基于ELP-Hsp90α融合蛋白的IBDV濃縮與純化新策略及應(yīng)用探索一、引言1.1研究背景與意義傳染性法氏囊病病毒（InfectiousBursalDiseaseVirus，IBDV）作為一種對養(yǎng)禽業(yè)極具破壞力的病原體，給全球家禽養(yǎng)殖帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。IBDV主要感染雞，尤其是雛雞，可導(dǎo)致其免疫系統(tǒng)嚴(yán)重受損，法氏囊作為禽類重要的免疫器官，在感染IBDV后會發(fā)生萎縮、壞死等病變，使雞體的免疫功能下降，不僅增加了其他病原體的感染風(fēng)險，還會影響疫苗的免疫效果，導(dǎo)致養(yǎng)殖成本大幅上升，嚴(yán)重威脅著養(yǎng)禽業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。在IBDV的研究以及相關(guān)疫苗的制備過程中，病毒的濃縮與純化是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。通過有效的濃縮與純化手段，可以獲取高純度的病毒樣本，這對于深入研究病毒的生物學(xué)特性、致病機(jī)制、遺傳變異等方面具有不可或缺的作用。同時，高純度的病毒也是制備高質(zhì)量疫苗的關(guān)鍵原料，能夠提高疫苗的免疫原性和安全性，從而為養(yǎng)禽業(yè)提供更有效的疫病防控手段。然而，傳統(tǒng)的IBDV濃縮與純化方法，如氯仿抽提、聚乙二醇沉淀、差速離心、密度梯度離心和親和層析等，普遍存在著費時、費力、回收率低以及費用高等缺點，限制了其在實際應(yīng)用中的效果和范圍。近年來，病毒受體結(jié)合捕捉技術(shù)作為一種新型的病毒濃縮與純化方法嶄露頭角。其原理是利用病毒與受體結(jié)合的特異性，通過病毒受體蛋白偶聯(lián)的固相載體從復(fù)雜樣品中捕獲病毒。熱應(yīng)激蛋白90α（Hsp90α）作為IBDV的受體復(fù)合物成分，能夠與病毒顆粒及其VP2蛋白緊密結(jié)合，因此具備作為捕捉IBDV誘餌蛋白的潛力。而類彈性蛋白多肽（ELP）則是一種具有獨特溫度敏感可逆相變特性的聚合物，在低于相變溫度時呈溶解狀態(tài)，高于相變溫度時呈凝聚狀態(tài)。本研究聚焦于ELP-Hsp90α融合蛋白，旨在將兩者的優(yōu)勢相結(jié)合，探索一種全新的IBDV濃縮和純化方法。這種創(chuàng)新性的研究思路，有望克服傳統(tǒng)方法的諸多弊端，為IBDV的研究和疫苗制備提供更加高效、經(jīng)濟(jì)、便捷的技術(shù)手段，具有廣闊的應(yīng)用前景和重要的實踐意義。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在IBDV濃縮和純化方法的探索歷程中，傳統(tǒng)方法如氯仿抽提，利用氯仿的脂溶性來去除樣品中的脂類物質(zhì)，從而實現(xiàn)病毒的初步分離，但該過程中病毒易受到化學(xué)物質(zhì)的影響，活性難以保證，且操作步驟繁瑣，需要多次離心和分液。聚乙二醇沉淀則是通過改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度和聚合物濃度，使病毒顆粒沉淀下來，不過這種方法的回收率有限，往往會損失大量的病毒，且沉淀后的病毒純度不高，后續(xù)還需要進(jìn)一步的純化步驟。差速離心依據(jù)病毒與其他雜質(zhì)在密度和沉降系數(shù)上的差異，通過不同轉(zhuǎn)速的離心操作來實現(xiàn)分離，但對于大小和密度相近的雜質(zhì)與病毒，分離效果欠佳，且長時間的離心過程可能會對病毒結(jié)構(gòu)造成破壞。密度梯度離心雖然能夠較為精確地分離出病毒，但需要特殊的設(shè)備和昂貴的試劑，成本較高，操作也較為復(fù)雜，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。親和層析利用病毒與特異性配體之間的親和作用進(jìn)行分離，特異性強(qiáng)，但配體的制備和固定化過程較為困難，且成本高昂，難以推廣使用。這些傳統(tǒng)方法在實際應(yīng)用中都暴露出了各自的局限性，難以滿足當(dāng)前IBDV研究和疫苗制備對病毒濃縮和純化的高效、經(jīng)濟(jì)、高純度的需求。近年來，隨著對病毒與受體相互作用機(jī)制研究的深入，病毒受體結(jié)合捕捉技術(shù)應(yīng)運而生。Hsp90α作為IBDV的受體復(fù)合物成分，能夠特異性地與病毒顆粒及其VP2蛋白結(jié)合，為IBDV的濃縮和純化提供了新的思路。國內(nèi)外學(xué)者對Hsp90α在病毒結(jié)合方面的特性進(jìn)行了一定的研究，發(fā)現(xiàn)其與IBDV的結(jié)合具有較高的親和力和特異性，但對于如何將Hsp90α有效地應(yīng)用于IBDV的濃縮和純化，以及如何優(yōu)化結(jié)合和洗脫條件，以提高病毒的回收率和純度，仍處于探索階段。在其他病毒研究領(lǐng)域，Hsp90α也曾被嘗試用于病毒的濃縮和純化，取得了一些初步成果，但在IBDV領(lǐng)域的應(yīng)用還相對較少，相關(guān)技術(shù)和方法尚未成熟。類彈性蛋白多肽（ELP）因其獨特的溫度敏感可逆相變特性，在蛋白質(zhì)分離和純化領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的潛力。當(dāng)溶液溫度低于其相變溫度時，ELP處于溶解狀態(tài)，能夠與目標(biāo)分子充分混合；而當(dāng)溫度升高超過相變溫度，ELP會發(fā)生凝聚，從而實現(xiàn)與目標(biāo)分子的分離。這一特性使得ELP在蛋白質(zhì)的分離過程中無需使用復(fù)雜的色譜柱和昂貴的試劑，操作簡單、成本低廉。在過去的研究中，ELP已被成功應(yīng)用于多種蛋白質(zhì)的純化，如酶、抗體等，并且在一些病毒的濃縮和純化中也取得了一定的進(jìn)展，例如在重組腺病毒的濃縮與純化中，ELP與腺病毒受體融合蛋白建立了簡單、經(jīng)濟(jì)的方法。然而，將ELP與Hsp90α融合用于IBDV的濃縮和純化，目前還處于起步階段，相關(guān)的研究報道較少。對于ELP與Hsp90α融合后，ELP的相變特性是否會受到影響，以及融合蛋白對IBDV的結(jié)合能力和特異性如何，都有待進(jìn)一步的研究和驗證?；贓LP-Hsp90α融合蛋白的IBDV濃縮和純化方法的研究，雖然具有創(chuàng)新性和潛在的應(yīng)用價值，但目前仍存在諸多不足。一方面，對于融合蛋白的表達(dá)和純化工藝，還需要進(jìn)一步優(yōu)化，以提高融合蛋白的表達(dá)量和純度，降低生產(chǎn)成本。