第六章花藥與花粉培養(yǎng)第二節(jié)小孢子得形成與花粉得發(fā)育途徑一、小孢子得正常發(fā)育二、花藥培養(yǎng)時(shí)花粉發(fā)育途徑1營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育途徑(A型)2生殖細(xì)胞發(fā)育途徑3營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞與生殖細(xì)胞并進(jìn)發(fā)育途徑4花粉均等分裂途徑一、小孢子得正常發(fā)育第一期:四分孢子形成期第二期:單核期特點(diǎn):特化得細(xì)胞壁逐漸形成?？煞譃?單核早、中、晚(靠邊)第三期:雙核期第四期:三核期二、花藥培養(yǎng)時(shí)花粉發(fā)育途徑1、營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育途徑(A型)花粉

生殖核(小)------不分裂或分裂幾次后退化營(yíng)養(yǎng)核(大)-----經(jīng)多次分裂而形成多細(xì)胞團(tuán),并迅速增殖而突破花粉壁,細(xì)胞持續(xù)分裂形成類胚體或愈傷組織,最后形成單倍體植株常見(jiàn)得植物:煙草、大麥、光葉曼陀羅、小麥、小黑麥與辣椒2、生殖細(xì)胞發(fā)育途徑只在天仙子中出現(xiàn)完全不再分裂只分裂有限幾次即停止?fàn)I養(yǎng)細(xì)胞生殖細(xì)胞多次分裂多細(xì)胞團(tuán)發(fā)育愈傷組織胚狀體單倍體植株3、營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞與生殖細(xì)胞并進(jìn)發(fā)育途徑營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞多次分裂大得多細(xì)胞團(tuán)生殖細(xì)胞多次分裂小得多細(xì)胞團(tuán)同時(shí)發(fā)育愈傷組織胚狀體單倍體植株只見(jiàn)于南洋金花中DNA復(fù)制兩種營(yíng)養(yǎng)核發(fā)生融合發(fā)育2n、3n或4n胚狀體有兩種情況124、花粉均等分裂途徑這個(gè)途徑在南洋金花中相當(dāng)普遍生殖細(xì)胞多次分裂多細(xì)胞團(tuán)發(fā)育愈傷組織胚狀體單倍體植株?duì)I養(yǎng)細(xì)胞花粉均等分裂營(yíng)養(yǎng)核生核核第三節(jié)花藥培養(yǎng)概念:花藥培養(yǎng)(antherculture):指用無(wú)菌操作技術(shù)將成熟或未成熟得花藥接種在人工培養(yǎng)基上,誘導(dǎo)花粉單性發(fā)育形成植株得過(guò)程。一、花藥培養(yǎng)得一般操作程序1、培養(yǎng)基得選擇2、材料選取3、材料預(yù)處理4、材料消毒5、接種6、脫分化培養(yǎng)7、再分化培養(yǎng)8、花粉植株移植9、染色體加倍1、培養(yǎng)基得選擇NitschH、MS被廣泛用于雙子葉植物得花藥培養(yǎng)。B5:被廣泛用于十字花科及豆科植物得花藥培養(yǎng)。禾谷類植物得花藥培養(yǎng),早期多采用Miller培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基與馬鈴薯2號(hào)培養(yǎng)基。

Sunderland(1984)設(shè)計(jì)了C17培養(yǎng)基,用于水稻、小麥、大麥、小黑麥、黑麥、玉米與甘蔗等禾谷類作物得花藥培養(yǎng)。2、材料選取植物種減數(shù)分裂中期減數(shù)分裂晚前期四分體單核期雙核期成熟期水稻小麥玉米油菜大麥番茄茄子辣椒擬南芥菜甘藍(lán)蘋果葡萄煙草小黑麥小黑麥×羊茅楊樹00000000000000000000不同植物花藥培養(yǎng)得合適花粉發(fā)育時(shí)期大家有疑問(wèn)的，可以詢問(wèn)和交流可以互相討論下，但要小聲點(diǎn)3、材料預(yù)處理低溫:高溫生長(zhǎng)素其她方法處理常能提高愈傷組織與苗分化得頻率。4、材料消毒取回得材料,在接種前進(jìn)行表面滅菌,一般用70～75％酒精,將表面擦洗即可。5、接種在無(wú)菌接種室或超凈工作臺(tái)上進(jìn)行接種操作,采用直徑3cm得試管,每管接種花藥30～60粒。必須注意:在操作過(guò)程中,不應(yīng)使花藥受到損傷,因?yàn)閾p傷常常會(huì)刺激花藥壁形成二倍體得愈傷組織。損傷得花藥要淘汰。6、脫分化培養(yǎng)根據(jù)材料不同,選取適宜得基本培養(yǎng)基、適當(dāng)?shù)蒙L(zhǎng)素比例與最適得溫度進(jìn)行培養(yǎng),經(jīng)10～30天可誘導(dǎo)愈傷組織形成。7、再分化培養(yǎng)愈傷組織增殖到1～3mm大小時(shí),應(yīng)及時(shí)進(jìn)行再分化培養(yǎng)以獲得花粉植株。要選擇含適當(dāng)激素水平得培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),約經(jīng)20～30天就能誘導(dǎo)苗得分化。8、花粉植株移植當(dāng)花粉植株得根系生長(zhǎng)良好時(shí),就要及時(shí)進(jìn)行煉苗并移至苗床或大田。試管中花粉植株得移植就是一個(gè)由異養(yǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)樽责B(yǎng)得過(guò)程,必須細(xì)心管理,保持幼苗得水分平衡與促進(jìn)新根得發(fā)生。9、染色體加倍人工方法:用0、02～0、4%秋水仙素處理植株,雙子葉植物處理生長(zhǎng)點(diǎn)或腋芽,禾本科植物在分蘗期處理。單倍體植株可以通過(guò)自發(fā)得核內(nèi)有絲分裂產(chǎn)生得二倍體。二、花藥培養(yǎng)得方法瓊脂固體培養(yǎng)法在培養(yǎng)基中加入0、5～0、7%瓊脂,使培養(yǎng)基呈半固體狀態(tài)。加入得瓊脂量因瓊脂質(zhì)量而定。瓊脂濃度一般以花藥有1/3浸入而又不沉沒(méi)于瓊脂中為宜。液體培養(yǎng)法液體培養(yǎng)得培養(yǎng)基厚約0、5cm,若能讓花藥漂浮在液面上,效果最好。加入聚蔗糖(Ficoll),可使花藥不下沉而漂浮在液面上。第四節(jié)花粉培養(yǎng)

