟

限制酶破壞磷酸二酯鍵

性末端或平末端）DNA片段

DNA催化兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯

形成磷酸二酯鍵

連接酶鍵，從而連接起來

將雙桂DNA分子局部解旋為單鏈（ATP

解旋酶破壞氫鍵（氫鍵非化學(xué)鍵）

水解供能）

DNA把游離的脫氧核甘酸連接到引物或者已

形成磷酸二酯鍵

聚合胸有的DNA單鏈的3'端上

DNA

將DNA水解為脫氧核甘酸破壞磷酸二酯鍵

（水解）酶

逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成cDNA形成磷酸二酯鍵

3.載體

（1）作用：將基因送入細(xì)胞。

（2）種類：質(zhì)粒、、匆植物病毒等。

（3）重要的載體之一——質(zhì)粒

①質(zhì)粒的本質(zhì)：是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，獨(dú)立于真核細(xì)胞的細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并

具有自我復(fù)制能力的。

②質(zhì)粒適于作基因載體的特點(diǎn)（載體須具備的條件）

特點(diǎn)（條件）作用

有一個(gè)至多個(gè)_____________供外源DNA片段插入其中

能在細(xì)胞中進(jìn)行___________，或整合到受體DNA

便于目的DNA在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在

上，隨受體細(xì)胞DNA同步復(fù)制

帶有____________（常是人工改造后具有），一般為抗便于重組DNA分子的篩選（鑒定目的基因是否導(dǎo)入

生素抗性基因或熒光基因等成功）

深度指津

最常見的標(biāo)記基因——抗生素抗性基因

忖的基因要轉(zhuǎn)入的受體細(xì)胞沒有抵抗相關(guān)抗生素的能力。當(dāng)含有抗生素抗性基因的載體注入受體細(xì)胞

后，抗性基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，使受體細(xì)胞能夠抵抗相應(yīng)抗生素，所以在受體細(xì)胞的培養(yǎng)體系中加入該

種抗生素就可以只保留轉(zhuǎn)入載體的受體細(xì)胞，原理如下圖所示（以氨節(jié)青霉素抗性基因?yàn)槔?/p>

思辨小練

I.判斷下列說法的正誤：

（1）目前使用的限制酶都是從原核生物中得到的。（）

（2）質(zhì)粒是存在于細(xì)菌細(xì)胞中的一種細(xì)胞器。（）

⑶重組DNA技術(shù)所用的工具酶包括限制酶、DNA連接酶和載體。()

(4)不同的限制酶切割DNA,可.能得到相同的黏性末端。()

(5)用DNA連接酶可連接兩種來源不同的DNA。()

(6)用同一種限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，是為了獲得相同的黏性末端，以便連接。()

(7)限制酶的識(shí)別序列都由6個(gè)核甘酸組成。()

2.限制能在原核生物中的作用是什么？它會(huì)不會(huì)切割自己的DNA分子？請(qǐng)解釋。

典--[-11說法

考向1基因工程中工具酶的選擇和利用

例1(2023?重慶卷)某小組通過PCR(假設(shè)引物長(zhǎng)度為8個(gè)堿基，短于實(shí)際長(zhǎng)度)獲得了含有目的基因

的DNA片段，并用限制酶進(jìn)行酶切(下圖)，再用所得片段成功構(gòu)建了基因表達(dá)載體。下列敘述錯(cuò)誤的是()

A.其中一個(gè)引物序列為5'-TGCGCAGT-3/

B.步驟①所用的酶是SpeI和小I

C.用步驟①的能對(duì)載體進(jìn)行酶切，至少獲得了2個(gè)片段

D.酶切片段和載體連接時(shí)，可使用E.co〃DNA連接酶或T4DNA連接酶

變式下表中列出了幾種限制酶識(shí)別序列及其切割位點(diǎn)，圖1、圖2中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)。

請(qǐng)回答下列問題:

限制酶BamWIHindIIIEcoRISmaI

識(shí)別序1I11

GGATCCAAGCTTGAATTCCCCGGG

列及切

CCTAqGTTCGA1ACTTAAGGGGCCC

割位點(diǎn)

EcoRl日的基因EcoR\

III外海

—DNA

BamWISmaTHindIII

圖1圖2

(l)i個(gè)圖1所示的質(zhì)粒分子經(jīng)S/MI切割前后，分別含有個(gè)游離的磷酸基團(tuán)。

(2)若對(duì)圖中質(zhì)粒進(jìn)行改造，插入的S〃心I酹切位點(diǎn)越多，質(zhì)粒的熱穩(wěn)定性越高。

(3)用圖中的質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒，不能使用SmuI切割，原因是。

(4)與只使用EcoRI相比較,使用4mHI和Hi/idin兩種限制酶同時(shí)處理質(zhì)粒、外源DNA的優(yōu)點(diǎn)在

于可以防止。

1.目的基因的篩選與獲取

2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建(核心工作)