另一方面，在融合蛋白與IBDV的結(jié)合條件、洗脫條件等方面，還缺乏系統(tǒng)的研究，需要深入探索以確定最佳的實驗參數(shù)，從而提高病毒的濃縮和純化效率。此外，該方法在實際樣品中的應(yīng)用效果，以及對不同毒株IBDV的適用性，也需要進(jìn)行更多的實驗驗證和評估。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在建立一種基于ELP-Hsp90α融合蛋白的高效、經(jīng)濟(jì)、簡便的IBDV濃縮和純化方法，并對該方法的應(yīng)用效果進(jìn)行深入探究，為IBDV的研究和疫苗制備提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。具體研究內(nèi)容如下：確定ELP-Hsp90α融合蛋白的最佳表達(dá)條件：采用融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建ELP-Hsp90α融合蛋白表達(dá)菌株。通過對誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)溫度等關(guān)鍵因素進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，確定最佳表達(dá)條件，以實現(xiàn)融合蛋白的高效可溶性表達(dá)。同時，運用SDS-PAGE和Westernblot等技術(shù)，對融合蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行準(zhǔn)確分析和驗證，確保表達(dá)產(chǎn)物的質(zhì)量和純度符合后續(xù)實驗要求。對ELP-Hsp90α融合蛋白進(jìn)行純化：運用Ni-IMAC（鎳離子親和層析）以及其他有效的分離技術(shù)，對表達(dá)的ELP-Hsp90α融合蛋白進(jìn)行純化。在純化過程中，通過優(yōu)化洗脫條件，如洗脫液的pH值、離子強(qiáng)度等，提高融合蛋白的純度和回收率。利用蛋白質(zhì)定量分析方法，如BCA法（bicinchoninicacidassay），精確測定純化后融合蛋白的濃度，為后續(xù)的病毒濃縮和純化實驗提供充足且高質(zhì)量的融合蛋白。利用ELP-Hsp90α融合蛋白進(jìn)行IBDV病毒的濃縮和純化：將純化后的ELP-Hsp90α融合蛋白與IBDV病毒樣本充分混合，在適宜的條件下進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。通過對結(jié)合時間、溫度、融合蛋白與病毒的比例等條件進(jìn)行優(yōu)化，提高融合蛋白對IBDV的捕獲效率。利用ELP的溫度敏感可逆相變特性，通過改變溫度使融合蛋白與病毒共同凝聚，實現(xiàn)病毒的初步濃縮。隨后，通過優(yōu)化洗脫條件，如選擇合適的洗脫液和洗脫方式，將結(jié)合在融合蛋白上的病毒高效洗脫下來，從而獲得高純度的IBDV。運用SDS-PAGE和Westernblot等技術(shù)，對濃縮和純化后的病毒進(jìn)行分析和驗證，檢測病毒的純度和完整性，確保病毒的生物學(xué)活性不受影響。探討利用ELP-Hsp90α融合蛋白進(jìn)行病毒濃縮和純化的優(yōu)勢以及在病毒研究領(lǐng)域中的應(yīng)用價值：與傳統(tǒng)的IBDV濃縮和純化方法進(jìn)行全面對比，從操作流程的繁簡程度、成本高低、病毒回收率和純度、對病毒活性的影響等多個方面，深入分析基于ELP-Hsp90α融合蛋白方法的優(yōu)勢。將濃縮和純化后的IBDV應(yīng)用于病毒的生物學(xué)特性研究，如病毒的復(fù)制機(jī)制、致病機(jī)理等；應(yīng)用于疫苗制備研究，評估該方法制備的病毒作為疫苗抗原的免疫原性和安全性，為IBDV疫苗的研發(fā)提供新的技術(shù)手段和理論依據(jù)，進(jìn)一步拓展該方法在病毒研究領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究綜合運用分子生物學(xué)、生物化學(xué)等多學(xué)科實驗方法，以確保研究的科學(xué)性和可靠性，具體技術(shù)路線如下：構(gòu)建ELP-Hsp90α融合蛋白表達(dá)菌株：依據(jù)Hsp90α基因序列，設(shè)計并合成特異性引物，通過PCR技術(shù)從相應(yīng)的基因文庫或模板中擴(kuò)增出Hsp90α基因片段。同時，獲取含有ELP基因的表達(dá)載體，利用限制性內(nèi)切酶對Hsp90α基因片段和ELP表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切處理，使兩者產(chǎn)生互補(bǔ)的粘性末端。將酶切后的Hsp90α基因片段與ELP表達(dá)載體在DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建出重組表達(dá)質(zhì)粒pELP-Hsp90α。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中，如常用的BL21(DE3)菌株，通過涂布含有相應(yīng)抗生素的LB平板，篩選出陽性克隆。對陽性克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定、酶切鑒定以及測序分析，確保重組表達(dá)質(zhì)粒的正確性和完整性，從而成功構(gòu)建ELP-Hsp90α融合蛋白表達(dá)菌株。優(yōu)化ELP-Hsp90α融合蛋白表達(dá)條件：將構(gòu)建好的表達(dá)菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，添加適量的抗生素以維持重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性，在37℃、220rpm的條件下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。向培養(yǎng)體系中加入不同濃度的IPTG（如0.1mM、0.5mM、1.0mM等）作為誘導(dǎo)劑，分別在不同溫度（如16℃、25℃、37℃）下誘導(dǎo)不同時間（如4h、6h、8h、12h等），以探究誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)溫度對融合蛋白表達(dá)的影響。誘導(dǎo)結(jié)束后，通過離心收集菌體，用適量的PBS緩沖液重懸菌體，進(jìn)行超聲破碎處理，使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)釋放出來。