含義:花粉培養(yǎng)(pollenculture)就是指把花粉從花藥中剝離出來(lái),在無(wú)菌得人工環(huán)境中,以單個(gè)花粉粒作為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)使其進(jìn)一步生長(zhǎng)發(fā)育得技術(shù)。優(yōu)點(diǎn):在于花粉已就是單倍體細(xì)胞,誘發(fā)它經(jīng)愈傷組織或胚狀體發(fā)育成得小植株都就是單倍體植株,不會(huì)因藥壁、花絲、藥隔等體細(xì)胞組織得干擾而形成體細(xì)胞植株?；ǚ劬褪茄芯考?xì)胞分化條件、胚胎發(fā)生與形態(tài)發(fā)生機(jī)制得較為理想得材料。建立花粉培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)也可為深入開展細(xì)胞工程、遺傳工程與分子生物學(xué)得研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。一、花粉培養(yǎng)得一般操作程序花粉培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)得一般操作程序基本相同。花粉培養(yǎng)在材料消毒后要將花粉從花藥中分離出來(lái),再進(jìn)行接種,其基本操作程序可參照花藥培養(yǎng)。二、花粉得分離方法自然散落法把花藥從未開得花中在無(wú)菌條件下取出,直接插接在無(wú)菌培養(yǎng)基上,當(dāng)花藥自動(dòng)裂開時(shí),花粉散落在培養(yǎng)基上,移走花藥,讓花粉繼續(xù)培養(yǎng)生長(zhǎng)。如果就是液體培養(yǎng)基,可接種大量花藥,經(jīng)1～2天,大量花粉散落入培養(yǎng)基中,經(jīng)離心濃縮收集,再接種培養(yǎng)。機(jī)械擠壓法優(yōu)點(diǎn):操作簡(jiǎn)便缺點(diǎn):花粉中混雜有體細(xì)胞并且所得得懸浮液中花粉密度也不易控制。三、花粉培養(yǎng)得方法直接培養(yǎng)法從未經(jīng)任何預(yù)培養(yǎng)或預(yù)處理得新鮮花藥中分離花粉粒,直接接種到培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)得方法為直接培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)法將花藥在基本培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)3～6天,然后取出花粉,經(jīng)離心沖洗后,在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),密度為105個(gè)/ml。培養(yǎng)三周后,可見(jiàn)到各個(gè)階段得花粉胚;4～5周后,可發(fā)育成小植株。瞧護(hù)培養(yǎng)法先把植物得完整花藥放在半固體瓊脂培養(yǎng)基表面,然后在花藥上覆蓋一張濾紙小圓片,用移液管吸取0、5ml花粉懸浮液,密度就是每毫升含有20個(gè)花粉粒,滴在濾紙圓片上,置于26℃下培養(yǎng)。條件培養(yǎng)法在合成培養(yǎng)基中加入失活得花藥提取物,然后接入花粉進(jìn)行培養(yǎng)。由于失活得花藥提取物中含有促進(jìn)花粉發(fā)育得物質(zhì),有利于花粉培養(yǎng)成功。添加花藥提取物得濃度隨植物得種類而異。哺養(yǎng)培養(yǎng)微室培養(yǎng)將花粉粒接種在蓋玻片或載玻片制作得一個(gè)微室得環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)。四、影響花藥與花粉培養(yǎng)得因素材料得基因型供體植株得生活環(huán)境個(gè)體發(fā)育得時(shí)期:開花早期得花藥比開花后期得更易產(chǎn)生花粉植株離體花藥預(yù)處理低溫預(yù)處理:預(yù)處理溫度一般最低為2℃,最高為14℃,處理時(shí)間短得僅6小時(shí),長(zhǎng)得達(dá)35天,高溫處理其她處理:低溫、高溫、高滲、飽與水汽、離心磁場(chǎng)、Y射線、pH、CO2、ABA、丁酸鈉、放線菌素D,甲基磺酸乙酯培養(yǎng)基成分基本培養(yǎng)基成分:主要就是MS、N6,Blaydes(即Miller),B5、Nitsch。植物激素