⑴過程

(2)基因表達(dá)載體的組成

深度指津

復(fù)制原點(diǎn)會(huì)啟動(dòng)子W起始密碼子，終止子W終止密碼子

(I)啟動(dòng)子：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的，基本組成單位是脫氧核甘酸，其位于基因的上游，

緊挨轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)，其自身不轉(zhuǎn)錄。終止子：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的下游。一

個(gè)DNA上有多個(gè)啟動(dòng)子。啟動(dòng)子靠近模板鏈的3'端。

(2)起始密碼子和終止密碼子位于上，分別控制翻譯過程的啟動(dòng)和終止。起始密碼子靠近

mRNA的5'端。

(3)復(fù)制原點(diǎn)是DNA上的一-段序列，富含A—T,是DNA復(fù)制開始的地方，一個(gè)DNA有一個(gè)或多個(gè)

復(fù)制原點(diǎn)。

3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

受體細(xì)胞常用方法操作過程

方法一：用微量注射器將含目的基因的

DNA溶液直接注入子房；

_____________(我國(guó)獨(dú)創(chuàng))方法二：將DNA溶液滴加在授粉后一定

時(shí)間內(nèi)的花柱切面上，使目的基因借助花

植物細(xì)胞(常用體細(xì)胞或受精卵)

粉管通道進(jìn)入胚囊

將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上一

—農(nóng)桿菌f感染植物細(xì)胞fT—DNA整合

到受體細(xì)胞染色體的DNA上一表達(dá)

將含有目的基因的表達(dá)載體提純~取卵

動(dòng)物細(xì)胞(常用受精卵)—(受精卵)一顯微注射一受精卵發(fā)育一獲得

具有新性狀的動(dòng)物

Ca?'處埋細(xì)胞一感受態(tài)細(xì)胞一重組表達(dá)

__________(感受態(tài)

微生物細(xì)胞載體DNA分子與感受態(tài)細(xì)胞混合一感受

細(xì)胞法)

態(tài)細(xì)胞吸收周圍環(huán)境中的DNA分子

解疑釋惑

(1)目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程，稱為。實(shí)質(zhì)是目的基

因整合到受體細(xì)胞染色體基因組中。

(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法原理：農(nóng)桿菌易感染植物細(xì)胞，并將其Ti質(zhì)粒上的轉(zhuǎn)移并整合到受體細(xì)

胞染色體DNA上。

4.目的基因的檢測(cè)與鑒定

(1)通過等技術(shù)檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入或是否轉(zhuǎn)錄出mRNA。

(2)利用技術(shù)檢測(cè)目的基因是否翻譯。

(3)進(jìn)行個(gè)體生物學(xué)水平的抗蟲、抗病、功能活性等鑒定。

注：若用報(bào)告基因，如綠色莢光蛋白基因與目的基因構(gòu)建融合基因，可根據(jù)熒光情況進(jìn)行定性、定量

和定位的研究分析。

知識(shí)2PCR技術(shù)

1.原理：和DNA的熱變性。

2.特點(diǎn)：可在短時(shí)間內(nèi)目的基因。

3.PCR反應(yīng)所需的條件及作用

條件作用

有一段已知目的基因的核苜酸序列便于合成__________

在一定的____________中進(jìn)行提供相對(duì)穩(wěn)定的pH環(huán)境

4種脫氧核甘酸(實(shí)際上用脫氧核苛三瞬酸，即dNTP)作為合成DNA子鏈的_______,同時(shí)提供_________

DNA母鏈作為DNA復(fù)制的模板

_________的DNA聚合酶(hqDNA聚合酶)催化合成DNA子鏈

引物(是一小段___________,作為DNA復(fù)制的起始使DNA聚合酶能夠從引物的__________端開始連接

序列，它能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì))脫氧核甘酸

4.過程及圖解

循環(huán)重復(fù)上述過程，〃次循環(huán)后，目的基因的量將被擴(kuò)增倍。

思辨小練

I.判斷下列說法的正誤：

(I)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)，兩種引物的堿基序列應(yīng)互補(bǔ)。()

(2)體內(nèi)DNA復(fù)制和PCR技術(shù)都需要解旋酶打開DNA雙螺旋。()

(3)體內(nèi)DNA復(fù)制和PCR過程中，都是一條鏈連續(xù)復(fù)制(前導(dǎo)鏈)，一條鏈不連續(xù)(后隨鏈)。()

(4)構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，須將目的基因插入啟動(dòng)子與終止子之間。()

(5)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法常川的受體細(xì)胞是花粉細(xì)胞。()

(6)目的基因必須整合到受體細(xì)胞的DNA中才能復(fù)制。()

(7)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法實(shí)質(zhì)是將Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞的染色體上。()

2.要合成有生物活性的胰島素，為什么受體細(xì)胞最好用單細(xì)胞真核生物？

3.自然界中生物的DNA復(fù)制和人工合成中的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)之所以需要引物，是因?yàn)樵贒NA

