細胞工程與作物育種一、細胞工程概述(一)細胞工程得定義:以細胞為基本單位,在離體條件下進行培養(yǎng)、繁殖或按照人們得意愿改造細胞得某些生物學(xué)特性,以改良作物品種和創(chuàng)造新種質(zhì),或加速繁育植物群體或獲得其她有經(jīng)濟價值得生物產(chǎn)品得過程。(二)主要內(nèi)容:就是現(xiàn)代生物技術(shù)得重要組成部分。包括:植物組織培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)花藥及花粉培養(yǎng)離體胚培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)細胞器移植等等。每一種都還可以繼續(xù)細分為不同小類。

以上內(nèi)容可歸為兩部分上游工程:細胞培養(yǎng)、細胞遺傳轉(zhuǎn)化體系建立。下游工程:細胞工程實踐應(yīng)用。(三)理論基礎(chǔ)植物細胞全能性(cellTotipotency):每個植物細胞具有發(fā)育成為完整植株得潛能。(四)育種應(yīng)用1、微體快繁植物組織(塊)→人工培養(yǎng)→再生成苗→大量繁殖。營養(yǎng)植物、經(jīng)濟作物,如花卉、香蕉、咖啡、中藥材品種快繁。荷蘭、以色列:花卉2、脫毒染病毒植物中,莖尖分生組織病毒得分布最少或沒有。草莓、香蕉、甘薯、馬鈴薯等60多種作物。脫毒草莓3、細胞融合(體細胞雜交)克服不同物種有性雜交困難馬鈴薯與番茄得細胞融合成功獲得植株、2個抗病毒馬鈴薯野生種(2n=2x=24),不能有性雜交,通過細胞融合,獲得抗病毒馬鈴薯(2n=4x=48)。12大家應(yīng)該也有點累了，稍作休息大家有疑問的，可以詢問和交流4、體細胞無性系變異篩選基礎(chǔ):生物個體生長發(fā)育過程中,體細胞基因突變和染色體重組產(chǎn)生體細胞變異方法:有利得體細胞變異→(定向)篩選→培養(yǎng)成苗→培育優(yōu)良品種應(yīng)用:日本粳稻品種→胚培養(yǎng)→早熟、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)得粳稻品種在東北大積推廣應(yīng)用。水稻幼胚→毒素培養(yǎng)基(含病原菌得粗毒素)→愈傷組織化成苗→經(jīng)過抗性鑒定→抗稻瘟病品系

5、胚拯救遠緣雜交早期胚胎發(fā)育到一定時間就停止發(fā)育、死亡、夭折。遠緣雜種幼胚→離體組織培養(yǎng)→發(fā)育正常植株。

6、花藥(花粉)培養(yǎng)解決了雜交后代分離,遺傳純合穩(wěn)定慢,育種周期長?；ǚ?花藥)→單倍體(n)→二倍體(2n)。

遺傳迅速純合,育種周期極大縮短。Hs-1、Hs-2、Hs-3系列光敏不育系;花1A。培矮64s花培純化,解決育性轉(zhuǎn)換臨界溫度漂移。十字花科蔬菜得自交不親和系培育?！爸谢?號”水稻,“京花3號”小麥,等花椰菜、抱子甘藍花藥培養(yǎng),快速培育自交不親和系7、創(chuàng)制人工種子人工種皮+胚狀體(不定芽、頂芽、腋芽)8、種質(zhì)試管保存9、轉(zhuǎn)基因受體轉(zhuǎn)40頁二、植物離體培養(yǎng)技術(shù)(一)概念1、植物離體培養(yǎng)(Invitroculture)植物外植體在無菌條件下進行人工培養(yǎng),并使之發(fā)育成完整植株得技術(shù)總稱,也稱植物組織培養(yǎng)(Planttissueculture)。2、外植體(explant)

從植物體分離下來進行培養(yǎng)得器官、組織或細胞等。3、初代培養(yǎng)(Primaryculture)

