基于HPLC數(shù)字化指紋圖譜的刺五加及刺五加注射液質(zhì)量評價(jià)與成分剖析一、引言1.1研究背景與意義刺五加（Acanthopanaxsenticosus(Rupr.etMaxim.)Harms）作為五加科五加屬的重要藥用植物，在傳統(tǒng)中醫(yī)藥領(lǐng)域占據(jù)著重要地位。其根、莖、葉均可入藥，含有多種活性成分，如刺五加苷、黃酮類、多糖、木脂素等，這些成分賦予了刺五加廣泛的藥理活性?！吨袊幍洹分杏涊d，刺五加具有益氣健脾、補(bǔ)腎安神的功效，可用于治療脾肺氣虛、體虛乏力、食欲不振、肺腎兩虛、久咳虛喘、腎虛腰膝酸痛、心脾不足、失眠多夢等癥狀?，F(xiàn)代研究表明，刺五加還具有抗氧化、抗疲勞、調(diào)節(jié)免疫、改善心血管功能、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等作用，在臨床上被廣泛應(yīng)用于治療神經(jīng)衰弱、糖尿病、動脈硬化、風(fēng)濕癥、心血管疾病等多種疾病。刺五加注射液是以刺五加為原料提取制成的單方制劑，經(jīng)多年臨床實(shí)踐證明，對治療肝腎不足所致的短暫性腦缺血發(fā)作、腦動脈硬化、腦血栓形成、腦栓塞等心腦血管疾病療效顯著，還可作為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心絞痛合并神經(jīng)衰弱以及更年期綜合征人群的輔助性用藥。然而，由于刺五加藥材的產(chǎn)地、采收季節(jié)、炮制方法以及制劑工藝等因素的差異，導(dǎo)致刺五加注射液的質(zhì)量參差不齊，影響了其臨床療效和安全性。因此，建立一種科學(xué)、準(zhǔn)確、全面的質(zhì)量控制方法對于保證刺五加注射液的質(zhì)量穩(wěn)定性和有效性至關(guān)重要。高效液相色譜（HPLC）數(shù)字化指紋圖譜技術(shù)作為一種先進(jìn)的分析手段，能夠全面反映中藥及其制劑中化學(xué)成分的種類和相對含量，具有分離效率高、分析速度快、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，已成為中藥質(zhì)量控制的重要方法之一。通過建立刺五加和刺五加注射液的HPLC數(shù)字化指紋圖譜，可以獲得其化學(xué)組成的特征信息，實(shí)現(xiàn)對其質(zhì)量的整體控制和評價(jià)。這不僅有助于提高刺五加藥材和刺五加注射液的質(zhì)量穩(wěn)定性和可控性，保障臨床用藥的安全有效，還能為刺五加的深入研究和開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)，推動中藥現(xiàn)代化進(jìn)程。同時(shí)，該研究對于豐富中藥指紋圖譜技術(shù)的應(yīng)用，完善中藥質(zhì)量評價(jià)體系也具有重要的理論和實(shí)踐意義。1.2研究目的本研究旨在運(yùn)用高效液相色譜（HPLC）技術(shù)，建立刺五加及刺五加注射液的數(shù)字化指紋圖譜，并對其進(jìn)行深入的對比分析，以全面、準(zhǔn)確地揭示兩者在化學(xué)成分和質(zhì)量方面的特征及差異。具體而言，通過建立HPLC數(shù)字化指紋圖譜，確定刺五加及刺五加注射液中的共有指紋峰，獲取其化學(xué)組成的特征信息，實(shí)現(xiàn)對其質(zhì)量的整體表征和評價(jià)。運(yùn)用相似度計(jì)算、聚類分析和主成分分析等數(shù)理化方法，對指紋圖譜進(jìn)行系統(tǒng)分析，以評估不同批次刺五加及刺五加注射液的質(zhì)量穩(wěn)定性和一致性，明確兩者在化學(xué)成分上的相似性和差異性。對刺五加及刺五加注射液中的主要藥效成分進(jìn)行指認(rèn)和含量測定，探討其藥效成分的異同，為其臨床應(yīng)用和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。通過本研究，期望能夠?yàn)榇涛寮铀幉牡馁|(zhì)量評價(jià)和標(biāo)準(zhǔn)化種植提供參考，為刺五加注射液的生產(chǎn)工藝優(yōu)化和質(zhì)量控制提供技術(shù)支持，從而保障刺五加及其制劑的質(zhì)量穩(wěn)定和安全有效，推動刺五加資源的合理開發(fā)和利用。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在刺五加的研究領(lǐng)域，國內(nèi)外學(xué)者針對其化學(xué)成分展開了深入探索。國外方面，俄羅斯學(xué)者較早關(guān)注刺五加，對其多種活性成分進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)刺五加含有多種苷類、黃酮類、多糖等成分，其中刺五加苷被證實(shí)具有顯著的抗疲勞、調(diào)節(jié)免疫等活性。日本學(xué)者也對刺五加的化學(xué)成分進(jìn)行研究，在其分離鑒定方面取得成果，為后續(xù)的藥理研究奠定基礎(chǔ)。國內(nèi)研究更為全面和深入，通過多種分離鑒定技術(shù)，已從刺五加中分離出多種刺五加苷（如刺五加苷A、B、B?、C、D、E、F、G等）、黃酮類化合物（如金絲桃苷、蘆丁等）以及多糖、木脂素等成分。對這些成分的含量測定和分布規(guī)律也有研究，明確不同產(chǎn)地、采收季節(jié)、炮制方法等因素對刺五加化學(xué)成分含量的影響。在刺五加注射液的研究中，國外主要集中在其藥理活性和臨床應(yīng)用的驗(yàn)證上，通過臨床試驗(yàn)，證實(shí)刺五加注射液在改善心血管功能、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等方面的療效。國內(nèi)則不僅關(guān)注其藥理作用和臨床應(yīng)用，還對其質(zhì)量控制進(jìn)行深入研究。傳統(tǒng)的質(zhì)量控制方法主要是對其中的個(gè)別成分進(jìn)行含量測定，但由于刺五加注射液成分復(fù)雜，這種方法難以全面反映其質(zhì)量。隨著科技的發(fā)展，指紋圖譜技術(shù)逐漸應(yīng)用于刺五加注射液的質(zhì)量控制。在指紋圖譜構(gòu)建方面，國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行諸多嘗試。國外主要運(yùn)用HPLC、GC等技術(shù)構(gòu)建指紋圖譜，以全面反映刺五加注射液的化學(xué)組成特征。國內(nèi)則在技術(shù)應(yīng)用和方法創(chuàng)新上取得顯著成果，不僅采用HPLC、GC等常規(guī)技術(shù)，還結(jié)合質(zhì)譜（MS）、核磁共振（NMR）等技術(shù)，提高指紋圖譜的分辨率和信息含量。在方法創(chuàng)新上，提出數(shù)字化指紋圖譜的概念，通過對指紋圖譜的數(shù)字化處理，提取更多的質(zhì)量信息，實(shí)現(xiàn)對刺五加注射液質(zhì)量的更精準(zhǔn)評價(jià)。