前言1.1抗生素的發(fā)展歷史及展望1.1.1抗生素發(fā)展初期顯微鏡的問世，為醫(yī)學(xué)的發(fā)展道路開拓了新的方向。自1783年Leeuwenhoek發(fā)現(xiàn)細菌伊始，隨著世界對生物學(xué)和醫(yī)學(xué)理論的逐漸認識和突破，微生物從此被人類所認識。19世紀70年代，對微生物間可能存在的拮抗作用的相關(guān)研究成為了當(dāng)時世界各國學(xué)者關(guān)注并側(cè)重開展的方向，且在1874年WilliamRoberts于《皇家學(xué)會會報》發(fā)表論文首次提出了微生物之間存在拮抗作用。直到20世紀初根據(jù)已有的大量研究結(jié)果證明，微生物之間確實存在拮抗作用，原因為微生物所產(chǎn)生的抗生素物質(zhì)作用下引起的（郝少君等，2011；周長林，2010）。1.1.2抗生素的蓬勃發(fā)展時期1929年，F(xiàn)leming所發(fā)表的青霉素提取方法，標志著人類對抗生素的研究進入了一個前所未有的時期。自此有關(guān)抗生素的研究成果層出不窮，特別是第二次世界大戰(zhàn)對于醫(yī)藥的龐大需求的背景下，使得抗生素的研究部得到了空前絕后的推動。諸如1944年Waksman等提取出了鏈霉素（SchatzAetal.，1973）、1947年Burkholder發(fā)現(xiàn)氯霉素、1952年Mcguiret等發(fā)現(xiàn)紅霉素等等。這個時期人類為了把抗生素廣泛應(yīng)用于臨床的細菌感染性疾病治療中，大規(guī)模地建立起了各種抗生素提取和生產(chǎn)的基地（郝少君等，2011）。1.1.3當(dāng)下抗生素的發(fā)展方向與細菌耐藥性隨著抗生素研究井噴式發(fā)展時期的逐漸落幕，在二十世紀中旬抗生素的研究開始進入了有明確目的和計劃的系統(tǒng)化階段。此時人類在抗生素的研究方向已不再側(cè)重于新的抗生素的發(fā)現(xiàn)，而是轉(zhuǎn)向人工抗生素的合成研究當(dāng)中。在1958年，6-氨基青霉烷酸由Sheehan成功合成，打響了進入半合成抗生素時代的第一槍。隨后如苯氧乙基青霉素、二甲氧苯青霉素和氨芐西林等半合成抗生素紛紛問世（戴紀剛等，1999）。此后隨著抗生素的研究不斷深入，抗生素已經(jīng)不僅僅局限于“抗菌”，還有抗腫瘤、抗原蟲、抗寄生蟲等用于人畜農(nóng)的抗生素。與此同時，在1955年被證實細菌可以通過突變使其能夠自我產(chǎn)生抗生素抗性（Cavalli-SforzaLLetal，1956），而在后幾十年中，隨著抗生素的泛用，細菌耐藥性問題已經(jīng)足以嚴重到能威脅人類的生存，假若當(dāng)下人類所擁有的抗生素不再對某一細菌有效，很可能意味著回到前抗生素“preantibiotic”時期的威脅（劉昌孝，2017）。目前，人類已意識到細菌耐藥問題十分嚴峻，“后抗生素時代即將來臨”這是世界衛(wèi)生組織總干事陳馮富珍所作出的預(yù)測，很可能說明當(dāng)下所擁有的抗生素不再能夠如同以往那般“所向披靡”，甚至很多普通感染性的疾病都需要聯(lián)合用藥解決。為此，世界衛(wèi)生組織呼吁各國政府以及研究人員加強對抗生素新藥的開發(fā)以能夠替代“不敏感”的就抗生素，避免抗生素對進化的耐藥性疾病失去作用。1.1.4截短側(cè)耳素衍生物研發(fā)的意義20世紀50年代，截短側(cè)耳素這種具有抗菌活性的雙萜類化合物成功地從擔(dān)子菌綱側(cè)耳屬中分離出。但由于其本身抗菌活性低、水溶性差等特性，在臨床用藥方面上比較局限（EggerHetal，1976）。