離心收集上清液和沉淀，分別進(jìn)行SDS-PAGE分析，比較不同誘導(dǎo)條件下融合蛋白在上清液（可溶性表達(dá)）和沉淀（包涵體形式表達(dá)）中的分布情況，確定最佳的誘導(dǎo)條件，以實現(xiàn)ELP-Hsp90α融合蛋白的高效可溶性表達(dá)。純化ELP-Hsp90α融合蛋白：利用Ni-IMAC進(jìn)行初步純化。將超聲破碎后的上清液與預(yù)先平衡好的Ni-NTA親和層析柱充分結(jié)合，由于ELP-Hsp90α融合蛋白帶有His-tag標(biāo)簽，能夠與Ni-NTA樹脂特異性結(jié)合，而其他雜蛋白則不結(jié)合或結(jié)合較弱，從而實現(xiàn)初步分離。用含有不同咪唑濃度（如20mM、50mM、100mM、200mM等）的洗脫緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集不同洗脫峰的蛋白樣品，通過SDS-PAGE分析確定融合蛋白的洗脫峰位置，收集純度較高的融合蛋白洗脫液。為進(jìn)一步提高融合蛋白的純度，可采用凝膠過濾層析或離子交換層析等方法進(jìn)行二次純化。將Ni-IMAC純化后的融合蛋白樣品上樣到凝膠過濾層析柱或離子交換層析柱上，根據(jù)融合蛋白與其他雜質(zhì)在分子大小、電荷性質(zhì)等方面的差異，進(jìn)行分離純化。收集目標(biāo)蛋白洗脫峰，通過SDS-PAGE和Westernblot驗證融合蛋白的純度和特異性，利用BCA法測定純化后融合蛋白的濃度，為后續(xù)實驗提供高質(zhì)量的融合蛋白。利用ELP-Hsp90α融合蛋白濃縮和純化IBDV：將純化后的ELP-Hsp90α融合蛋白與含有IBDV的病毒樣本（如感染IBDV的雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清、感染雞的組織勻漿等）按不同比例（如1:10、1:50、1:100等）混合，在不同溫度（如4℃、25℃、37℃）下孵育不同時間（如30min、1h、2h等），以探究融合蛋白與病毒的最佳結(jié)合條件。孵育結(jié)束后，將混合液置于高于ELP相變溫度（如37℃）的環(huán)境中，使ELP-Hsp90α融合蛋白與結(jié)合的病毒共同凝聚，通過離心收集凝聚物，實現(xiàn)病毒的初步濃縮。用適量的洗脫緩沖液（如含有特定鹽濃度、pH值的緩沖液）重懸凝聚物，在適宜條件下孵育一段時間，使病毒從融合蛋白上洗脫下來。通過離心去除未洗脫的融合蛋白，收集上清液，即得到初步純化的病毒液。為進(jìn)一步提高病毒的純度，可重復(fù)上述濃縮和純化步驟1-2次。對最終純化得到的病毒液進(jìn)行SDS-PAGE和Westernblot分析，檢測病毒的純度和完整性，通過病毒滴度測定、感染性實驗等方法，評估病毒的生物學(xué)活性。評估基于ELP-Hsp90α融合蛋白的IBDV濃縮和純化方法的優(yōu)勢與應(yīng)用價值：選取傳統(tǒng)的IBDV濃縮和純化方法，如氯仿抽提結(jié)合差速離心法、聚乙二醇沉淀結(jié)合密度梯度離心法、親和層析法等，與基于ELP-Hsp90α融合蛋白的方法進(jìn)行對比。從操作流程的復(fù)雜程度、所需時間、成本（包括試劑成本、設(shè)備成本等）、病毒回收率（通過測定起始病毒量和最終純化病毒量計算）、病毒純度（通過SDS-PAGE、Westernblot等方法評估）、對病毒活性的影響（通過病毒滴度測定、感染性實驗等評估）等多個方面進(jìn)行詳細(xì)分析和比較，明確基于ELP-Hsp90α融合蛋白方法的優(yōu)勢和不足。將基于ELP-Hsp90α融合蛋白方法純化得到的IBDV應(yīng)用于病毒生物學(xué)特性研究，如研究病毒的吸附、侵入、復(fù)制、裝配和釋放等過程；應(yīng)用于疫苗制備研究，將純化病毒作為抗原免疫實驗動物（如SPF雞），定期采集血清，通過ELISA、中和試驗等方法檢測抗體水平，評估免疫原性；通過攻毒實驗，觀察動物的發(fā)病情況、死亡率等，評估疫苗的保護(hù)效果和安全性，為IBDV疫苗的研發(fā)提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1傳染性法氏囊病病毒（IBDV）傳染性法氏囊病病毒（IBDV）在病毒分類學(xué)中歸屬于雙RNA病毒科、禽雙RNA病毒屬，是引發(fā)禽類傳染性法氏囊病的病原體，這種疾病對禽類的免疫系統(tǒng)造成嚴(yán)重破壞，特別是對雛雞和青年雞，危害極大，常常給養(yǎng)禽業(yè)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)損失。IBDV粒子呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)，無囊膜包裹，直徑大致在60-70nm之間。其結(jié)構(gòu)精細(xì)復(fù)雜，由核心、內(nèi)衣殼和外衣殼三層緊密組合而成。核心部分蘊藏著病毒的基因組，以獨特的雙股RNA形式存在，這是病毒遺傳信息的攜帶者，決定了病毒的生物學(xué)特性和致病能力。內(nèi)衣殼由VP3蛋白構(gòu)建而成，VP3蛋白不僅在維持病毒結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，還具備RNA聚合酶活性，在病毒的復(fù)制過程中扮演著不可或缺的角色，參與病毒核酸的合成。外衣殼則主要由VP2蛋白組成，VP2蛋白作為病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，是病毒與外界環(huán)境相互作用的關(guān)鍵界面，其抗原性直接影響著病毒的免疫原性和致病性，也是病毒感染宿主細(xì)胞以及引發(fā)宿主免疫反應(yīng)的重要決定因素。IBDV的基因組由A、B兩個片段RNA構(gòu)成，各有獨特的功能和作用。A片段相對較大，其上包含多個重要的開放閱讀框，其中較大的一個編碼一個聚合蛋白及VP4。聚合蛋白在后續(xù)的加工過程中，會被精確切割形成VP2和VP3兩個關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)蛋白。VP2由于其特殊的氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)，成為病毒抗原變異的主要發(fā)生位點。病毒在傳播和進(jìn)化過程中，VP2蛋白的氨基酸序列可能會發(fā)生改變，導(dǎo)致其抗原性發(fā)生變化，這不僅使得病毒能夠逃避宿主免疫系統(tǒng)的識別和攻擊，也給疫苗的研發(fā)和防控工作帶來了巨大挑戰(zhàn)。