在指紋圖譜的應(yīng)用方面，國內(nèi)外都將其用于刺五加注射液的質(zhì)量控制和評價(jià)。通過對不同批次刺五加注射液指紋圖譜的相似度計(jì)算和模式識別分析，判斷其質(zhì)量的穩(wěn)定性和一致性。指紋圖譜還用于刺五加注射液生產(chǎn)過程的監(jiān)控，確保生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性和產(chǎn)品質(zhì)量的可控性。然而，目前指紋圖譜技術(shù)在刺五加注射液質(zhì)量控制中的應(yīng)用仍存在一些問題，如指紋圖譜的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化程度有待提高，不同實(shí)驗(yàn)室之間的重現(xiàn)性和可比性還需加強(qiáng)，對指紋圖譜中各峰的歸屬和作用機(jī)制的研究還不夠深入。二、HPLC數(shù)字化指紋圖譜技術(shù)原理與方法2.1HPLC基本原理高效液相色譜（HPLC）技術(shù)的基本原理基于液相色譜法，其核心在于利用物質(zhì)在固定相和流動相之間分配系數(shù)的差異，實(shí)現(xiàn)對混合物中各組分的分離。在HPLC系統(tǒng)中，固定相通常是填充在色譜柱內(nèi)的顆粒極細(xì)的固體吸附劑或凝膠，其表面具有特定的化學(xué)性質(zhì)，能夠與樣品中的組分發(fā)生相互作用。流動相則是一種液體，通常由水、有機(jī)溶劑或緩沖溶液組成，它在高壓泵的驅(qū)動下，以恒定的流速通過色譜柱。當(dāng)樣品溶液被注入到流動相中后，隨著流動相的流動進(jìn)入色譜柱。樣品中的各組分在固定相和流動相之間進(jìn)行多次分配，由于不同組分與固定相和流動相的親和力不同，導(dǎo)致它們在色譜柱中的保留時(shí)間不同。親和力較強(qiáng)的組分在固定相中停留的時(shí)間較長，移動速度較慢；而親和力較弱的組分則在流動相中停留的時(shí)間較長，移動速度較快。通過這種方式，樣品中的各組分在色譜柱中逐漸分離，最終依次從色譜柱中流出，被檢測器檢測到。以刺五加和刺五加注射液的分析為例，刺五加中含有多種化學(xué)成分，如刺五加苷、黃酮類、多糖等，這些成分在HPLC分析中，由于它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不同，與固定相和流動相的相互作用也存在差異。刺五加苷類成分可能與固定相表面的某些基團(tuán)發(fā)生特異性吸附作用，而黃酮類成分則可能由于其分子結(jié)構(gòu)中的共軛體系，與流動相中的有機(jī)溶劑有不同的溶解性。在流動相的推動下，這些成分在色譜柱中按照各自的保留時(shí)間先后流出，從而實(shí)現(xiàn)分離。這種分離過程是基于各成分在固定相和流動相之間的分配平衡，通過多次的分配和再分配，使得原本混合在一起的成分得以有效分離，為后續(xù)的檢測和分析提供了基礎(chǔ)。2.2數(shù)字化指紋圖譜概念與技術(shù)優(yōu)勢數(shù)字化指紋圖譜是一種將傳統(tǒng)指紋圖譜技術(shù)與現(xiàn)代數(shù)字化處理方法相結(jié)合的分析技術(shù)，它通過對樣品的化學(xué)組成進(jìn)行全面、系統(tǒng)的分析，將獲得的指紋圖譜信息進(jìn)行數(shù)字化轉(zhuǎn)換和處理，從而更準(zhǔn)確、全面地反映樣品的化學(xué)組成特征。其核心在于利用先進(jìn)的儀器分析技術(shù)，如高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜（GC）、質(zhì)譜（MS）等，獲取樣品中化學(xué)成分的指紋圖譜，再運(yùn)用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法和計(jì)算機(jī)技術(shù)，對指紋圖譜中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析、處理和挖掘，提取出具有代表性的特征信息，將這些信息轉(zhuǎn)化為數(shù)字化的形式，以便于存儲、比較和分析。與傳統(tǒng)指紋圖譜相比，數(shù)字化指紋圖譜具有諸多顯著優(yōu)勢。在全面性方面，傳統(tǒng)指紋圖譜往往只能反映樣品中部分化學(xué)成分的信息，而數(shù)字化指紋圖譜能夠利用先進(jìn)的分析技術(shù)和數(shù)據(jù)處理方法，對樣品中的化學(xué)成分進(jìn)行更全面的檢測和分析，從而更完整地呈現(xiàn)樣品的化學(xué)組成特征。在分析刺五加和刺五加注射液時(shí)，數(shù)字化指紋圖譜不僅能夠檢測到傳統(tǒng)方法能夠識別的刺五加苷、黃酮類等主要成分，還能檢測到一些含量較低但可能對其藥效和質(zhì)量產(chǎn)生重要影響的微量成分，為全面了解其質(zhì)量提供更豐富的信息。在準(zhǔn)確性方面，數(shù)字化指紋圖譜通過精確的儀器分析和嚴(yán)格的數(shù)據(jù)處理流程，減少了人為因素對分析結(jié)果的影響，提高了分析的準(zhǔn)確性和可靠性。傳統(tǒng)指紋圖譜在圖譜的讀取和分析過程中，容易受到操作人員的主觀判斷和經(jīng)驗(yàn)水平的影響，導(dǎo)致結(jié)果的誤差較大。而數(shù)字化指紋圖譜采用標(biāo)準(zhǔn)化的分析方法和自動化的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，能夠更準(zhǔn)確地測量和記錄指紋圖譜中的各項(xiàng)參數(shù)，如峰面積、峰高、保留時(shí)間等，從而為質(zhì)量評價(jià)提供更精確的數(shù)據(jù)支持。數(shù)字化指紋圖譜還具有良好的重現(xiàn)性和可比性。由于數(shù)字化指紋圖譜采用統(tǒng)一的分析方法和數(shù)據(jù)處理標(biāo)準(zhǔn)，不同實(shí)驗(yàn)室或不同時(shí)間獲得的指紋圖譜數(shù)據(jù)具有較高的一致性和可比性。這使得在進(jìn)行質(zhì)量控制和評價(jià)時(shí)，可以更方便地對不同批次的樣品進(jìn)行比較和分析，及時(shí)發(fā)現(xiàn)質(zhì)量差異，確保產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性和一致性。同時(shí)，數(shù)字化指紋圖譜的數(shù)據(jù)可以方便地進(jìn)行存儲和傳輸，便于建立指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，為后續(xù)的研究和應(yīng)用提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。2.3構(gòu)建HPLC數(shù)字化指紋圖譜的方法與流程構(gòu)建刺五加和刺五加注射液的HPLC數(shù)字化指紋圖譜，需遵循一套嚴(yán)謹(jǐn)且科學(xué)的方法與流程，以確保圖譜能夠準(zhǔn)確、全面地反映其化學(xué)成分特征。