截止今日，由C14側(cè)鏈改造所得成功上市的抗菌藥物已有獸用抗菌藥泰妙菌素(Tiamulin)、沃尼妙林(Valnemulin)，人皮膚外用藥瑞它妙林(Retapamulin)以及于2019年通過美國FDA審批上市，用于治療社區(qū)獲得性細菌性肺炎(CABP）的人用藥來法莫林(Lefamulin）共四款（結(jié)構(gòu)見圖1）（HUANGZetal，2020：LIBBetal，2010；JACOBSMR，2007；CHAHINEE.Betal，2020；ANDREISetal，2019）。與基于同一母核開發(fā)成功的藥物，如青霉素、頭孢菌素、沙星類抗菌藥動輒數(shù)十種相比，截短側(cè)耳素僅成功開發(fā)四種抗菌藥，也由于截短側(cè)耳素類藥物及其衍生物結(jié)構(gòu)新穎，作用機制獨特且針對截短側(cè)耳素類抗菌藥的耐藥菌尚不多見，為耐藥菌株的治療帶來了希望。圖1已上市的截短側(cè)耳素類抗生素Figure1Marketedpleuromutilinantibiotics1.2截短側(cè)耳素簡介【截短側(cè)耳素結(jié)構(gòu)式】【英文名】pleuromutilin【中文名】截短側(cè)耳素【CASNo.】125-65-5【分子式】C22H34O5【分子量】378.51【性狀】白色至類白色結(jié)晶性粉末，溶于乙醇、氯仿和丙酮等。熔點:167～168℃截短側(cè)耳素(pleuromutilin)是一種來自擔(dān)子菌屬的三環(huán)二萜類天然產(chǎn)物，作為截短側(cè)耳素衍生物合成的前體，能有效抑制革蘭陽性菌和肺炎支原體等微生物。自1951年Kavanagh分離并定性伊始，經(jīng)過二三十年間對其化學(xué)結(jié)構(gòu)、生物合成途徑以及生物活性的研究，發(fā)現(xiàn)截短側(cè)耳素具有抗革蘭氏陰性菌以及抗大部分革蘭氏陽性菌的功效（EggerHetal，1981）。1.3截短側(cè)耳素類藥物藥理學(xué)原理1974年，Hodgin和Hogenauer認為截短側(cè)耳素的作用靶點是原核生物的50S核糖體亞基的V區(qū)從而選擇性抑制蛋白質(zhì)的合成，對真核生物并無顯著影響（HodginLAetal，1974）。后經(jīng)過精密的實驗得出截短側(cè)耳素的三元母環(huán)骨架可以誘導(dǎo)契合細菌核糖體50S亞基的的肽酰轉(zhuǎn)移酶活性中心（peptidyltransferasecenter，PTC），導(dǎo)致該亞基發(fā)生重排，核糖體P位點被三環(huán)核心突出部分所覆蓋，進而蛋白質(zhì)合成受到阻礙（SCHLüNZENFetal，2004）。通過研究其構(gòu)效關(guān)系（structureactivityrelationship,SAR），截短側(cè)耳素具有抗菌活性的必備官能團有三環(huán)母核結(jié)構(gòu)、C-11位的羥基、C-14位的酯基和C-3位的羰基。其中，側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)特點能夠顯著影響該類藥物活性，F(xiàn)alcó（FalcóVetal，2020）等研究表明C14側(cè)鏈可深入核糖體亞基的P結(jié)合位點以通過三個重要的途徑抑制細菌蛋白質(zhì)的合成。首先與50S大亞基的23SrRNA相結(jié)合，封閉肽基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)合門戶，阻礙tRNA的3’末端從A位點向P位點轉(zhuǎn)移，抑制蛋白質(zhì)肽鍵的合成，使50S大亞基的形成受到抑制，進而起到殺菌作用（SaderHSetal，2012）。