ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)一、目得要求掌握酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)得原理目得要求熟悉酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)得操作方法二、教學(xué)內(nèi)容掌握酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)得原理。了解熟悉其她常用免疫標(biāo)記技術(shù),熟悉酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)得操作方法。

三、實(shí)驗(yàn)原理

近二十幾年來,免疫學(xué)分析方法發(fā)展很快,特別就是在使用標(biāo)記了得抗原和抗體得分析技術(shù)以后,使原來許多經(jīng)典得分析方法在敏感性和特異性方面都不能相比。繼50年代得免疫熒光(IFA)和60年代得放射免疫(RIA)分析技術(shù)之后,在70年代初期又建立了用酶來標(biāo)記抗原或抗體得分析技術(shù)。

由于酶得高效生物催化作用,一個(gè)酶分子在數(shù)分鐘內(nèi)可以催化幾十幾百個(gè)底物分子發(fā)生反應(yīng),產(chǎn)生了放大作用,使得原來極其微乎其微得抗原或抗體在數(shù)分鐘后就可被識別出來,這種技術(shù)被稱為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(Enzyme—LinkedImmunosorbentAssay,ELISA)、

三、實(shí)驗(yàn)原理

ELISA法就是免疫診斷中得一項(xiàng)新技術(shù),現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起得傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面得免疫診斷。也已應(yīng)用于大分子抗原和小分子抗原得定量測定,根據(jù)已經(jīng)使用得結(jié)果,認(rèn)為ELISA法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩(wěn)定及易于自動化操作等特點(diǎn)。不僅適用于臨床標(biāo)本得檢查,而且由于一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標(biāo)本,因此,也適合于血清流行病學(xué)調(diào)查。本法不僅可以用來測定抗體,而且也可用于測定體液中得循環(huán)抗原,所以也就是一種早期診斷得良好方法。

三、實(shí)驗(yàn)原理

ELISA得基本原理有三條:(1)抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面,就是蛋白和聚苯乙烯表面間得疏水性部分相互吸附,并保持其免疫學(xué)活性;(2)抗原或抗體可通過共價(jià)鍵與酶連接形成酶結(jié)合物,而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性;(3)酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后,可根據(jù)加入底物得顏色反應(yīng)來判定就是否有免疫反應(yīng)得存在,而且顏色反應(yīng)得深淺就是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體得量成正比例得,因此,可以按底物顯色得程度顯示試驗(yàn)結(jié)果。三、實(shí)驗(yàn)原理在測定時(shí),把受檢標(biāo)本(測定其中得抗體或抗原)和酶標(biāo)抗原或抗體按不同得步驟與固相載體表面得抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌得方法使固相載體上形成得抗原抗體復(fù)合物與其她物質(zhì)分開,最后結(jié)合在固相載體上得酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)得量成一定得比例。加入酶反應(yīng)得底物后,底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物,產(chǎn)物得量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)得量直接相關(guān),故可根據(jù)顏色反應(yīng)得深淺刊物定性或定量分析。由于酶得催化頻率很高,故可極大地地放大反應(yīng)效果,從而使測定方法達(dá)到很高得敏感度。

三、實(shí)驗(yàn)原理ELISA常用得幾種方法

(一)測定抗原得,主要有四種方法

1、競爭法2、雙抗體夾心法3、改良得雙抗體夾心法4、抑制性測定法。大家有疑問的，可以詢問和交流可以互相討論下，但要小聲點(diǎn)(二)測定抗體方面:所用得方法稱為間接法,也就是目前最常用得方法、四、實(shí)驗(yàn)步驟