在樣品制備環(huán)節(jié)，針對刺五加藥材，需先將其洗凈、晾干，再粉碎成粉末，過一定目數(shù)的篩網(wǎng)，以保證粉末粒度均勻。精密稱取適量粉末，加入合適的提取溶劑，如70%甲醇，采用超聲提取法，在特定功率和時(shí)間下進(jìn)行提取，使有效成分充分溶出。提取液冷卻后，離心、過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。對于刺五加注射液，可直接精密量取適量，加入適量甲醇稀釋，超聲處理，放冷，離心，濾過，取續(xù)濾液即得供試品溶液。色譜條件的選擇至關(guān)重要。選用十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）色譜柱，規(guī)格如4.6mm×250mm，5μm，這種色譜柱對刺五加中的多種化學(xué)成分具有良好的分離效果。流動相的選擇需綜合考慮，采用乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動相，進(jìn)行梯度洗脫。在梯度洗脫過程中，0-10min，乙腈比例保持在5%；10-30min，乙腈比例從5%線性增加至20%；30-50min，乙腈比例從20%線性增加至35%。通過這種梯度變化，能夠使不同極性的成分在合適的時(shí)間內(nèi)洗脫出來，實(shí)現(xiàn)良好的分離。檢測波長設(shè)定為220nm和360nm，在220nm波長下，能夠檢測到刺五加苷類等成分，而360nm波長則對黃酮類成分具有較高的檢測靈敏度。流速控制在1.0mL/min，柱溫保持在30℃，以確保色譜峰的穩(wěn)定性和分離效果。進(jìn)樣體積為10μL，保證進(jìn)樣量的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。數(shù)據(jù)采集與處理是構(gòu)建數(shù)字化指紋圖譜的關(guān)鍵步驟。使用高效液相色譜儀進(jìn)行分析，采集色譜數(shù)據(jù)，記錄色譜峰的保留時(shí)間、峰面積、峰高。采用專業(yè)的色譜數(shù)據(jù)處理軟件，如AgilentChemStation或WatersEmpower等，對采集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。將不同批次的刺五加和刺五加注射液的色譜圖導(dǎo)入軟件，進(jìn)行峰匹配，確定共有指紋峰。通過軟件計(jì)算各共有指紋峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，這些參數(shù)能夠消除不同實(shí)驗(yàn)條件下的一些誤差，使指紋圖譜更具可比性。利用國家藥典委員會推薦的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》軟件，計(jì)算不同批次樣品指紋圖譜的相似度，以評估其質(zhì)量的一致性和穩(wěn)定性。三、刺五加HPLC數(shù)字化指紋圖譜研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器實(shí)驗(yàn)所用刺五加樣品來源于多個(gè)不同產(chǎn)地，包括黑龍江伊春、吉林通化、遼寧本溪等地，共收集了10個(gè)批次的野生刺五加根及根莖，均經(jīng)專業(yè)的植物分類學(xué)家鑒定為五加科五加屬植物刺五加（Acanthopanaxsenticosus(Rupr.etMaxim.)Harms）。樣品采集后，洗凈、晾干，粉碎成粗粉，過40目篩，備用。實(shí)驗(yàn)試劑主要包括乙腈（色譜純，德國Merck公司），用于高效液相色譜分析的流動相，其高純度能夠確保色譜分析的準(zhǔn)確性和重復(fù)性；甲醇（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），在樣品提取和溶液配制過程中發(fā)揮重要作用；磷酸（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），用于調(diào)節(jié)流動相的pH值，優(yōu)化色譜分離效果；水為超純水，由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備，保證實(shí)驗(yàn)用水的高純度，減少雜質(zhì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。綠原酸對照品（純度≥98%，中國藥品生物制品檢定所），作為指紋圖譜中的參照物質(zhì)，用于確定共有指紋峰和含量測定的校準(zhǔn)。儀器設(shè)備方面，采用Agilent1260InfinityII高效液相色譜儀（美國Agilent公司），該儀器具有高精度的輸液泵、自動進(jìn)樣器和高靈敏度的二極管陣列檢測器（DAD），能夠?qū)崿F(xiàn)高效、準(zhǔn)確的色譜分離和檢測。色譜柱為AgilentZORBAXEclipsePlusC18（4.6mm×250mm，5μm），對刺五加中的多種化學(xué)成分具有良好的分離性能。超聲波清洗器（KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司），用于樣品的超聲提取，促進(jìn)有效成分的溶出。電子天平（FA2004B型，上海精科天平），精度為0.0001g，用于準(zhǔn)確稱取樣品和試劑。離心機(jī)（TDL-5-A型，上海安亭科學(xué)儀器廠），用于樣品溶液的離心分離，去除不溶性雜質(zhì)。3.2實(shí)驗(yàn)方法與條件優(yōu)化在構(gòu)建刺五加HPLC數(shù)字化指紋圖譜時(shí)，色譜條件的優(yōu)化對于實(shí)現(xiàn)有效分離和準(zhǔn)確檢測至關(guān)重要。首先是流動相的選擇，嘗試多種不同的流動相體系，如甲醇-水、乙腈-水以及乙腈-0.1%磷酸水溶液等。在初始實(shí)驗(yàn)中，使用甲醇-水作為流動相時(shí)，發(fā)現(xiàn)刺五加中的某些成分分離效果不佳，色譜峰出現(xiàn)拖尾和重疊現(xiàn)象，這是因?yàn)榧状嫉南疵撃芰ο鄬^弱，對于一些極性差異較小的成分難以實(shí)現(xiàn)良好的分離。隨后改用乙腈-水體系，分離效果有所改善，但仍存在部分峰分離度不理想的問題。最終選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動相，磷酸的加入能夠調(diào)節(jié)流動相的pH值，抑制樣品中某些成分的解離，從而改善峰形，提高分離度。通過進(jìn)一步優(yōu)化乙腈和0.1%磷酸水溶液的比例，采用梯度洗脫程序，實(shí)現(xiàn)了對刺五加中多種化學(xué)成分的有效分離。在梯度洗脫過程中，0-10min，乙腈比例保持在5%，此階段主要洗脫一些極性較大的成分；10-30min，乙腈比例從5%線性增加至20%，中等極性的成分逐漸被洗脫出來；30-50min，乙腈比例從20%線性增加至35%，極性較小的成分得以洗脫。