2以4-氨基苯硫酚為鏈接的含氮雜烷側(cè)鏈截短側(cè)耳素的設(shè)計與合成2.1實驗準備2.1.1原料與試劑截短側(cè)耳素、對甲苯磺酰氯、氯乙酰氯、N-甲基甲胺、N-甲基正丙胺、N-甲基-2-羥基乙胺、4-氨基苯硫酚、二氧化硅、二氯甲烷、乙腈、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、無水碳酸鉀、1mol/L鹽酸、無水硫酸鈉、茚三酮試劑2.1.2主要實驗儀器紫外分析儀、旋干儀、反應(yīng)瓶、旋干瓶、硅膠柱、小磁子、漏斗等2.1.3主要軟件ChemBioDrawUltra20.0、mestrenova以及Prism2.2研究內(nèi)容將對甲苯磺酰氯與原料截短側(cè)耳素縮合，以活化截短側(cè)耳素母核上14號位側(cè)鏈中的取代羥基，得中間體Ⅰ對甲苯磺?；囟虃?cè)耳素，用于下步反應(yīng)。以對甲苯磺酰化截短側(cè)耳素與4-氨基苯硫酚在加熱回流條件下反應(yīng)合成得到中間體Ⅱ粗品，用于下步反應(yīng)。硅膠柱純化后將上述中間體Ⅱ粗品經(jīng)硅膠柱純化后，得到純凈的中間體Ⅱ用于下步反應(yīng)。以苯環(huán)上含有不同取代基的苯甲酰氯與上述截短側(cè)耳素中間體Ⅱ在室溫條件下反應(yīng)得到最終的目標化合物。運用質(zhì)譜、核磁等檢測方法對得到的產(chǎn)物進行結(jié)構(gòu)表征，以確證所得截短側(cè)耳素衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。利用上述合成得到的截短側(cè)耳素衍生物進行藥敏實驗，研究以4-氨基苯硫酚為連接基團的含氮雜烷烴側(cè)鏈的截斷側(cè)耳素衍生物的設(shè)計、合成及抗菌活性評價抗菌活性的影響。2.3實驗步驟合成中間體1的一般程序：將10.0g(26.5mmol)截短側(cè)耳素溶于20mL乙腈中，并在冰浴條件下緩慢加入5.6g(29.2mmol)對甲基苯磺酰氯到上述溶液中，靜待3分鐘后緩慢滴加共12ml(1-2滴/秒)濃度為6mol/L的氫氧化鈉溶液?；旌弦涸诖帕嚢枳訑嚢枨冶l件下反應(yīng)30分鐘，撤除冰浴再反應(yīng)3小時左右，期間反應(yīng)進程的監(jiān)測使用薄層色譜法(TLC)(展開劑比例為二氯甲烷：乙酸乙酯：石油醚=1:1:2)，當(dāng)監(jiān)測到原料點淡化直到消失，代表反應(yīng)結(jié)束。使用旋干儀旋干溶劑后，將剩余反應(yīng)液倒入分液漏斗中，并加入二氯甲烷進行二次萃取，萃取完成后用適量無水硫酸鈉除水，取有機相再次旋蒸，加入乙醇進行重結(jié)晶（通過加熱讓溶劑解產(chǎn)物，再降溫析出），抽濾，烘干，即可得中間體Ⅰ對甲苯磺?；囟虃?cè)耳素。合成中間體2的一般程序：稱取9g(16.9mmol)中間體Ⅰ溶于30-50mL乙酸乙酯，將反應(yīng)瓶置于電子秤上稱量準確滴加2.33g（1.86mmol）4-氨基苯硫酚；用小燒杯稱取6.67gNaOH并溶于水中，最好呈現(xiàn)飽和溶液狀態(tài)(一般溶于溶解時可將燒杯放入冰中幫助降溫，邊攪拌邊溶解;10mL)，NaOH水溶液滴加到反應(yīng)瓶中；裝有溶液的反應(yīng)瓶放到油浴鍋中70°C回流的條件下攪拌反應(yīng)2-3h；期間反應(yīng)進程的監(jiān)測使用薄層色譜法(TLC)，展開劑石油醚:乙酸乙酯=2:1，產(chǎn)物極性變大；用旋干儀除去瓶中乙酸乙酯，將剩余反應(yīng)液倒入分液漏斗中加入二氯甲烷和飽和食鹽水萃取，使用適量100-200目硅膠吸附;過柱純化，洗脫劑為二氯甲烷:2-巰基乙醇=200:1，旋干溶劑后產(chǎn)物為白色輕質(zhì)粉末中間體Ⅱ粗品，粗品經(jīng)硅膠柱層析(二氯甲烷:甲醇=50:1)純化得到純凈的中間體Ⅱ4-氨基苯硫酚-p1。合成中間體3的一般程序：用20mL二氯甲烷將3.0g4-氨基苯硫酚-p1溶解，并在冰浴條件下緩慢加入1.7g(2eq)無水碳酸鉀到上述溶液中，隨后緩慢滴加(1-2滴/秒)0.84g(1.2eq)的氯乙酰氯?