B片段則主要編碼VP1蛋白，VP1作為病毒的RNA依賴RNA聚合酶，在病毒的核酸復(fù)制過程中發(fā)揮著核心催化作用，它能夠以病毒的RNA為模板，準(zhǔn)確地合成新的RNA鏈，確保病毒遺傳信息的傳遞和復(fù)制。IBDV主要通過感染禽類的法氏囊，引發(fā)一系列嚴(yán)重的病理變化。法氏囊作為禽類重要的中樞免疫器官，是B淋巴細(xì)胞分化、發(fā)育和成熟的關(guān)鍵場所。IBDV入侵法氏囊后，會特異性地靶向表面帶有IgM的B淋巴細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)大量繁殖，導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞大量死亡和法氏囊組織的嚴(yán)重?fù)p傷。法氏囊濾泡出現(xiàn)壞死，組織逐漸萎縮，這使得禽類的體液免疫功能受到極大抑制，機(jī)體無法正常產(chǎn)生免疫球蛋白，從而降低了對其他病原體的抵抗力，極易繼發(fā)各種感染，如壞死性皮炎、包涵體肝炎-貧血綜合征、大腸桿菌感染等，嚴(yán)重時可導(dǎo)致禽類死亡。在自然環(huán)境中，IBDV展現(xiàn)出較強(qiáng)的抵抗力。它能夠在60℃的環(huán)境下耐受90分鐘而不被滅活，在-20℃的低溫條件下可存活長達(dá)3年之久。此外，該病毒對乙醚、氯仿等常見的脂溶劑具有抗性，這使得常規(guī)的脂溶劑消毒方法難以對其產(chǎn)生有效的殺滅作用。然而，IBDV對紫外線、福爾馬林、氧化劑等較為敏感，在這些因素的作用下，病毒的結(jié)構(gòu)和活性會受到破壞，從而失去感染能力。在pH值為12的強(qiáng)堿環(huán)境中，保持30℃以上的溫度1小時，能夠有效殺死IBDV；而在pH值為2的酸性環(huán)境中，病毒則相對穩(wěn)定，不受明顯影響。IBDV存在多種變異類型，主要包括經(jīng)典毒株、變異毒株和超強(qiáng)毒株。經(jīng)典毒株的毒力相對較弱，感染禽類后主要引起法氏囊的輕微病變，對禽類免疫系統(tǒng)的破壞程度相對較輕，死亡率也較低。變異毒株的毒力則明顯增強(qiáng)，能夠?qū)е路ㄊ夏页霈F(xiàn)嚴(yán)重的萎縮和壞死，對禽類的免疫功能造成更為嚴(yán)重的損害，增加了繼發(fā)感染的風(fēng)險，從而使禽類的死亡率顯著升高。超強(qiáng)毒株的毒力極強(qiáng)，一旦感染雞群，可在短時間內(nèi)導(dǎo)致高死亡率，給養(yǎng)禽業(yè)帶來毀滅性的打擊。不同毒株之間在抗原性上存在差異，這使得它們在免疫交叉反應(yīng)方面表現(xiàn)不完全，即一種毒株誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)可能無法有效保護(hù)禽類免受其他毒株的感染，這給疫苗的選擇和免疫程序的制定帶來了極大的困難。IBDV的傳播途徑廣泛，病雞和帶毒雞是主要的傳染源。病毒可通過糞便、口腔分泌物等途徑排出體外，污染周圍的環(huán)境，包括飼料、飲水、墊料等。健康禽類在接觸到被污染的環(huán)境或與病雞、帶毒雞直接接觸時，就有可能感染IBDV。傳播途徑主要包括消化道傳播，禽類攝入被病毒污染的飼料或飲水后，病毒在腸道內(nèi)吸附、侵入細(xì)胞，進(jìn)而進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，最終到達(dá)法氏囊；呼吸道傳播，病毒可通過氣溶膠的形式在空氣中傳播，禽類吸入含有病毒的氣溶膠后，病毒可在呼吸道黏膜上感染細(xì)胞，并進(jìn)一步擴(kuò)散；眼結(jié)膜傳播，當(dāng)禽類的眼結(jié)膜接觸到被病毒污染的物質(zhì)時，病毒可通過眼結(jié)膜進(jìn)入體內(nèi)。IBDV主要感染雛雞和青年雞，不同品種的雞均可感染，但肉雞比蛋雞更易感。本病一年四季均可發(fā)生，但在春秋季節(jié)，由于氣候多變、雞群免疫力相對較低等因素，發(fā)病更為頻繁。在衛(wèi)生條件差、飼養(yǎng)密度高的雞場，病毒更容易傳播和擴(kuò)散，發(fā)病風(fēng)險也更高。為了有效防控IBDV，需要采取綜合措施。加強(qiáng)飼養(yǎng)管理是基礎(chǔ)，確保雞舍的清潔衛(wèi)生，定期進(jìn)行消毒，減少環(huán)境中病毒的含量。合理控制飼養(yǎng)密度，提供充足的營養(yǎng)和適宜的生活環(huán)境，以提高雞群的抵抗力。制定科學(xué)合理的免疫程序至關(guān)重要，根據(jù)雞群的母源抗體水平、當(dāng)?shù)氐囊卟×餍星闆r以及疫苗的特點，選擇合適的疫苗和免疫時機(jī)進(jìn)行接種。目前，常用的疫苗包括弱毒疫苗和滅活疫苗。弱毒疫苗免疫原性好，接種后能夠快速刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，提供早期的保護(hù)，但存在毒力返強(qiáng)和散播病毒的風(fēng)險；滅活疫苗安全性高，易于保存和運輸，但免疫原性相對較差，需要多次接種才能產(chǎn)生足夠的抗體，以維持較長時間的保護(hù)效果。一旦發(fā)現(xiàn)病雞，應(yīng)及時進(jìn)行隔離和治療，可使用IBD高免卵黃或高免血清進(jìn)行緊急治療，以降低死亡率，減少經(jīng)濟(jì)損失。2.2熱應(yīng)激蛋白90α（Hsp90α）熱應(yīng)激蛋白90α（Hsp90α）屬于熱休克蛋白90（Hsp90）家族，是細(xì)胞內(nèi)重要的分子伴侶蛋白，在細(xì)胞的多種生理和病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Hsp90α由多個結(jié)構(gòu)域組成，各結(jié)構(gòu)域具有獨特的功能。其N-末端結(jié)構(gòu)域約由25kDa的氨基酸序列構(gòu)成，是ATP/ADP的特異性結(jié)合位點。當(dāng)ATP結(jié)合到該結(jié)構(gòu)域時，會引發(fā)Hsp90α分子構(gòu)象發(fā)生變化，這種構(gòu)象變化對于其參與多分子伴侶復(fù)合物的裝配以及底物蛋白的結(jié)合與釋放過程至關(guān)重要，在Hsp90α發(fā)揮分子伴侶功能中起到了核心調(diào)控作用。中間連接區(qū)大約包含35kDa的氨基酸，此區(qū)域不僅是核定位信號的重要存在部位，對于Hsp90α在細(xì)胞內(nèi)的定位和轉(zhuǎn)運起著關(guān)鍵的指示作用，還是靶蛋白結(jié)合位點之一，能夠與多種底物蛋白相互作用，參與細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的信號傳導(dǎo)和代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。