指外植體得最初培養(yǎng)。4、繼代培養(yǎng)(Subculture)

將初代培養(yǎng)得到得培養(yǎng)體移植于新鮮培養(yǎng)基中再培養(yǎng)(一次或多次移植培養(yǎng))。洗滌室滅菌室配制室無菌操作室培養(yǎng)室(暗、光)(二)實驗室基本設(shè)施組培實驗室:要求無菌條件(三)培養(yǎng)條件1、培養(yǎng)基(1)種類:

固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基(2)基本培養(yǎng)基MS、B5、White、N6等P237表15-1MS:Murashige&Skoog(3)培養(yǎng)基得成分無機營養(yǎng):大量元素:N、P、K、S、Ca、Mg

微量元素:Fe、Mn、Cu等有機營養(yǎng):碳源:蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖氮源:氨基酸類、酰胺類活性物質(zhì):煙酸、肌醇、生物素等植物激素:生長素類:IAA、NAA、IBA等

細胞分裂素類:激動素、玉米素等其她:赤霉素、脫落酸、乙烯附加物:瓊脂、椰乳、水解蛋白等十字花科花藥培養(yǎng)得培養(yǎng)基成分2、無菌操作(1)污染源培養(yǎng)基及玻璃器皿無菌操作室、器械外植體(2)消毒器皿消毒材料(外植體)消毒外植體消毒外植體常用消毒劑得種類、濃度、及效果培養(yǎng)基滅菌高壓蒸汽滅菌過濾滅菌接種過程消毒接種室(無菌操作室)得滅菌接種臺得滅菌工作人員3、培養(yǎng)條件光照:白色熒光燈,光強1000~5000Lx,12~16hr,用自動定時器控制光照時間溫度:多為25±2℃濕度:容器內(nèi)濕度:100%環(huán)境濕度:要求70%~80%4、基本過程

外植體取材(已分化得器官、組織、細胞等)↓

外植體消毒滅菌,接種到相應(yīng)得脫分化培養(yǎng)基↓(脫分化)

愈傷組織或胚狀體↓

接種到分化培養(yǎng)基↓(再分化)分化芽、根,完整植株↓練苗,移栽大田胚狀體愈傷組織水稻花藥培養(yǎng)過程影響花藥及花粉培養(yǎng)得因素供體植株得基因型培養(yǎng)基(基本培養(yǎng)基、附加物,如水稻、小麥用N6)小孢子發(fā)育階段合適發(fā)育期得花藥,離體培養(yǎng)才能啟動花粉發(fā)育。實踐表明,從減數(shù)分裂期至雙核期得花藥,均有可能誘導(dǎo)離體孤雄發(fā)育。

大多數(shù)園藝植物得花藥培養(yǎng),成功率最高得時期為單核期,或單核中晚期。供體植株得生理狀態(tài)及培養(yǎng)前預(yù)處理三、原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細胞雜交植物原生質(zhì)體:除去細胞壁得由質(zhì)膜包裹著得具有生活力得裸細胞。原生質(zhì)體融合:也稱體細胞雜交,使不同原生質(zhì)體相互融合形成雜種細胞,再經(jīng)過人工培養(yǎng)誘導(dǎo)雜種細胞分化形成植株得過程。(一)基本步驟原生質(zhì)體分離原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體融合融合體得發(fā)育及雜種細胞得篩選體細胞雜種植株得再生及鑒定P254,圖15-9(二)原生質(zhì)體分離分離原生質(zhì)體得材料

葉肉組織,無菌苗得子葉,愈傷組織及懸浮細胞。分離植物原生質(zhì)體所需得酶

果膠酶、纖維素酶原生質(zhì)體分離步驟一步法:果膠酶和纖維素酶混合處理材料二步法:用果膠酶降解細胞間層使細胞分離;再用纖維素酶水解細胞壁釋放原生質(zhì)體。

酶解后,用200目篩過濾,濾液再用400目篩過濾,濾液經(jīng)低速離心,去上清液后,即為純化