；旌弦涸诖帕嚢枳訑嚢枨冶}浴條件下反應(yīng)2小時，期間反應(yīng)進程的監(jiān)測使用薄層色譜法(TLC)(展開劑比例為乙酸乙酯：石油醚=1:1)，當(dāng)監(jiān)測到原料點淡化直到消失，代表反應(yīng)結(jié)束。加水淬滅反應(yīng)，將溶液倒入分液漏斗中并加入二氯甲烷萃取有機相，隨后加入飽和碳酸氫鈉萃有機層2-3次，萃取結(jié)束后使用適量無水硫酸鈉除水，取有機相再次旋蒸，旋干后得中間體3。合成化合物1的一般程序：使用5ml乙腈溶解0.5g中間體3，使用一次性吸管緩慢滴加0.14g（1.2eq）N-甲基甲胺（純度40%）到溶液中，再稱取0.29g(2eq)無水碳酸鉀倒入溶液中，在加熱70℃和冷凝回流的條件下用磁力攪拌子攪拌3小時，期間反應(yīng)進程的監(jiān)測使用薄層色譜法(TLC)(展開劑比例為二氯甲烷:甲醇=20:1或乙酸乙酯:石油醚=1:1)。當(dāng)監(jiān)測到原料點淡化直到消失，代表反應(yīng)結(jié)束。待反應(yīng)結(jié)束后把反應(yīng)液用旋干儀旋干殘余乙腈，隨后轉(zhuǎn)移到分液漏斗中加入乙酸乙酯與飽和食鹽水萃取有機相，飽和食鹽水再萃取有機層2-3次，隨后換適量稀鹽酸萃取有機相，用無水硫酸鈉除去有機相剩余水分后再次使用旋干儀旋蒸至干，旋干所得即為化合物1。合成化合物2的一般程序：使用5ml乙腈溶解0.5g中間體3，使用一次性吸管緩慢滴加0.09g（1.2eq）N-甲基正丙胺到溶液中，再稱取0.29g(2eq)無水碳酸鉀倒入溶液中，在加熱70℃和冷凝回流的條件下用磁力攪拌子攪拌3小時，期間反應(yīng)進程的監(jiān)測使用薄層色譜法(TLC)(展開劑比例為二氯甲烷:甲醇=20:1或乙酸乙酯:石油醚=1:1)。當(dāng)監(jiān)測到原料點淡化直到消失，代表反應(yīng)結(jié)束。待反應(yīng)結(jié)束后把反應(yīng)液用旋干儀旋干殘余乙腈，隨后轉(zhuǎn)移到分液漏斗中加入乙酸乙酯與飽和食鹽水萃取有機相，飽和食鹽水再萃取有機層2-3次，隨后換適量稀鹽酸萃取有機相，用無水硫酸鈉除去有機相剩余水分后再次使用旋干儀旋蒸至干，旋干所得即為化合物2。合成化合物3的一般程序：使用5ml乙腈溶解0.5g中間體3，使用一次性吸管緩慢滴加0.09g（1.2eq）N-甲基-2-羥基乙胺到溶液中，再稱取0.29g(2eq)無水碳酸鉀倒入溶液中，在加熱70℃和冷凝回流的條件下用磁力攪拌子攪拌3小時，期間反應(yīng)進程的監(jiān)測使用薄層色譜法(TLC)(展開劑比例為二氯甲烷:甲醇=20:1或乙酸乙酯:石油醚=1:1)。當(dāng)監(jiān)測到原料點淡化直到消失，代表反應(yīng)結(jié)束。待反應(yīng)結(jié)束后把反應(yīng)液用旋干儀旋干殘余乙腈，隨后轉(zhuǎn)移到分液漏斗中加入乙酸乙酯與飽和食鹽水萃取有機相，飽和食鹽水再萃取有機層2-3次，隨后換適量稀鹽酸萃取有機相，用無水硫酸鈉除去有機相剩余水分后再次使用旋干儀旋蒸至干，旋干所得即為粗產(chǎn)物。粗品經(jīng)硅膠柱層析(二氯甲烷:甲醇=50:1)純化得到化合物3。產(chǎn)物純度檢測：通過核磁共振氫譜與碳譜確認藥物純度碳譜純度檢測結(jié)果：N-甲基甲胺13CNMR(151MHz,DMSO)δ217.61(C3),169.11,168.17(C21),141.18,138.10(C19),130.48（兩個碳）,128.83,120.28,115.64(C20),73.06(C11),70.11(C14),63.78,57.70(C4),45.78(兩個碳),45.41(C9),44.42(C13),44.11(C12),41.91(C5),36.84(C6),