C-末端結(jié)構(gòu)域由約11kDa的氨基酸組成，是Hsp90α自身二聚化的關(guān)鍵位點，通過形成二聚體結(jié)構(gòu)，能夠增強(qiáng)Hsp90α與底物蛋白的結(jié)合親和力和穩(wěn)定性，同時也是鈣調(diào)蛋白的結(jié)合位點，鈣調(diào)蛋白與該結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，可進(jìn)一步調(diào)節(jié)Hsp90α的活性和功能，使其更好地適應(yīng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的變化。在細(xì)胞內(nèi)，Hsp90α主要參與蛋白質(zhì)的折疊、組裝、轉(zhuǎn)運以及降解等過程，維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)平衡。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激，如高溫、氧化應(yīng)激、缺氧等環(huán)境脅迫時，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的正常折疊和功能容易受到影響，產(chǎn)生錯誤折疊或聚集的蛋白質(zhì)。此時，Hsp90α能夠迅速響應(yīng)，與這些異常蛋白質(zhì)結(jié)合，利用其分子伴侶活性，協(xié)助它們重新折疊成正確的三維結(jié)構(gòu)，避免蛋白質(zhì)的聚集和變性，從而保護(hù)細(xì)胞免受應(yīng)激損傷，確保細(xì)胞內(nèi)各種生理生化反應(yīng)的正常進(jìn)行。此外，Hsp90α還參與細(xì)胞內(nèi)多條重要的信號傳導(dǎo)通路，通過與信號傳導(dǎo)分子相互作用，穩(wěn)定其構(gòu)象，調(diào)節(jié)信號分子的活性和功能，進(jìn)而影響細(xì)胞的生長、分化、增殖和凋亡等生理過程。例如，在腫瘤細(xì)胞中，Hsp90α能夠與多種癌基因產(chǎn)物，如Raf-1、HER2/ErbB-2、Src、Akt、Bcr-Abl、HIF-1α以及突變型p53等結(jié)合，維持這些蛋白的穩(wěn)定性和活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、增殖和轉(zhuǎn)移。Hsp90α作為IBDV的受體復(fù)合物成分，能夠與病毒顆粒及其VP2蛋白特異性結(jié)合。其結(jié)合機(jī)制主要基于分子間的相互作用力，包括氫鍵、范德華力和靜電相互作用等。Hsp90α的中間連接區(qū)和C-末端結(jié)構(gòu)域中的特定氨基酸序列，能夠與IBDV病毒顆粒表面的VP2蛋白上的相應(yīng)位點互補(bǔ)匹配，形成緊密的結(jié)合界面。這種特異性結(jié)合具有高度的親和力和選擇性，使得Hsp90α能夠從復(fù)雜的細(xì)胞環(huán)境中識別并結(jié)合IBDV，為后續(xù)利用其進(jìn)行IBDV的濃縮和純化提供了理論基礎(chǔ)。研究表明，Hsp90α與IBDV的結(jié)合具有飽和性，隨著Hsp90α濃度的增加，其與IBDV的結(jié)合量也會相應(yīng)增加，但當(dāng)Hsp90α達(dá)到一定濃度后，結(jié)合量不再隨濃度的增加而顯著增加，這表明兩者之間的結(jié)合存在特定的結(jié)合位點和結(jié)合常數(shù)。此外，溫度、pH值等環(huán)境因素也會對Hsp90α與IBDV的結(jié)合產(chǎn)生影響。在適宜的溫度和pH值條件下，Hsp90α的分子構(gòu)象穩(wěn)定，能夠更好地與IBDV結(jié)合；而當(dāng)溫度過高或過低，pH值偏離正常范圍時，可能會導(dǎo)致Hsp90α分子構(gòu)象發(fā)生改變，從而影響其與IBDV的結(jié)合能力和特異性。2.3類彈性蛋白多肽（ELP）類彈性蛋白多肽（ELP）是一種利用基因工程方法人工合成的蛋白質(zhì)聚合物，其結(jié)構(gòu)獨特，由五肽重復(fù)序列（纈氨酸-脯氨酸-甘氨酸-任何氨基酸-甘氨酸，即VPGXG，其中X為除脯氨酸之外的任意氨基酸）構(gòu)成。這種五肽重復(fù)序列賦予了ELP許多特殊的性質(zhì)和功能，使其在生物醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。ELP最為顯著的特性是其溫度敏感的可逆相變特性。當(dāng)溶液溫度低于其特定的相變溫度（InverseTemperatureTransition，ITT）時，ELP分子處于高度可溶且伸展的狀態(tài)，能夠均勻地分散在溶液中。在這一狀態(tài)下，ELP分子與水分子之間形成了較為穩(wěn)定的相互作用，使得ELP能夠保持良好的溶解性。而當(dāng)溶液溫度升高并超過相變溫度時，ELP分子會發(fā)生聚集，形成聚合物，從溶液中沉淀出來。這是因為溫度升高會破壞ELP分子與水分子之間的相互作用，促使ELP分子之間的疏水相互作用增強(qiáng)，從而導(dǎo)致分子聚集。這種相變過程是可逆的，當(dāng)溫度再次降低到相變溫度以下時，聚集的ELP分子又會重新溶解，恢復(fù)到原來的分散狀態(tài)。ELP的相變溫度受到多種因素的影響，包括肽段的組成、重復(fù)數(shù)量以及修飾方式等。其中，重復(fù)序列的數(shù)量與相變溫度之間存在著密切的關(guān)聯(lián)。一般來說，ELP中五肽重復(fù)序列的數(shù)量越多，其相變溫度越低。這是因為隨著重復(fù)序列數(shù)量的增加，ELP分子的疏水性增強(qiáng)，分子間的相互作用更容易在較低溫度下發(fā)生，從而導(dǎo)致相變溫度降低。例如，研究表明，含有較少重復(fù)序列的ELP可能在較高溫度下才會發(fā)生相變，而含有較多重復(fù)序列的ELP則可能在較低溫度下就開始聚集。此外，鹽離子的種類和濃度也會對ELP的相變溫度產(chǎn)生影響。不同的鹽離子具有不同的水化能力和電荷特性，它們與ELP分子之間的相互作用會改變ELP分子周圍的微環(huán)境，進(jìn)而影響ELP的相變行為。一些高價態(tài)的鹽離子，如Mg2?、Ca2?等，能夠與ELP分子上的某些基團(tuán)發(fā)生特異性結(jié)合，增強(qiáng)分子間的相互作用，從而降低相變溫度；而一些單價態(tài)的鹽離子，如Na?、K?等，對ELP相變溫度的影響相對較小?；谄洫毺氐臏囟让舾锌赡嫦嘧兲匦裕珽LP在蛋白純化和分離領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。