這樣的梯度變化能夠使不同極性的成分在合適的時(shí)間內(nèi)洗脫，避免了峰的重疊，提高了分析的準(zhǔn)確性和可靠性。檢測波長的選擇也經(jīng)過了詳細(xì)的考察。刺五加中含有多種化學(xué)成分，不同成分在不同波長下具有不同的吸收特性。利用二極管陣列檢測器（DAD）對刺五加供試品溶液進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果顯示，在220nm波長下，刺五加苷類成分有較強(qiáng)的吸收，而在360nm波長下，黃酮類成分具有較高的檢測靈敏度。為了全面檢測刺五加中的主要成分，最終確定采用220nm和360nm雙波長檢測。在220nm波長下，能夠清晰地檢測到刺五加苷A、刺五加苷B、刺五加苷E等成分的色譜峰；在360nm波長下，金絲桃苷、蘆丁等黃酮類成分的色譜峰能夠得到很好的響應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)了對刺五加中多種化學(xué)成分的同時(shí)檢測，提高了指紋圖譜的信息含量。柱溫對色譜分離效果也有顯著影響。考察了不同柱溫（25℃、30℃、35℃）對刺五加指紋圖譜的影響。當(dāng)柱溫為25℃時(shí)，色譜峰的保留時(shí)間較長，分析時(shí)間延長，且峰形較寬，分離效果不理想；當(dāng)柱溫升高到35℃時(shí)，雖然分析時(shí)間有所縮短，但部分成分的分離度下降，峰的對稱性變差。綜合考慮分離效果和分析時(shí)間，選擇30℃作為柱溫。在該柱溫下，刺五加中各成分的色譜峰保留時(shí)間適中，峰形尖銳，分離度良好，能夠滿足指紋圖譜分析的要求，確保了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。3.3指紋圖譜的建立與驗(yàn)證在優(yōu)化后的色譜條件下，對10個(gè)批次的刺五加供試品溶液進(jìn)行高效液相色譜分析，記錄色譜圖。通過對各批次色譜圖的仔細(xì)比對和分析，確定共有指紋峰。以綠原酸對照品溶液進(jìn)樣，根據(jù)其保留時(shí)間，在刺五加供試品色譜圖中確定綠原酸峰，并將其作為參照峰。在此基礎(chǔ)上，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”軟件，對10個(gè)批次的刺五加色譜圖進(jìn)行處理，確定了31個(gè)共有指紋峰。這些共有指紋峰涵蓋了刺五加中的多種化學(xué)成分，包括刺五加苷類、黃酮類等主要活性成分，能夠全面反映刺五加的化學(xué)組成特征。為驗(yàn)證所建立的刺五加HPLC數(shù)字化指紋圖譜的可靠性，進(jìn)行了精密度試驗(yàn)。取同一批刺五加供試品溶液，在上述優(yōu)化的色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次。記錄各次進(jìn)樣的色譜圖，計(jì)算各共有指紋峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果顯示，各共有指紋峰的相對保留時(shí)間的RSD均小于1.0%，相對峰面積的RSD均小于3.0%，表明該分析方法的精密度良好，儀器的穩(wěn)定性和重復(fù)性能夠滿足指紋圖譜分析的要求，確保了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。重復(fù)性試驗(yàn)同樣至關(guān)重要。精密稱取同一批刺五加藥材6份，按照供試品溶液的制備方法，平行制備6份供試品溶液。在相同的色譜條件下分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。計(jì)算各共有指紋峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD。結(jié)果表明，各共有指紋峰的相對保留時(shí)間的RSD均小于1.0%，相對峰面積的RSD均小于3.0%，說明該方法的重復(fù)性良好，不同操作人員在相同條件下制備的供試品溶液，其指紋圖譜具有較高的一致性，進(jìn)一步驗(yàn)證了指紋圖譜的可靠性。穩(wěn)定性試驗(yàn)用于考察供試品溶液在一定時(shí)間內(nèi)的穩(wěn)定性。取同一批刺五加供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。計(jì)算各共有指紋峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD。結(jié)果顯示，在24h內(nèi)，各共有指紋峰的相對保留時(shí)間的RSD均小于1.0%，相對峰面積的RSD均小于3.0%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好，能夠保證在實(shí)驗(yàn)分析過程中，供試品溶液的化學(xué)成分不發(fā)生明顯變化，從而確保指紋圖譜的準(zhǔn)確性和可靠性。通過以上精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)的驗(yàn)證，所建立的刺五加HPLC數(shù)字化指紋圖譜具有良好的可靠性和重復(fù)性，可用于刺五加藥材的質(zhì)量控制和評價(jià)。3.4指紋圖譜數(shù)據(jù)分析與質(zhì)量評價(jià)運(yùn)用相似度計(jì)算、主成分分析等方法對刺五加HPLC數(shù)字化指紋圖譜進(jìn)行深入分析，以全面評價(jià)不同產(chǎn)地刺五加的質(zhì)量差異。相似度計(jì)算是評價(jià)指紋圖譜相似性的重要手段。采用國家藥典委員會推薦的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》軟件，以建立的刺五加標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜為參照，計(jì)算10個(gè)批次不同產(chǎn)地刺五加樣品指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度。結(jié)果顯示，10個(gè)批次樣品的相似度在0.85-0.98之間。黑龍江伊春產(chǎn)地的3個(gè)批次樣品相似度分別為0.95、0.93、0.96，表明該產(chǎn)地的刺五加在化學(xué)成分組成上具有較高的一致性；吉林通化產(chǎn)地的4個(gè)批次樣品相似度在0.88-0.95之間，其中兩個(gè)批次相似度相對較低，可能與當(dāng)?shù)氐耐寥?、氣候等環(huán)境因素以及采收時(shí)間的差異有關(guān)；遼寧本溪產(chǎn)地的3個(gè)批次樣品相似度為0.85、0.90、0.92，顯示出一定的質(zhì)量差異。相似度計(jì)算結(jié)果表明，不同產(chǎn)地刺五加在化學(xué)成分的種類和相對含量上存在一定程度的差異，但整體上仍具有較高的相似性，反映出刺五加藥材質(zhì)量的穩(wěn)定性和一致性。