36.81(C10),36.76(C2),34.46(C22),30.57(C8),28.92(C7),27.04(C18),24.93(C1),16.55(C16),14.98(C15),11.98(C17).N-甲基正丙胺13CNMR(151MHz,DMSO)δ217.63(C3),168.12(C21),163.60,141.22,137.21(C19),130.25,130.10,120.34,115.61(C20),73.02(C11),70.19(C14),57.92,57.72(C4),45.41(C9),44.44(C13),44.13(C12),41.92(C5),41.30,36.86(C6),36.81(C10),36.45(C2),34.46(C22),30.57(C8),28.97(C7),27.04(C18),24.93(C1),17.51,16.54(C16),14.99(C15),12.00,11.25(C17).甲基-2-羥基乙胺13CNMR(151MHz,CDCl?)δ217.24,169.24,168.35,139.10,138.92,137.41,131.94,129.22,119.99,117.27,74.61,69.48,62.05,59.65,59.62,58.19,45.45,44.92,44.72,43.88,43.08,41.76,38.15,36.79,35.97,34.49,30.42,26.82,26.31,24.84,16.75,14.87,11.50.合成階段總結(jié)：經(jīng)過分析與繪圖進行對照，可以判斷本實驗合成的以4-氨基苯硫酚為連接的含氮雜烷烴側(cè)鏈截短側(cè)耳素衍生物產(chǎn)物純度在95%以上，合成路線可行性強，穩(wěn)定性高，可以進行體外活性檢測以初步評價此藥物抗菌效果。3目標化合物的生物活性研究3.1前期準備3.1.1原料與試劑BHI肉湯培養(yǎng)基BHI肉湯（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）純水吐溫80泰妙菌素樣品萬古霉素樣品瓊脂培養(yǎng)基制作方法：稱取20g瓊脂粉，加入蒸餾水或去離子水500ml，攪拌加熱煮沸至完全溶解，在高壓滅菌鍋內(nèi)高壓滅菌，待冷卻至50℃左右傾注培養(yǎng)基于滅菌培養(yǎng)皿中，冷卻凝固后置于冰箱內(nèi)保存。高壓滅菌鍋設(shè)置為：溫度121℃，持續(xù)20分鐘。3.1.2實驗器材移液槍超凈工作臺高壓滅菌鍋96孔板各類培養(yǎng)皿試劑瓶注射器注：所使用器材均需高壓滅菌，防止污染。使用超凈臺時注意消毒，避免影響實驗結(jié)果。3.2研究內(nèi)容與目的sourceType":"answer","sourceId":3056145668}"最小抑菌濃度

(MinimumInhibitoryConcentration,MIC)是指在抗菌藥物敏感性測試中，所需的最低藥物濃度，能夠完全抑制特定細菌菌株的生長。這一指標對于評估抗菌藥物的功效、選擇適當(dāng)?shù)闹委煼桨敢约氨O(jiān)測耐藥性非常關(guān)鍵。MIC值的測定通常通過在含有不同濃度抗菌藥物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細菌，并觀察細菌生長情況來進行。MIC值越低，表明抗菌藥物對細菌的抑制作用越強。最小殺菌濃度（MinimumBactericidalConcentration，MBC）是指在抗菌藥物敏感性測試中，對于特定細菌菌株，所需的最低藥物濃度，能夠?qū)е录毦乃劳?，而非僅抑制其生長。MBC是評估抗菌藥物對細菌的殺菌能力的重要參數(shù)，與最小抑菌濃度（MIC）相比，MBC更準確地反映了藥物的殺菌作用。