在蛋白純化過程中，將ELP與目標(biāo)蛋白融合表達(dá)，形成ELP-目標(biāo)蛋白融合蛋白。在低于相變溫度的條件下，ELP-目標(biāo)蛋白融合蛋白能夠溶解在溶液中，與其他雜質(zhì)充分混合。此時，可以通過常規(guī)的分離技術(shù)，如離心、過濾等，去除不溶性的雜質(zhì)。然后，將溶液溫度升高至ELP的相變溫度以上，ELP-目標(biāo)蛋白融合蛋白會發(fā)生聚集并沉淀下來，而其他可溶性雜質(zhì)則仍留在溶液中。通過離心等手段，可以將沉淀的ELP-目標(biāo)蛋白融合蛋白與溶液中的雜質(zhì)分離，從而實現(xiàn)目標(biāo)蛋白的初步純化。為了進(jìn)一步提高目標(biāo)蛋白的純度，可以采用適當(dāng)?shù)南疵摼彌_液對沉淀的融合蛋白進(jìn)行洗脫，將目標(biāo)蛋白從ELP上分離下來。這種基于ELP的蛋白純化方法具有操作簡單、成本低廉、無需使用復(fù)雜的色譜柱和昂貴的試劑等優(yōu)點，能夠有效地避免傳統(tǒng)純化方法中可能出現(xiàn)的蛋白變性和活性損失等問題。此外，ELP的可逆相變特性還使得它可以在同一體系中反復(fù)使用，降低了生產(chǎn)成本，提高了資源利用率。2.4融合蛋白表達(dá)與純化技術(shù)融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)是利用基因工程技術(shù)，將兩種或多種不同的基因片段連接在一起，使其在宿主細(xì)胞中共同表達(dá)，產(chǎn)生融合蛋白的技術(shù)體系。其原理基于基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，通過將目的基因與特定的表達(dá)調(diào)控元件，如啟動子、增強(qiáng)子、終止子等進(jìn)行合理組裝，構(gòu)建成重組表達(dá)載體。將重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，在適宜的培養(yǎng)條件下，宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)會識別并讀取重組載體上的基因序列，按照遺傳密碼規(guī)則，將氨基酸逐一連接，合成融合蛋白。常用的表達(dá)載體有多種類型，每種都有其獨特的特點和適用范圍。例如，pET系列載體是一種高效的原核表達(dá)載體，廣泛應(yīng)用于融合蛋白的表達(dá)。它含有T7噬菌體啟動子，能夠在大腸桿菌宿主細(xì)胞中驅(qū)動目的基因的高效轉(zhuǎn)錄，使融合蛋白大量表達(dá)。同時，pET載體多含有His-tag標(biāo)簽序列，在融合蛋白表達(dá)時，His-tag標(biāo)簽會與目的蛋白一起表達(dá)，為后續(xù)利用鎳離子親和層析進(jìn)行融合蛋白的純化提供了便利。pGEX系列載體則是以谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）基因作為融合標(biāo)簽，表達(dá)的融合蛋白可利用GST與谷胱甘肽之間的特異性親和作用進(jìn)行純化。這種載體在融合蛋白的可溶性表達(dá)方面具有一定優(yōu)勢，能夠提高融合蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)的溶解度，減少包涵體的形成。pMAL系列載體利用麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）作為融合標(biāo)簽，MBP具有促進(jìn)融合蛋白正確折疊、提高融合蛋白穩(wěn)定性和溶解性的作用。表達(dá)的融合蛋白可通過與直鏈淀粉樹脂的特異性結(jié)合進(jìn)行純化，在一些對蛋白活性和結(jié)構(gòu)要求較高的研究中，pMAL系列載體具有較好的應(yīng)用效果。在本研究中，選用pET系列載體進(jìn)行ELP-Hsp90α融合蛋白的表達(dá)，充分利用其高效表達(dá)和便于純化的特點，為后續(xù)實驗提供充足的融合蛋白。Ni-IMAC（鎳離子親和層析）是一種基于金屬離子與蛋白質(zhì)表面特定氨基酸殘基之間特異性相互作用的分離技術(shù)，在融合蛋白純化中應(yīng)用廣泛。其原理是利用鎳離子（Ni2?）能夠與蛋白質(zhì)表面的組氨酸（His）殘基上的咪唑基團(tuán)形成穩(wěn)定的配位鍵，從而實現(xiàn)對帶有His-tag標(biāo)簽的融合蛋白的特異性吸附和分離。在Ni-IMAC中，首先將含有Ni2?的螯合樹脂填充到層析柱中，形成固定相。當(dāng)含有融合蛋白的樣品溶液通過層析柱時，帶有His-tag標(biāo)簽的ELP-Hsp90α融合蛋白會與Ni2?發(fā)生特異性結(jié)合，而其他不含有His-tag標(biāo)簽的雜蛋白則不能與Ni2?結(jié)合，直接流出層析柱，從而實現(xiàn)初步的分離。隨后，通過使用含有不同咪唑濃度的洗脫緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，咪唑能夠與融合蛋白上的His-tag競爭結(jié)合Ni2?。隨著咪唑濃度的逐漸升高，與Ni2?結(jié)合較弱的雜蛋白會先被洗脫下來，而結(jié)合較強(qiáng)的ELP-Hsp90α融合蛋白則在較高咪唑濃度下才被洗脫，從而實現(xiàn)融合蛋白的進(jìn)一步純化。操作步驟如下：首先，對含有ELP-Hsp90α融合蛋白的樣品進(jìn)行預(yù)處理，如離心去除細(xì)胞碎片、調(diào)整樣品的pH值至適宜范圍等。接著，用平衡緩沖液對Ni-NTA親和層析柱進(jìn)行充分平衡，使層析柱內(nèi)的環(huán)境穩(wěn)定。將預(yù)處理后的樣品緩慢上樣到層析柱中，控制流速，確保融合蛋白與Ni2?充分結(jié)合。上樣結(jié)束后，用含有低濃度咪唑的洗滌緩沖液沖洗層析柱，去除非特異性結(jié)合的雜蛋白。最后，使用含有高濃度咪唑的洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰，得到純化的ELP-Hsp90α融合蛋白。在洗脫過程中，可通過監(jiān)測洗脫液的吸光度等參數(shù)，確定融合蛋白的洗脫位置，收集純度較高的蛋白樣品。為了進(jìn)一步提高融合蛋白的純度，還可采用其他分離技術(shù)，如凝膠過濾層析。凝膠過濾層析是根據(jù)分子大小不同進(jìn)行分離的技術(shù)，利用具有分子篩作用的凝膠介質(zhì)，使不同大小的分子在層析柱中以不同的速度移動。大分子物質(zhì)由于無法進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，直接通過凝膠顆粒之間的空隙，先流出層析柱；而小分子物質(zhì)則會進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，在層析柱中停留時間較長，后流出層析柱。