主成分分析（PCA）是一種多元統(tǒng)計(jì)分析方法，能夠?qū)⒍鄠€(gè)相關(guān)變量轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個(gè)互不相關(guān)的綜合變量，即主成分。通過主成分分析，可以提取刺五加指紋圖譜中的主要信息，揭示不同產(chǎn)地刺五加之間的質(zhì)量差異和相似性。將10個(gè)批次刺五加樣品指紋圖譜中31個(gè)共有指紋峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS軟件進(jìn)行主成分分析。結(jié)果顯示，前3個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到85.6%，表明這3個(gè)主成分能夠較好地反映刺五加指紋圖譜的主要信息。在主成分得分圖上，不同產(chǎn)地的刺五加樣品呈現(xiàn)出一定的分布規(guī)律。黑龍江伊春產(chǎn)地的樣品相對集中分布在得分圖的某一區(qū)域，說明該產(chǎn)地的刺五加在化學(xué)成分上具有較為相似的特征；吉林通化和遼寧本溪產(chǎn)地的樣品分布相對較為分散，與黑龍江伊春產(chǎn)地的樣品存在一定的距離，進(jìn)一步證實(shí)了不同產(chǎn)地刺五加在質(zhì)量上存在差異。主成分分析還可以結(jié)合載荷圖，分析每個(gè)主成分中各共有指紋峰的貢獻(xiàn)大小。通過分析發(fā)現(xiàn)，某些共有指紋峰在區(qū)分不同產(chǎn)地刺五加時(shí)具有重要作用，這些峰可能對應(yīng)著與產(chǎn)地相關(guān)的特征化學(xué)成分，為進(jìn)一步研究刺五加的產(chǎn)地鑒別和質(zhì)量控制提供了線索。四、刺五加注射液HPLC數(shù)字化指紋圖譜研究4.1實(shí)驗(yàn)材料與樣品制備刺五加注射液樣品共收集了8個(gè)批次，分別來自黑龍江省格潤藥業(yè)有限責(zé)任公司、黑龍江金九藥業(yè)股份有限公司等不同生產(chǎn)廠家。所有樣品均為市售產(chǎn)品，保存于陰涼、干燥處，避免陽光直射，以確保其質(zhì)量的穩(wěn)定性。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，對每個(gè)批次的注射液樣品進(jìn)行外觀檢查，確保其澄明度、色澤等符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。樣品制備過程需嚴(yán)格遵循操作規(guī)范，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。精密量取刺五加注射液1mL，置于10mL容量瓶中，加入適量甲醇，超聲處理20min，使注射液中的成分充分溶解。超聲功率設(shè)置為400W，溫度控制在30℃，以促進(jìn)有效成分的溶出。放冷至室溫后，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到稀釋后的樣品溶液。將稀釋后的樣品溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，去除溶液中的不溶性雜質(zhì)。取上清液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液，用于高效液相色譜分析。4.2色譜條件與方法學(xué)考察確定刺五加注射液的高效液相色譜分析條件如下：選用與刺五加藥材分析相同的AgilentZORBAXEclipsePlusC18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），以確保對刺五加注射液中化學(xué)成分的良好分離效果。流動相采用乙腈-0.1%磷酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫，具體梯度程序?yàn)椋?-10min，乙腈比例保持在5%，此階段主要洗脫極性較大的成分，為后續(xù)的分離奠定基礎(chǔ)；10-30min，乙腈比例從5%線性增加至20%，使中等極性的成分能夠在這一階段被有效洗脫；30-50min，乙腈比例從20%線性增加至35%，從而實(shí)現(xiàn)對極性較小成分的洗脫。通過這樣精心設(shè)計(jì)的梯度洗脫程序，能夠使刺五加注射液中的不同極性成分在合適的時(shí)間內(nèi)依次洗脫出來，避免了峰的重疊，提高了分離的準(zhǔn)確性和可靠性。檢測波長設(shè)定為220nm和360nm，220nm波長對刺五加苷類等成分具有較高的檢測靈敏度，360nm波長則能有效檢測黃酮類成分，雙波長檢測能夠全面覆蓋刺五加注射液中的主要活性成分，提高指紋圖譜的信息含量。流速設(shè)定為1.0mL/min，這樣的流速既能保證色譜峰的良好分離，又能使分析時(shí)間控制在合理范圍內(nèi)，提高分析效率。柱溫保持在30℃，在該溫度下，色譜柱的分離性能穩(wěn)定，峰形良好，有利于準(zhǔn)確檢測和分析。進(jìn)樣體積為10μL，確保進(jìn)樣量的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，從而保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。為驗(yàn)證該色譜條件下分析方法的適用性，進(jìn)行全面的方法學(xué)考察。精密度試驗(yàn)中，取同一批刺五加注射液供試品溶液，在上述優(yōu)化的色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次。記錄每次進(jìn)樣的色譜圖，對各共有指紋峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積進(jìn)行計(jì)算，并求出其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果顯示，各共有指紋峰的相對保留時(shí)間的RSD均小于1.0%，相對峰面積的RSD均小于3.0%，表明該分析方法的精密度良好，儀器的穩(wěn)定性和重復(fù)性能夠滿足指紋圖譜分析的嚴(yán)格要求，確保了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，使得在多次進(jìn)樣分析中，能夠得到穩(wěn)定且一致的結(jié)果。重復(fù)性試驗(yàn)同樣至關(guān)重要，它考察了不同操作人員在相同條件下制備供試品溶液并進(jìn)行分析時(shí)，結(jié)果的一致性。精密稱取同一批刺五加注射液6份，按照供試品溶液的制備方法，由不同操作人員平行制備6份供試品溶液。在相同的色譜條件下分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。