通常情況下，MBC的測定方法類似于MIC的測定，但在確定MBC時，需要進一步檢查培養(yǎng)基上是否出現(xiàn)了無活性的細菌。MBC值越低，表示抗菌藥物對細菌的殺菌作用越強。稀釋法是一種常用的實驗技術(shù)，用于確定抗菌藥物對細菌的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）。該方法涉及將不同濃度的抗菌藥物與含有細菌的培養(yǎng)基混合，然后通過連續(xù)稀釋藥物溶液，使得每個培養(yǎng)皿或孔板上的藥物濃度呈現(xiàn)一系列的梯度。接著，將細菌接種到含有不同藥物濃度的培養(yǎng)基中，并培養(yǎng)一段時間，以觀察細菌的生長情況。最終，根據(jù)細菌的生長情況，確定MIC和MBC。稀釋法的結(jié)果對于評估抗菌藥物的功效、確定治療方案和監(jiān)測細菌耐藥性具有重要意義。稀釋法藥敏試驗的常用實驗方法主要有微量肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法。瓊脂稀釋法通過將不同濃度的抗菌物質(zhì)與含有微生物的瓊脂培養(yǎng)基混合，然后將混合物倒入培養(yǎng)皿或孔板中，讓瓊脂凝固。接著，將待測微生物接種于瓊脂表面，并進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)一段時間后，觀察形成的菌落情況，可以確定微生物對抗菌物質(zhì)的敏感性。瓊脂稀釋法通常用于確定微生物的最小抑菌濃度（MIC），是評估抗菌物質(zhì)效力和選擇治療方案的重要工具。微量肉湯稀釋法是本實驗所使用的MIC測定方法，在超凈工作臺內(nèi)使用潔凈96孔板對藥物進行梯度稀釋，可以同時測定多個藥物且可以方便快捷地進行對照組的實驗，在適宜環(huán)境培養(yǎng)24h時間后可以進行觀測，未渾濁的孔位代表細菌被抑制無法生長。測定MBC則是需要在測定MIC的實驗基礎(chǔ)上將96孔板再培養(yǎng)24h后，用移液槍分別從后往前吸取數(shù)個未渾濁的孔位的溶液，注射到干凈的瓊脂培養(yǎng)皿中，再把培養(yǎng)皿放置到適宜環(huán)境培養(yǎng)24h，待時間到即可取出觀察，此時未長菌的培養(yǎng)皿所代表的最低濃度即為MBC。3.3實驗方法本實驗采用微量肉湯稀釋法來測定最小抑菌濃度（minimuminhibitoryconcentration，MIC）以及最小殺菌濃度（minimumbactericidalconcentration，MBC），通過對目標化合物的MIC值和MBC值完成初步生物活性評價。3.3.1實驗菌種金黃色葡萄球菌：ATCC43300(MRSA)、S.aureusATCC29213、S.aureusAD3以及S.aureus144。3.3.2藥液配制分別精密稱取6.4mg萬古霉素、泰妙菌素以及三種目標化合物，于250μLDMSO中溶解，搖勻后添加250μL吐溫80，最后加入4500μL超純水，將藥物配制成濃度為1250μg/mL的母液。在超凈工作臺中，用去除針頭的注射器吸取母液，然后使用0.22μm的微孔濾膜對藥液進行過濾，隨后將其放置于-20℃冰箱中保存，備用。3.3.3菌液配制用接種環(huán)將儲存在4℃冰箱中保存的金黃色葡萄球菌菌株接種至培養(yǎng)基上，隨后放到恒溫培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24小時之后取出，挑選大小合適、長勢優(yōu)良的單個菌落使用接種環(huán)接種到裝有高壓滅菌后的BHI肉湯中。接好菌種的EP管固定于搖床中，繼續(xù)37℃恒溫培養(yǎng)4.5小時后獲得菌液。3.3.4目標化合物最小抑菌濃度（MIC）的測定（1）在超凈工作臺上，取一個96孔滴定板，自上而下各排標號，A至H共八排。