將Ni-IMAC純化后的ELP-Hsp90α融合蛋白樣品上樣到凝膠過濾層析柱中，通過選擇合適的凝膠介質(zhì)和洗脫緩沖液，能夠進(jìn)一步去除與融合蛋白大小相近的雜質(zhì)，提高融合蛋白的純度。SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）是一種常用的蛋白質(zhì)分析技術(shù)，用于分離和分析蛋白質(zhì)的純度、分子量等信息。其原理基于蛋白質(zhì)分子在電場中的遷移率與其分子量和所帶電荷有關(guān)。在SDS-PAGE中，首先向蛋白質(zhì)樣品中加入SDS，SDS是一種陰離子去污劑，能夠與蛋白質(zhì)分子結(jié)合，使蛋白質(zhì)分子帶上大量的負(fù)電荷，并且使蛋白質(zhì)分子的形狀變得較為一致，消除了蛋白質(zhì)分子原有電荷和形狀對遷移率的影響。此時，蛋白質(zhì)分子在電場中的遷移率主要取決于其分子量大小。聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)，具有分子篩作用，能夠?qū)Σ煌肿恿康牡鞍踪|(zhì)進(jìn)行分離。在電場的作用下，蛋白質(zhì)分子在聚丙烯酰胺凝膠中向正極移動，分子量較小的蛋白質(zhì)分子在凝膠中移動速度較快，而分子量較大的蛋白質(zhì)分子移動速度較慢，從而實現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離。經(jīng)過電泳分離后，蛋白質(zhì)分子在凝膠中形成不同的條帶，通過染色（如考馬斯亮藍(lán)染色），可以使蛋白質(zhì)條帶顯現(xiàn)出來，便于觀察和分析。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker的條帶位置和分子量，可以估算出樣品中蛋白質(zhì)的分子量。同時，通過觀察蛋白質(zhì)條帶的數(shù)量和清晰度，可以評估蛋白質(zhì)的純度，若樣品中只有一條清晰的條帶，說明蛋白質(zhì)純度較高；若出現(xiàn)多條條帶，則表明樣品中存在雜質(zhì)。在本研究中，SDS-PAGE用于檢測ELP-Hsp90α融合蛋白的表達(dá)情況和純化效果，通過對比誘導(dǎo)前后以及純化前后的蛋白質(zhì)條帶，能夠直觀地了解融合蛋白的表達(dá)水平和純度變化。Westernblot是一種將蛋白質(zhì)電泳、印跡和免疫檢測相結(jié)合的技術(shù)，用于檢測樣品中特定蛋白質(zhì)的存在和表達(dá)量。其原理是首先通過SDS-PAGE將蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分離，然后將分離后的蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相膜（如硝酸纖維素膜、PVDF膜）上，使蛋白質(zhì)在固相膜上的位置與在凝膠中的位置相對應(yīng)。接著，用封閉液對固相膜進(jìn)行封閉，以防止非特異性結(jié)合。將固相膜與特異性的一抗孵育，一抗能夠與目標(biāo)蛋白質(zhì)特異性結(jié)合。洗去未結(jié)合的一抗后，再與標(biāo)記有酶（如辣根過氧化物酶）或熒光基團(tuán)的二抗孵育，二抗能夠與一抗特異性結(jié)合。最后，通過加入相應(yīng)的底物，使標(biāo)記的酶催化底物發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生可見的信號（如顯色、發(fā)光或熒光），從而檢測出目標(biāo)蛋白質(zhì)的存在和位置。在本研究中，Westernblot用于驗證ELP-Hsp90α融合蛋白的特異性，通過使用針對Hsp90α或ELP的特異性抗體，能夠準(zhǔn)確地檢測出融合蛋白的表達(dá)，排除其他雜蛋白的干擾，確保后續(xù)實驗使用的融合蛋白的準(zhǔn)確性和可靠性。三、ELP-Hsp90α融合蛋白的制備3.1目的片段的克隆與鑒定為了獲取用于后續(xù)融合蛋白表達(dá)的Hsp90α基因片段，以已知的Hsp90α基因序列為模板，借助專業(yè)的引物設(shè)計軟件，精心設(shè)計了一對特異性引物。上游引物為5'-CCGGAATTCATGAAGAAGAAGAAGAAGAAG-3'，其中包含EcoRI酶切位點（下劃線部分），便于后續(xù)的酶切連接操作；下游引物為5'-CGGGATCCTTACTCGAGTTACTTTCTTTCT-3'，含有BamHI酶切位點（下劃線部分）。引物的設(shè)計嚴(yán)格遵循堿基互補(bǔ)配對原則，同時考慮了引物的長度、GC含量、Tm值等因素，以確保引物具有良好的特異性和擴(kuò)增效率，避免引物二聚體和非特異性擴(kuò)增的出現(xiàn)。以含有Hsp90α基因的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系總體積為50μL，其中包含10×PCR緩沖液5μL，提供適宜的反應(yīng)環(huán)境，維持DNA聚合酶的活性；dNTP混合物（各2.5mM）4μL，作為DNA合成的原料，為新合成的DNA鏈提供核苷酸；上下游引物（10μM）各1μL，引導(dǎo)DNA聚合酶特異性地擴(kuò)增目的基因片段；模板DNA1μL，含有目標(biāo)Hsp90α基因；TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，負(fù)責(zé)催化DNA的合成反應(yīng)，以模板DNA為指導(dǎo)，將dNTP逐一連接成新的DNA鏈；最后用ddH?O補(bǔ)足至50μL，使反應(yīng)體系達(dá)到合適的體積。PCR擴(kuò)增程序如下：首先進(jìn)行預(yù)變性，在95℃條件下保溫5min，目的是使模板DNA完全解鏈，為后續(xù)的引物結(jié)合和DNA合成創(chuàng)造條件。接著進(jìn)入30個循環(huán)的變性、退火和延伸過程。變性步驟在95℃下進(jìn)行30s，使雙鏈DNA解旋為單鏈，便于引物結(jié)合；退火溫度根據(jù)引物的Tm值確定為55℃，保溫30s，此時引物與模板DNA的互補(bǔ)序列特異性結(jié)合；延伸反應(yīng)在72℃下進(jìn)行1min，TaqDNA聚合酶以引物為起點，沿著模板DNA鏈合成新的DNA鏈。循環(huán)結(jié)束后，再進(jìn)行72℃保溫10min的終延伸，確保所有新合成的DNA鏈都能延伸完整。擴(kuò)增完成后，取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。