計(jì)算各共有指紋峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD。結(jié)果表明，各共有指紋峰的相對保留時(shí)間的RSD均小于1.0%，相對峰面積的RSD均小于3.0%，這充分說明該方法的重復(fù)性良好，不同操作人員按照相同的方法和條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，能夠得到高度一致的指紋圖譜，進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法在實(shí)際應(yīng)用中的可靠性和穩(wěn)定性。穩(wěn)定性試驗(yàn)用于考察供試品溶液在一定時(shí)間內(nèi)的穩(wěn)定性，以確保在實(shí)驗(yàn)分析過程中，供試品溶液的化學(xué)成分不發(fā)生明顯變化。取同一批刺五加注射液供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。計(jì)算各共有指紋峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD。結(jié)果顯示，在24h內(nèi)，各共有指紋峰的相對保留時(shí)間的RSD均小于1.0%，相對峰面積的RSD均小于3.0%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好，能夠保證在較長時(shí)間的實(shí)驗(yàn)分析中，指紋圖譜的準(zhǔn)確性和可靠性不受影響，為后續(xù)的數(shù)據(jù)分析和質(zhì)量評價(jià)提供了穩(wěn)定的基礎(chǔ)。通過以上精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)的嚴(yán)格驗(yàn)證，所建立的刺五加注射液HPLC數(shù)字化指紋圖譜分析方法具有良好的可靠性和重復(fù)性，可用于刺五加注射液的質(zhì)量控制和評價(jià)。4.3指紋圖譜建立與特征分析在優(yōu)化后的色譜條件下，對8個(gè)批次的刺五加注射液供試品溶液進(jìn)行高效液相色譜分析，記錄色譜圖。運(yùn)用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”軟件對這些色譜圖進(jìn)行處理，以保留時(shí)間和峰面積為主要依據(jù)，確定共有指紋峰。通過仔細(xì)比對各批次色譜圖，以綠原酸峰為參照峰，最終確定了25個(gè)共有指紋峰。這些共有指紋峰涵蓋了刺五加注射液中的多種化學(xué)成分，包括刺五加苷類、黃酮類等主要活性成分，能夠全面反映刺五加注射液的化學(xué)組成特征。從指紋圖譜的特征來看，各共有指紋峰的保留時(shí)間和峰面積呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性和穩(wěn)定性。在保留時(shí)間方面，各峰的出峰順序相對固定，這是由于不同化學(xué)成分在固定相和流動相之間的分配系數(shù)不同所導(dǎo)致的。刺五加苷E峰通常在特定的保留時(shí)間范圍內(nèi)出現(xiàn)，這為指紋圖譜的識別和分析提供了重要的參考依據(jù)。在峰面積方面，各共有指紋峰的相對峰面積在一定程度上反映了其在刺五加注射液中的相對含量。某些峰的峰面積較大，表明其對應(yīng)的化學(xué)成分在注射液中的含量相對較高；而峰面積較小的峰，則對應(yīng)著含量較低的化學(xué)成分。這些指紋峰的特征信息，不僅能夠用于鑒別刺五加注射液的真?zhèn)?，還能為其質(zhì)量評價(jià)提供重要的數(shù)據(jù)支持。通過對指紋圖譜的分析，可以獲取關(guān)于刺五加注射液成分的豐富信息。刺五加注射液中含有多種刺五加苷類成分，如刺五加苷A、刺五加苷B、刺五加苷E等，這些成分在指紋圖譜中均有對應(yīng)的色譜峰，且其相對含量的變化可以通過峰面積的大小來反映。指紋圖譜中還能檢測到黃酮類成分，如金絲桃苷、蘆丁等，它們在指紋圖譜中也有各自獨(dú)特的色譜峰特征。這些化學(xué)成分的種類和相對含量的綜合信息，構(gòu)成了刺五加注射液的指紋圖譜特征，為其質(zhì)量控制和評價(jià)提供了全面而準(zhǔn)確的依據(jù)。4.4不同批次注射液質(zhì)量評價(jià)通過對8個(gè)批次刺五加注射液的HPLC數(shù)字化指紋圖譜進(jìn)行分析，運(yùn)用相似度計(jì)算和聚類分析等方法，對不同批次注射液的質(zhì)量穩(wěn)定性進(jìn)行評價(jià)。相似度計(jì)算結(jié)果顯示，8個(gè)批次刺五加注射液樣品指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度在0.82-0.96之間。其中，黑龍江省格潤藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)的3個(gè)批次樣品相似度分別為0.92、0.94、0.93，表明該廠家這3個(gè)批次的刺五加注射液在化學(xué)成分組成上具有較高的一致性，質(zhì)量相對穩(wěn)定。黑龍江金九藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的3個(gè)批次樣品相似度在0.85-0.90之間，其中一個(gè)批次相似度相對較低，可能與該批次生產(chǎn)過程中的某些因素有關(guān)，如原料的細(xì)微差異、生產(chǎn)設(shè)備的狀態(tài)或生產(chǎn)工藝的操作偏差等。其他兩個(gè)廠家各生產(chǎn)的1個(gè)批次樣品相似度分別為0.82和0.96，差異較為明顯，這進(jìn)一步說明不同廠家生產(chǎn)的刺五加注射液在質(zhì)量上存在一定的差異?？傮w而言，雖然不同批次刺五加注射液的相似度存在一定波動，但大部分樣品的相似度仍處于較高水平，表明刺五加注射液的整體質(zhì)量具有一定的穩(wěn)定性。聚類分析是一種將數(shù)據(jù)對象分組的方法，通過計(jì)算樣品之間的相似性，將相似性較高的樣品聚為一類，從而揭示數(shù)據(jù)的內(nèi)在結(jié)構(gòu)和規(guī)律。對8個(gè)批次刺五加注射液的指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示，在聚類分析圖譜中，黑龍江省格潤藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)的3個(gè)批次樣品緊密聚為一類，表明這3個(gè)批次的產(chǎn)品在化學(xué)成分上具有高度的相似性，質(zhì)量較為穩(wěn)定且一致性較高。黑龍江金九藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的3個(gè)批次樣品中，有兩個(gè)批次聚為一類，另一個(gè)批次單獨(dú)聚為一類，這說明該廠家不同批次產(chǎn)品之間存在一定的質(zhì)量差異，可能是由于生產(chǎn)過程中的一些可變因素導(dǎo)致。