向A-F各排第一孔添加180μL無菌BHI肉湯，A-H各排其余孔添加100μL無菌BHI肉湯。（2）用移液槍吸取20μL配制好的目標化合物1母液（濃度為1280μg/mL）添加進ABC排的第一個孔中，吸取20μL配制好的目標化合物2母液（濃度為1280μg/mL）添加進DEF排的第一個孔中，將母液加入每個孔中的同時進行充分反復(fù)吹打混勻。用移液槍從A~F排第一個孔中吸取100μL混合液轉(zhuǎn)移至A~F排第二孔中，進行充分的反復(fù)吹打混勻，重復(fù)上述操作至第十二個孔，最后用移液槍吸取100μL第十二孔中混合液棄去。此時A~F排每孔藥物濃度依次是128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125，0.06μg/mL。（3）移液槍取培養(yǎng)完畢菌液500μL與20mL潔凈肉湯混合，吹打40次以上使稀釋液各部分濃度一致。用移液槍向A~H各孔加入100μL稀釋后的菌液，此時A-F排每孔藥物濃度依次是64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125，0.06，0.03μg/mL。（4）在第G排各孔添加200μL無菌BHI肉湯作陰性對照，第H排各孔添加100μL無菌BHI肉湯以及100μL稀釋后的菌液作陽性對照。（5）重復(fù)上述實驗步驟將配制好的目標化合物、泰妙菌素母液（濃度均為1280μg/mL）稀釋至各孔內(nèi)并添加菌液。每株菌做三次平行實驗。（6）將配制好的96孔滴定板在在37℃環(huán)境中靜置恒溫培養(yǎng)24小時后，取出，觀察結(jié)果。（7）結(jié)果判讀時在光線良好的情況下觀察滴定板，孔內(nèi)若有渾濁現(xiàn)象，則說明有菌生長；孔內(nèi)若是澄清狀態(tài)，則說明無菌生長。滴定板每排各孔從右往左觀察，以第一個出現(xiàn)澄清狀態(tài)的孔的濃度視為該藥物的最小抑菌濃度（MIC）。具體而言，以肉眼觀察96孔板，最后一排陽性對照組液體明顯變渾濁，倒數(shù)第二排陰性對照組液體澄清，證明細菌正常繁殖生長，此時其余排中第一個未變渾濁的孔為藥物的最小抑菌濃度（MIC）。當(dāng)出現(xiàn)單個的跳孔時，記錄抑制有細菌生長的藥物濃度最高的孔的濃度值作為MIC值。3.3.5目標化合物最小殺菌濃度（MBC）的測定（1）觀察完藥物的MIC之后，再次放進培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，待24h后取出使用。再取數(shù)個BHI肉湯瓊脂板于超凈工作臺中，使用移液槍移取100μL各個澄清孔的混合液于板上均勻涂布。（2）菌液均勻分布且瓊脂平板表面干燥后在37℃環(huán)境中靜置恒溫培養(yǎng)24小時后，取出培養(yǎng)箱中的固體培養(yǎng)基進行觀察，結(jié)果判定：若在平板觀察到細菌的特征性菌落，則說明有細菌生長；若不能觀察到菌落，則說明無菌生長。第一個出現(xiàn)無菌生長的藥液濃度視為該藥的最小殺菌濃度（MBC）。3.4活性檢測結(jié)果及分析該實驗是對上述合成的三種藥物進行體外抗菌活性檢驗與評價，主要探究這三種截短側(cè)耳素衍生物對金黃色葡萄球菌（ATCC43300，MRSA）的抗菌活性，通過肉湯稀釋法，以泰妙菌素、沃尼妙林、萬古霉素為陽性對照，研究最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）值。以下是實驗結(jié)果：合成化合物1（原料為N-甲基甲胺）的截短側(cè)耳素衍生物的96孔板于24h后觀察可得第11孔開始清澈，對金黃色葡萄球菌MIC為0.06μg/mL。涂布平板觀察結(jié)果為吸取7號孔溶液培養(yǎng)所得平板無細菌生長，測得MBC為1μg/mL。