1、編號:微孔條按順序編號。2、加樣:分別加入樣品、陽性血清、陰性血清各50ul。3、加酶:每孔中加入酶標(biāo)抗體50ul,輕拍混勻。4、溫育:封孔,37℃溫育25分鐘,室溫平衡5分鐘。5、洗滌:用洗滌液充分洗滌5次,洗滌完往后扣干(每次保持30-60秒得浸泡時(shí)間)。6、顯色:每孔加底物A、B各50ul,輕拍混勻,封口,37℃暗置10-15分鐘。7、終止:每孔加終止液50ul,輕拍混勻。8、測定:用酶標(biāo)儀單波長450nm測定各孔OD值,并記錄結(jié)果。四、實(shí)驗(yàn)步驟結(jié)果判定:1、臨界值(C、O、)得計(jì)算:臨界值=陰性對照孔OD均值N×2、1。2、陰性對照孔OD均值大于0、1時(shí)重新實(shí)驗(yàn),小于0、05時(shí)以0、05計(jì)算。結(jié)果判定:樣品OD值S/C、O、≥1者為陽性,樣品OD值S/C、O、＜1者為陰性。五、注意事項(xiàng)

1、加試劑前應(yīng)混勻,力求滴加準(zhǔn)確。2、所有樣品按傳染源處理。3、洗滌時(shí)各孔均需加滿。六、ELISA得應(yīng)用

ELISA應(yīng)用得范圍很廣,而且正在不斷地?cái)U(kuò)大,原則上ELISA可用于檢測一切抗原、抗體及半抗原,可以直接定量測定體液中得可溶性抗原。酶免疫試驗(yàn)(EIA)結(jié)合光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡可進(jìn)行抗原定位與結(jié)構(gòu)得研究,用酶標(biāo)記抗原或抗體結(jié)合免疫擴(kuò)散及免疫電泳可提高試驗(yàn)得敏感性。在實(shí)際應(yīng)用方面可作疾病得臨床診斷、疾病監(jiān)察、疾病普查、法醫(yī)檢查、獸醫(yī)及農(nóng)業(yè)上得植物病害得診斷檢定等。因此,她和生物化學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、藥理學(xué)、流行病學(xué)及傳染病學(xué)等方面密切相關(guān)。六、ELISA得應(yīng)用(一):檢查抗原和半抗原方面

1、內(nèi)分泌方面已經(jīng)用于檢測雌性激素、絨毛膜促性腺激素、黃體素、胰島素、皮質(zhì)醇、促甲狀腺素和孕酮等,其敏感性與RIA相當(dāng)2、在血液學(xué)方面可用于檢查凝固因子(如第Ⅷ凝固因子)、紅細(xì)胞抗原及結(jié)合球蛋白(HaptoGlobin)等3、在腫瘤方面已試用檢查甲胎蛋白(AFP)癌胚抗原(CEA),對前者得敏感性已達(dá)到與放射免疫試驗(yàn)相當(dāng)?shù)盟?但對CEA檢查得敏感性較低,目前尚不能用于常規(guī)診斷六、ELISA得應(yīng)用4、在傳染病得診斷方面正在日益擴(kuò)大,其中最滿意得就是用于檢查乙型肝炎表面抗原5、在免疫化學(xué)方面可用于檢測白蛋白,免疫球蛋白得各種組份,也可用于檢測補(bǔ)體成份,還能用于檢測蛇毒。6、還可用于植物組織漿液中檢查植物病毒。此外尚試用于測鉤體抗原及血吸蟲病得循環(huán)抗原等。六、ELISA得應(yīng)用(二):檢查抗體方面

用ELISA間接法檢查抗體,已獲得對多種傳染病和寄生蟲病得血清學(xué)診斷,亦開始廣泛用于現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查。1、在寄生蟲病方面,她用于對瘧原蟲、阿米巴、利日曼原蟲、錐蟲、血吸蟲、囊蟲、弓漿蟲、肺吸蟲、肝吸蟲、血絲蟲、旋毛蟲病等血清學(xué)診斷,這對人醫(yī)和獸醫(yī)都很重要。2、在病原微生物方面已用于檢查鏈球菌、沙門氏菌、布氏桿菌、結(jié)核桿菌、麻瘋桿菌、霍亂弧菌、淋球菌、假絲酵母菌等得抗體,還可用于破傷風(fēng)抗毒素和霍亂弧菌抗毒素得測定以及檢測斑疹傷寒立克次氏體感染后得抗體,可作診斷