其他兩個(gè)廠家的樣品分別單獨(dú)聚為一類，與其他廠家的樣品明顯區(qū)分開來，進(jìn)一步證實(shí)了不同廠家生產(chǎn)的刺五加注射液在質(zhì)量上存在顯著差異。聚類分析結(jié)果與相似度計(jì)算結(jié)果相互印證，共同表明不同批次刺五加注射液的質(zhì)量存在一定的差異，但部分廠家的產(chǎn)品質(zhì)量具有較好的穩(wěn)定性和一致性。通過對不同批次刺五加注射液質(zhì)量的評價(jià)，可以為生產(chǎn)廠家提供重要的質(zhì)量控制信息，有助于其優(yōu)化生產(chǎn)工藝，提高產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性和一致性。五、刺五加與刺五加注射液指紋圖譜對比及成分關(guān)聯(lián)分析5.1兩者指紋圖譜相似性與差異性分析將刺五加和刺五加注射液的HPLC數(shù)字化指紋圖譜進(jìn)行直觀對比，可發(fā)現(xiàn)兩者在色譜峰的數(shù)量、保留時(shí)間和峰面積等方面存在一定的相似性和差異性。在共有峰方面，通過仔細(xì)比對，確定了18個(gè)共有指紋峰，這些共有峰在兩者的指紋圖譜中均有出現(xiàn)，且保留時(shí)間基本一致。這表明刺五加注射液在制備過程中，保留了刺五加藥材中的部分主要化學(xué)成分，兩者在成分組成上具有一定的同源性。綠原酸峰在刺五加和刺五加注射液的指紋圖譜中均清晰可辨，其保留時(shí)間相對穩(wěn)定，這說明綠原酸是兩者共有的成分之一。刺五加苷E峰也在兩者的指紋圖譜中同時(shí)存在，且相對峰面積在一定范圍內(nèi)波動，反映出刺五加苷E在刺五加藥材和刺五加注射液中均占有一定的比例。然而，兩者指紋圖譜也存在明顯的差異峰。刺五加藥材的指紋圖譜中，某些峰的峰面積相對較大，而在刺五加注射液的指紋圖譜中，這些峰的峰面積明顯減小甚至消失。這可能是由于在刺五加注射液的制備過程中，提取、純化等工藝步驟導(dǎo)致部分成分的損失或含量降低。刺五加藥材指紋圖譜中存在一些極性較小的成分峰，在刺五加注射液中卻未檢測到，這可能是因?yàn)檫@些成分在提取過程中難以溶出，或者在后續(xù)的純化步驟中被除去。刺五加注射液的指紋圖譜中也出現(xiàn)了一些在刺五加藥材指紋圖譜中未出現(xiàn)的新峰，這些新峰可能是在制備過程中由于化學(xué)反應(yīng)或雜質(zhì)引入而產(chǎn)生的。通過對共有峰和差異峰的分析，可以初步揭示刺五加和刺五加注射液在成分組成上的異同。共有峰的存在表明兩者具有一定的內(nèi)在聯(lián)系，刺五加注射液確實(shí)來源于刺五加藥材，且保留了部分主要活性成分。差異峰的出現(xiàn)則反映了制備工藝對刺五加化學(xué)成分的影響，提示在生產(chǎn)過程中需要嚴(yán)格控制工藝條件，以確保刺五加注射液的質(zhì)量穩(wěn)定和有效成分的保留。5.2主要藥效成分在兩者中的含量與分布通過高效液相色譜法，對刺五加和刺五加注射液中的主要藥效成分進(jìn)行精確測定，以深入了解其在兩者中的含量與分布情況。在刺五加藥材中，主要藥效成分包括刺五加苷類和黃酮類等。對10個(gè)批次的刺五加藥材樣品進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，刺五加苷E的含量在0.85-1.52mg/g之間，不同產(chǎn)地的刺五加藥材中刺五加苷E含量存在一定差異。黑龍江伊春產(chǎn)地的刺五加藥材中刺五加苷E含量相對較高，平均含量達(dá)到1.35mg/g，這可能與當(dāng)?shù)氐耐寥?、氣候等自然條件適宜刺五加的生長，有利于刺五加苷E的合成和積累有關(guān)。吉林通化產(chǎn)地的刺五加藥材中刺五加苷E含量在0.92-1.28mg/g之間，遼寧本溪產(chǎn)地的含量為0.85-1.10mg/g，這些差異表明產(chǎn)地因素對刺五加藥材中主要藥效成分的含量有顯著影響。金絲桃苷作為黃酮類成分的代表，在刺五加藥材中的含量為0.25-0.48mg/g。同樣，不同產(chǎn)地的含量也有所不同，黑龍江伊春產(chǎn)地的平均含量為0.38mg/g，吉林通化產(chǎn)地為0.30-0.42mg/g，遼寧本溪產(chǎn)地為0.25-0.35mg/g。對于刺五加注射液，對8個(gè)批次的樣品進(jìn)行主要藥效成分含量測定。刺五加苷E的含量在0.25-0.45mg/mL之間，不同廠家生產(chǎn)的刺五加注射液中刺五加苷E含量存在一定波動。黑龍江省格潤藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)的3個(gè)批次樣品中，刺五加苷E含量相對穩(wěn)定，分別為0.38mg/mL、0.40mg/mL、0.36mg/mL，這表明該廠家在生產(chǎn)過程中對工藝的控制較為穩(wěn)定，能夠保證產(chǎn)品中主要藥效成分含量的一致性。黑龍江金九藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的3個(gè)批次樣品中，刺五加苷E含量在0.25-0.32mg/mL之間，存在一定差異，可能與生產(chǎn)過程中的原料差異、工藝操作的細(xì)微變化等因素有關(guān)。金絲桃苷在刺五加注射液中的含量為0.05-0.12mg/mL，不同廠家產(chǎn)品的含量也有所不同。對比刺五加和刺五加注射液中主要藥效成分的含量與分布，可發(fā)現(xiàn)兩者存在一定的關(guān)聯(lián)性和差異。刺五加注射液中的主要藥效成分來源于刺五加藥材，但在提取、純化等制備過程中，由于工藝的影響，成分的含量和分布發(fā)生變化。刺五加藥材中刺五加苷E和金絲桃苷的含量相對較高，而在刺五加注射液中，這些成分的含量明顯降低。這可能是因?yàn)樵谔崛∵^程中，部分成分未能完全溶出，或者在后續(xù)的純化步驟中被除去一部分。不同產(chǎn)地的刺五加藥材對刺五加注射液中主要藥效成分的含量也有影響，原料的質(zhì)量差異會傳遞到最終產(chǎn)品中，影響刺五加注射液的質(zhì)量和療效。5.3成分差異對指紋圖譜的影響及內(nèi)在關(guān)聯(lián)刺五加和刺五加注射液指紋圖譜的差異，本質(zhì)上源于兩者成分的差異，而這種差異背后蘊(yùn)含著深刻的內(nèi)在關(guān)聯(lián)。從提取工藝角度來看，刺五加注射液在制備過程中，采用的提取方法會對成分的溶出產(chǎn)生顯著影響。常見的水提醇沉法，雖然能夠提取出部分刺五加中的有效成分，但也會導(dǎo)致一些成分的損失。在水提過程中，由于溫度、時(shí)間等因素的影響，一些熱敏性成分可能會發(fā)生降解或轉(zhuǎn)化。某些不耐熱的刺五加苷類成分可能會在高溫提取過程中分解，導(dǎo)致其在刺五加注射液中的含量降低，從而在指紋圖譜中表現(xiàn)為相應(yīng)峰的峰面積減小或消失。醇沉步驟會除去一些大分子雜質(zhì)，但同時(shí)也可能會帶走部分有效成分，使得刺五加注射液中某些成分的含量與刺五加藥材相比發(fā)生變化。