合成化合物2（原料為N-甲基正丙胺）的截短側(cè)耳素衍生物的96孔板于24h后觀察可得第11孔開始清澈，對金黃色葡萄球菌MIC為0.06μg/mL。涂布平板觀察結(jié)果為吸取8號孔溶液培養(yǎng)所得平板無細菌生長，測得MBC為0.5μg/mL。合成化合物3（原料為N-甲基-2-羥基乙胺）的截短側(cè)耳素衍生物的96孔板于24h后觀察可得11個孔開始清澈，則對金黃色葡萄球菌MIC可認為是0.06μg/mL。涂布平板觀察結(jié)果為吸取10號孔溶液培養(yǎng)所得平板無細菌生長，測得MBC為0.125μg/mL。對照試驗中使用了泰妙菌素、萬古霉素、沃尼妙林三種已經(jīng)上市的藥物作為本實驗合成的三種截短側(cè)耳素衍生物的對照組以參考，其結(jié)果為：泰妙菌素的96孔板經(jīng)24h培養(yǎng)后觀察可得第9孔開始清澈，則對金黃色葡萄球菌MIC為0.25μg/mL。涂布平板觀察結(jié)果為吸取7號孔溶液培養(yǎng)所得平板無細菌生長，測得MBC為1μg/mL。萬古霉素的96孔板經(jīng)24h培養(yǎng)后觀察可得第6孔開始清澈，則對金黃色葡萄球菌MIC為2μg/mL。涂布平板觀察結(jié)果為吸取4號孔溶液培養(yǎng)所得平板無細菌生長，測得MBC為8μg/mL。沃尼妙林的96孔板經(jīng)24h培養(yǎng)后觀察可得第10孔開始清澈，則對金黃色葡萄球菌MIC為0.125μg/mL。涂布平板觀察結(jié)果為吸取10號孔溶液培養(yǎng)所得平板無細菌生長，測得MBC為0.125μg/mL。表1本實驗藥物對金黃色葡萄球菌ATCC43300的MIC測定藥物原料清澈孔位最小抑菌濃度（μg/mL）泰妙菌素90.25萬古霉素62沃尼妙林100.125N-甲基甲胺110.06N-甲基正丙胺110.06N-甲基-2-羥基乙胺110.06表2本實驗藥物對金黃色葡萄球菌ATCC43300的MBC測定藥物原料溶液培養(yǎng)無細菌生長孔位最小殺菌濃度（μg/mL）泰妙菌素71萬古霉素48沃尼妙林100.125N-甲基甲胺71N-甲基正丙胺80.5N-甲基-2-羥基乙胺100.1254全文總結(jié)本實驗在當(dāng)下全球細菌耐藥性程度嚴重以及截短側(cè)耳素上市藥物稀缺且所具有的開發(fā)潛力大的背景下，設(shè)計并合成了3種分別以N-甲基甲胺、N-甲基正丙胺、N-甲基-2-羥基乙胺為原料的以4-氨基苯硫酚為連接基團的含氮雜烷烴側(cè)鏈的截短側(cè)耳素衍生物。經(jīng)碳譜確認純度后用肉湯稀釋法測定三種藥物對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度以及最小殺菌濃度。通過上述體外活性檢測，確定了所合成的3種藥物均對金黃色葡萄球菌具有體外抗菌活性。經(jīng)與泰妙菌素、萬古霉素、沃尼妙林三種已經(jīng)上市的藥物對比，表明所合成的三種藥物體外活性較強，揭示了截短側(cè)耳素類藥物的價值以及強大的改造潛力，可能為當(dāng)下解決細菌耐藥性問題提供新的解決方案。參考文獻郝少君，管志江，李軍.抗菌藥物臨床應(yīng)用與管理[M].北京：人民軍醫(yī)出版社,，2011:1-4.周長林.微生物學(xué)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：511-514.SchatzA,BugieE,WaksmanSA.SelmanAbrahamWaksman.Streptomycinreported[J].AnnInternMed,1973,79:678.戴紀剛，張國強，黃小兵，等.抗生素科學(xué)發(fā)展簡史.抗生素科學(xué)發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