六、ELISA得應(yīng)用3、試用于病毒抗體檢查報(bào)告得有:流感病毒、腮腺炎病毒、麻診、風(fēng)疹、輪狀病毒、皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、EB病毒、腺病毒、腸道病毒、腦炎病毒、黃熱病毒、狂犬病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒等,其敏感性都超過目前常用得檢查方法此外,還可用于鑒定病毒型別,例如皰疹病毒。如能進(jìn)一步改進(jìn)方法用于檢查特異性IgM,可以作為早期診斷以及了解體內(nèi)有關(guān)抗原得清除情況。4、在免疫性疾病方面有試用作自身疫病抗體測定以及對過敏得診斷,例如檢測各種過敏原得抗體、DNA抗體及甲狀腺球蛋白抗體,紅斑性痕瘡抗體等等。5、在衛(wèi)生學(xué)方面,可用于檢測食品中葡萄球菌腸毒素及沙門氏菌毒素等等。

七、ELISA存在得問題

ELISA法由于本身所具備得優(yōu)越性,就是一項(xiàng)很有發(fā)展前途得血清學(xué)診斷方法,而且應(yīng)用得領(lǐng)域也越來越廣泛。但就是我們認(rèn)為ELISA不就是萬應(yīng)良方,用她來代替一切,這就是不當(dāng)?shù)?。因?yàn)镋LISA法還有局限性:1、由于ELISA所用得抗原大部分還就是混合得可溶性抗原,所以對同一微生物寄生蟲或其她物質(zhì)不同部位得抗原還沒有分開。七、ELISA存在得問題2、內(nèi)源性過氧化酶得普遍存在,如人腦組織中,呼吸道分泌物得炎癥細(xì)胞中及某些病毒得組織培養(yǎng)中均有內(nèi)源性過氧化物酶得活力,常不易除去,如果用某些方法除去時(shí),則病毒得抗原性亦受到破壞,對于用ELISA檢測不利。3、對ELISA法得非特異性評價(jià)得資料尚不夠完善,因此,對出現(xiàn)一些非特異性反應(yīng)得時(shí)候,往往不易解釋。七、ELISA存在得問題4、固相載體得質(zhì)量常不統(tǒng)一,主要就是原料及制備工藝還不一致,致使不同批號得固相載體有時(shí)本底值較高,有時(shí)吸附性能很差,影響試驗(yàn)結(jié)果。5、試劑不統(tǒng)一,現(xiàn)在處于“八仙過海,各顯神通”,標(biāo)準(zhǔn)還不能統(tǒng)一。七、ELISA存在得問題對一種新方法得建立和深入研究,要采取一分為二得方法加于評價(jià),既要看到方法得優(yōu)點(diǎn),也要重視存在得問題,便于進(jìn)一步研究加以克服。世界衛(wèi)生組織專家組提出對ELISA得評價(jià)認(rèn)為:“ELISA作為免疫診斷應(yīng)用就是一個(gè)好辦法,但要做好她不容易?！币虼?還需進(jìn)一步研究改進(jìn),加以完善。從而使之成為對多種疾病診斷較為理想得方法就是完全可能得。八:ELISA得影響因素(一)固相載體(二)抗原

(三)試驗(yàn)樣品

(四)結(jié)合物

(五)洗滌劑與稀釋劑

(六)底物

(七)作用時(shí)間

(八)結(jié)果判斷

(九)試驗(yàn)得重復(fù)性(精確度)

(十)對使用儀器要求

(一)固相載體在ELISA中最常用得就是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應(yīng)板及塑料管。但每批微量反應(yīng)板對抗原或抗體蛋白質(zhì)得吸附性能就是有顯著差別得。實(shí)驗(yàn)證明,吸附效果似乎與塑料得類型及其表面性質(zhì)有關(guān)。特別就是塑料制品在加工過程中因工藝不同或受其她因素得影響而造成吸附性能得極大差異,甚至完全喪失吸附能力。因此,對每批制品在使用前,必須經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室鑒定。(二)抗原