合成時(shí)DNA聚合酶只能來合成子鏈(延伸方向是5'7)。

典題說法

考向1基因表達(dá)載體的構(gòu)建

例1（2023?湖北卷）用氨羊青霉素抗性基因（4叩，、四環(huán)素抗性基因（嶷產(chǎn)）作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如

圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達(dá)載體（重組質(zhì)粒），并轉(zhuǎn)

化到受體菌中。下列敘述錯(cuò)誤的是（）

A.若用“加din酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同

B.若用戶的切，在含Tet（四環(huán)素）培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因

C.若用酶切，可通過DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否

D.若用S/力I酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp（氨茉青霉素）和Tct的培養(yǎng)基中能形成菌落

變式我國(guó)科研人員將寒帶地區(qū)海也中的抗凍基因轉(zhuǎn)入千禧果（番茄品種）細(xì)胞中，成功培育出抗凍千禧

果，下圖為培育過程使用的Ti質(zhì)粒示意圖，%，?區(qū)的基因活化能促進(jìn)T-DNA的加工和轉(zhuǎn)移。下列敘述錯(cuò)

誤的是（）

A.選擇圖示Ti質(zhì)粒構(gòu)建基因表達(dá)載體，應(yīng)選擇限制酶HI

B.利用PCR從海魚基因組中擴(kuò)增抗凍基因需要添加一對(duì)特異性引物

C.用含卡那霉素的選擇培養(yǎng)基篩選成功導(dǎo)入抗凍基因的受體細(xì)胞

D.可用抗原一抗體雜交技術(shù)檢測(cè)抗凍基因在轉(zhuǎn)基因千禧果中的表達(dá)量

考向2基因工程的操作過程

例2（2024?淮安調(diào)研）乙烯具有促進(jìn)果實(shí)成熟的作用，ACC氧化酶和ACC合成酶是番茄細(xì)胞合成乙

烯的兩個(gè)關(guān)鍵酶。利用反義DNA技術(shù)（原理見圖1）,可以抑制這兩個(gè)基因的表達(dá)，從而使番茄具有耐儲(chǔ)存、

宜運(yùn)輸?shù)膬?yōu)點(diǎn)，圖2為融合ACC氧化酶基因和ACC合成隨基因的反義表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)示意圖。

細(xì)胞原有基因

（靶基因）

DNAII-

靶mRNAU?----------?「守割第?

反義RNA”jiX的蛋日產(chǎn)物

反義基因糖體結(jié)合或被RNA酶降解

圖1反義基因技術(shù)示意圖

（I）從番茄體內(nèi)提取RNA作為模板，通過______________合成ACC氧化酹和ACC合成酹基因，合成

的基因中（填“含”或“不含”）啟動(dòng)子區(qū)域。

（2）該技術(shù)首先需要合成ACC氧化酶和ACC合成酶的融合基因，通過PCR合成出的ACC氧化酶基因

兩端分別含限制酶IkunHI和XbciI的酶切位點(diǎn)，ACC合成酶基因兩端含SacI和XbaI的酣切位點(diǎn)，用

限制酶對(duì)上述兩個(gè)基因進(jìn)行酶切，再用DNA連接酶處理形成融合基因，相應(yīng)的表達(dá)載體應(yīng)用

限制酶進(jìn)行切割，確保融合基因能夠插入載體中。

（3）圖2中的啟動(dòng)子2Ali為特異性啟動(dòng)子，為了達(dá)到目的，啟動(dòng)子2Ali應(yīng)在番茄的果實(shí)（器官）中特異

性啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。將融合基因________（填“正向”或“反向”）插入啟動(dòng)子下游即可構(gòu)成反義融合基因。

將弱中表達(dá)載體與農(nóng)桿菌菌液混合后，接種在含有的培養(yǎng)基中，可篩選出含有反義融合基因的

農(nóng)桿菌，再利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得轉(zhuǎn)基因番茄。2A11啟動(dòng)子和反義融合基因都應(yīng)該位于T—DNA片段內(nèi),

原因是

2繆

反義融

卡那霉合基因

索抗性

基因

原點(diǎn)

兔制

載體

表達(dá)

基因

反義

圖2

ACC

記的

性標(biāo)

放射

”）用

“不能

能”或

（填“

，

基因時(shí)

義融合

存在反

中是否

茄細(xì)胞

檢測(cè)番

（4）在

。

是

由

理

檢測(cè)，

針進(jìn)行

段做探

基因片

氧化酶

果：

實(shí)驗(yàn)結(jié)

并預(yù)測(cè)

驗(yàn)方案

設(shè)計(jì)實(shí)

功，請(qǐng)

是否成

轉(zhuǎn)基因

平鑒定

個(gè)體水

嘗試從

究人員

（5）研

練

配套精

序

操作程

工具與

的基本

因工程

講基

第57

題

選擇

單項(xiàng)

一、

）

的是（

，正確

的敘述