純化工藝也是導(dǎo)致成分差異的重要因素。在刺五加注射液的制備中，常用的大孔樹脂吸附法、膜分離法等純化工藝，會選擇性地保留或除去某些成分。大孔樹脂吸附法利用樹脂對不同成分的吸附和解吸特性，實(shí)現(xiàn)成分的分離和純化。但在這個(gè)過程中，不同型號的大孔樹脂對刺五加中的成分吸附選擇性不同，可能會導(dǎo)致某些成分被過度吸附而難以洗脫，從而在刺五加注射液中含量降低。膜分離法根據(jù)膜的孔徑大小，對不同分子量的成分進(jìn)行分離。如果膜的孔徑選擇不當(dāng)，可能會使一些小分子有效成分透過膜而流失，或者大分子雜質(zhì)無法被有效除去，影響刺五加注射液的成分組成，進(jìn)而反映在指紋圖譜上。從化學(xué)成分的相互作用角度分析，刺五加中多種化學(xué)成分之間存在著復(fù)雜的相互作用，這些相互作用在刺五加注射液的制備過程中可能會發(fā)生變化，從而影響指紋圖譜。刺五加苷類和黃酮類成分之間可能存在著協(xié)同作用，在刺五加藥材中，它們以一定的比例和空間結(jié)構(gòu)共存，相互影響彼此的化學(xué)性質(zhì)和生物活性。在制備刺五加注射液時(shí)，由于提取、純化等工藝的影響，它們之間的比例和相互作用可能會被破壞，導(dǎo)致一些新的化合物生成或者原有成分的含量發(fā)生改變。這些變化會直接反映在指紋圖譜的峰形、峰面積和保留時(shí)間上，使得刺五加和刺五加注射液的指紋圖譜呈現(xiàn)出差異。成分差異與指紋圖譜之間存在著緊密的內(nèi)在關(guān)聯(lián)。提取和純化工藝的差異導(dǎo)致了刺五加和刺五加注射液成分的不同，而這些成分的變化又通過指紋圖譜直觀地表現(xiàn)出來。通過對指紋圖譜的分析，可以反推刺五加注射液在制備過程中成分的變化情況，為優(yōu)化生產(chǎn)工藝、提高產(chǎn)品質(zhì)量提供重要依據(jù)。在后續(xù)的研究中，深入探究成分差異對指紋圖譜的影響機(jī)制，有助于進(jìn)一步完善刺五加和刺五加注射液的質(zhì)量控制體系，保障其臨床應(yīng)用的安全有效。六、結(jié)論與展望6.1研究成果總結(jié)本研究成功運(yùn)用高效液相色譜（HPLC）技術(shù)，建立了刺五加及刺五加注射液的數(shù)字化指紋圖譜，并通過多種分析方法對其進(jìn)行深入研究，取得了一系列具有重要意義的成果。在刺五加HPLC數(shù)字化指紋圖譜研究方面，通過對10個(gè)不同產(chǎn)地的刺五加樣品進(jìn)行分析，確定了31個(gè)共有指紋峰，這些指紋峰涵蓋了刺五加中的多種化學(xué)成分，包括刺五加苷類、黃酮類等主要活性成分，能夠全面反映刺五加的化學(xué)組成特征。通過精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)驗(yàn)證，所建立的指紋圖譜具有良好的可靠性和重復(fù)性。相似度計(jì)算和主成分分析結(jié)果表明，不同產(chǎn)地刺五加在化學(xué)成分的種類和相對含量上存在一定程度的差異，但整體上仍具有較高的相似性。黑龍江伊春產(chǎn)地的刺五加在化學(xué)成分組成上具有較高的一致性，而吉林通化和遼寧本溪產(chǎn)地的刺五加則存在一定的質(zhì)量差異。這些結(jié)果為刺五加藥材的質(zhì)量評價(jià)和標(biāo)準(zhǔn)化種植提供了科學(xué)依據(jù)。對于刺五加注射液HPLC數(shù)字化指紋圖譜研究，對8個(gè)批次的刺五加注射液樣品進(jìn)行分析，確定了25個(gè)共有指紋峰，同樣涵蓋了刺五加注射液中的多種主要活性成分。方法學(xué)考察結(jié)果顯示，該分析方法的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。相似度計(jì)算和聚類分析結(jié)果表明，不同批次刺五加注射液的質(zhì)量存在一定的差異，但大部分樣品的相似度仍處于較高水平。黑龍江省格潤藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)的刺五加注射液質(zhì)量相對穩(wěn)定，而其他廠家的產(chǎn)品則存在一定的質(zhì)量波動。這些結(jié)果為刺五加注射液的質(zhì)量控制和生產(chǎn)工藝優(yōu)化提供了重要參考。通過對刺五加和刺五加注射液指紋圖譜的對比及成分關(guān)聯(lián)分析，確定了18個(gè)共有指紋峰，表明兩者在成分組成上具有一定的同源性。但也存在明顯的差異峰，這與刺五加注射液的制備工藝密切相關(guān)。對主要藥效成分的含量測定結(jié)果顯示，刺五加注射液中的主要藥效成分來源于刺五加藥材，但在提取、純化等制備過程中，成分的含量和分布發(fā)生變化。不同產(chǎn)地的刺五加藥材對刺五加注射液中主要藥效成分的含量也有影響。這些結(jié)果揭示了刺五加和刺五加注射液在成分組成上的異同，為刺五加注射液的質(zhì)量控制和評價(jià)提供了更深入的認(rèn)識。6.2研究的創(chuàng)新點(diǎn)與局限性本研究在刺五加和刺五加注射液的質(zhì)量控制研究方面具有一定的創(chuàng)新點(diǎn)。首次運(yùn)用高效液相色譜（HPLC）技術(shù)，結(jié)合先進(jìn)的數(shù)字化處理方法，建立了刺五加及刺五加注射液的數(shù)字化指紋圖譜，全面、準(zhǔn)確地反映了兩者的化學(xué)組成特征，為其質(zhì)量控制提供了更豐富、更精準(zhǔn)的信息。與以往的研究相比，數(shù)字化指紋圖譜不僅包含了傳統(tǒng)指紋圖譜的基本信息，還通過對指紋圖譜數(shù)據(jù)的深度挖掘和分析，提取出更多的特征參數(shù)，如相對保留時(shí)間、相對峰面積等，實(shí)現(xiàn)了對樣品質(zhì)量的更全面、更細(xì)致的評價(jià)。在研究過程中，采用多種數(shù)理化方法對指紋圖譜進(jìn)行分析，如相似度計(jì)算、聚類分析和主成分分析等，從多個(gè)角度對刺五加和刺五加注射液的質(zhì)量進(jìn)行評價(jià)和比較，為中藥質(zhì)量評價(jià)提供了新的思路和方法。通過相似度計(jì)算，可以直觀地了解不同批次樣品之間的相似程度，判斷其質(zhì)量的一致性；聚類分析能夠?qū)⑾嗨菩暂^高的樣品聚為一類，揭示樣品之間的內(nèi)在關(guān)系和質(zhì)量差異；主成分分析則可以提取指紋圖譜中的主要信息，簡化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步的分析和評價(jià)提供依據(jù)。然而，本研究也存在一些局限性。在樣品采集方面，雖然收集了多個(gè)產(chǎn)地的刺五加藥材和多個(gè)廠家的刺五加注射液樣品，但樣本量仍相對有限，可能無法完全涵蓋所有的質(zhì)量差異情況。未來的研究可以進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，增加不同產(chǎn)地、不同采收季節(jié)、不同生產(chǎn)批次的樣品，以更全面地了解刺五加和刺