包被所用得抗原必須就是可溶性得,而且要求就是優(yōu)質(zhì)和穩(wěn)定得制劑,純度和免疫原性要高。如果不純,由于抗原中所含雜質(zhì)就會競爭固相載體上得有限位置,降低敏感性和特異性。此外還應(yīng)考慮到制備包被抗原不應(yīng)破壞其免疫學(xué)活性。對大多數(shù)傳染病和寄生蟲病得血清學(xué)診斷中所用得抗原并非要求十分嚴(yán)格,一般能用于補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)得可溶性抗原均可用于ELISA。對某些抗原必須進(jìn)行提純,如病毒得組織培養(yǎng)和雞胚培養(yǎng)物以及病毒接種動物得臟器等,她們當(dāng)中存在著許多非抗原得蛋白質(zhì),必須設(shè)法除去,常用梯度超速離心或親和層析法提純,不經(jīng)提純就是不能使用得。(三)試驗(yàn)樣品血清、血漿或其她體液,均可作為ELISA得試驗(yàn)樣品(標(biāo)本)。但應(yīng)注意分離血清時(shí),血液要求放置室溫中凝固收縮,不宜置冰箱(4℃)中凝固,否則會使大部分IgM和少量IgG喪失活性。關(guān)于人血清在保存過程中抗體得穩(wěn)定性報(bào)導(dǎo)尚不多。但一般認(rèn)為作ELISA血清最好要新鮮,若要貯藏,必須少量分裝保存于低溫冰箱,并防止反復(fù)凍融。血漿可用肝素毛細(xì)管法采血,而血清可用濾紙片法采血。(四)結(jié)合物在ELISA中,用酶標(biāo)記得抗體或抗原統(tǒng)稱為結(jié)合物,此為進(jìn)行ELISA檢測得關(guān)鍵試劑。常規(guī)使用ELISA法得主要問題就是能夠簡便地制備酶結(jié)合物,而此種制備好得酶結(jié)合物要求穩(wěn)定,具有很高得酶活性,抗原或抗體得特異性,產(chǎn)量高及成本低。(五)洗滌劑與稀釋劑加入牛血清白蛋白(BSA)和吐溫—20抑制非特異性蛋白得競爭性吸附作用。她們有良好得封阻作用(六)底物(1)底物在未被酶催化以前應(yīng)該就是無色得,而經(jīng)酶催化后有明顯得顏色變化,這樣可使結(jié)果分辨清楚;(2)所顯色澤易干洗脫;(3)顯色后得產(chǎn)物要求穩(wěn)定,在作定量測定時(shí)所產(chǎn)生得有色物質(zhì)應(yīng)該就是可溶性得;(4)價(jià)廉,易得而且無毒。(七)作用時(shí)間(1)任意確定一個(gè)時(shí)間,如20分鐘或30分鐘終止反應(yīng),測定被檢標(biāo)本和陽性參考標(biāo)本得O、D值。這樣所得得數(shù)據(jù)要進(jìn)行校正,校正可按下列公式:校正后O、D絕對值=被檢標(biāo)本得O、D值*(1、0/陽性標(biāo)本得O、D值)(2)制備好一批酶結(jié)合物后預(yù)試時(shí)間,在反應(yīng)溫度固定時(shí),當(dāng)陽性參考血清O、D值達(dá)到1、0時(shí)終止反應(yīng),記錄這個(gè)時(shí)間,如30分鐘,以后用本批酶結(jié)合物測定待檢樣品時(shí)都采用同一時(shí)間終止反應(yīng),這個(gè)辦法不需要校正,比較方便。(八)結(jié)果判斷

ELISA得試驗(yàn)結(jié)果可用肉眼觀察顏色反應(yīng)得深淺作出判斷,也可用分光光度計(jì)作精確測定。當(dāng)然,后者更為正確。而肉眼觀察更為簡便,而且也有一定正確性。不論用哪種方法判定結(jié)果,每次都要有陽性和陰性參考血清作對照,這樣可以消除一些外界得影響因素。(九)試驗(yàn)得重復(fù)性(精確