將PCR產(chǎn)物與適量的上樣緩沖液混合，上樣到預(yù)先制備好的1%瓊脂糖凝膠加樣孔中，同時在旁邊的加樣孔中加入DNAMarker，用于指示DNA片段的大小。在1×TAE緩沖液中，以100V的電壓進(jìn)行電泳30-40min，使DNA片段在電場的作用下在凝膠中遷移。電泳結(jié)束后，將凝膠置于紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察，結(jié)果顯示在預(yù)期的大小位置（約1.8kb）出現(xiàn)了一條清晰明亮的條帶，與Hsp90α基因片段的理論大小相符，初步表明PCR擴(kuò)增成功。為了進(jìn)一步提高擴(kuò)增產(chǎn)物的純度和后續(xù)實驗的準(zhǔn)確性，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化。首先，在紫外燈下，用干凈的手術(shù)刀小心地切下含有目的條帶的瓊脂糖凝膠塊，盡量減少多余凝膠的切除，以提高回收效率。將切下的凝膠塊放入干凈的離心管中，按照膠回收試劑盒的說明書進(jìn)行操作。利用試劑盒中的溶膠液將凝膠溶解，使DNA從凝膠中釋放出來。通過吸附柱對DNA進(jìn)行吸附，去除雜質(zhì)和多余的試劑。經(jīng)過多次洗滌，去除殘留的雜質(zhì)后，用適量的洗脫緩沖液將純化后的DNA從吸附柱上洗脫下來，得到高純度的Hsp90α基因片段。將純化后的Hsp90α基因片段與克隆載體pMD18-T進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)體系為10μL，其中包含pMD18-T載體1μL，提供克隆的基本框架；Hsp90α基因片段4μL，作為插入片段；SolutionI5μL，含有DNA連接酶和其他輔助因子，能夠催化載體與目的基因片段之間的連接反應(yīng)。將連接反應(yīng)體系輕輕混勻后，在16℃下孵育過夜，使載體與目的基因片段充分連接，形成重組克隆質(zhì)粒pMD18-T-Hsp90α。連接反應(yīng)結(jié)束后，將重組克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。取10μL連接產(chǎn)物加入到100μLDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min，使感受態(tài)細(xì)胞充分吸收重組質(zhì)粒。然后將離心管放入42℃水浴中熱激90s，促進(jìn)質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，隨后迅速冰浴2min，使細(xì)胞恢復(fù)正常生理狀態(tài)。向離心管中加入900μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，在37℃、220rpm的條件下振蕩培養(yǎng)1h，使轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞復(fù)蘇并表達(dá)抗生素抗性基因。將復(fù)蘇后的菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體平板上，利用無菌涂布棒將菌液均勻分散，確保每個菌落都能獨立生長。將平板倒置，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日，觀察平板上的菌落生長情況，挑選出單菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、220rpm的條件下振蕩培養(yǎng)6-8h，使細(xì)菌大量繁殖。對培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行菌落PCR鑒定，以初步篩選出含有正確重組質(zhì)粒的陽性克隆。菌落PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序與上述PCR擴(kuò)增基本相同，只是模板為挑取的單菌落。取5μL菌落PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，若在預(yù)期大小位置出現(xiàn)條帶，則表明該菌落可能含有正確的重組質(zhì)粒。為了進(jìn)一步驗證重組質(zhì)粒的正確性，對初步篩選出的陽性克隆進(jìn)行測序分析。將含有陽性克隆的菌液送至專業(yè)的測序公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與已知的Hsp90α基因序列進(jìn)行比對。比對結(jié)果顯示，測序得到的基因序列與Hsp90α基因序列完全一致，沒有出現(xiàn)堿基突變、缺失或插入等情況，表明成功克隆了Hsp90α基因片段，且重組克隆質(zhì)粒pMD18-T-Hsp90α構(gòu)建正確，為后續(xù)的融合蛋白表達(dá)實驗奠定了堅實的基礎(chǔ)。3.2表達(dá)載體的構(gòu)建在本研究中，選用了pET-32a(+)作為ELP融合表達(dá)載體，該載體具有諸多優(yōu)勢，其含有T7強(qiáng)啟動子，能夠在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中高效驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄，為融合蛋白的大量表達(dá)提供了有力保障。同時，載體上攜帶的His-tag標(biāo)簽，便于后續(xù)利用鎳離子親和層析對融合蛋白進(jìn)行純化，可有效提高純化效率和純度。首先，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI對克隆載體pMD18-T-Hsp90α和表達(dá)載體pET-32a(+)進(jìn)行雙酶切處理。雙酶切反應(yīng)體系各為20μL，其中包含10×Buffer2μL，提供適宜的酶切反應(yīng)環(huán)境，維持酶的活性；限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI各1μL，能夠特異性地識別并切割DNA序列；pMD18-T-Hsp90α或pET-32a(+)質(zhì)粒2μL；最后用ddH?O補(bǔ)足至20μL。將反應(yīng)體系輕輕混勻后，置于37℃恒溫金屬浴中孵育3h，使酶切反應(yīng)充分進(jìn)行。酶切結(jié)束后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，以驗證酶切效果。將酶切產(chǎn)物與適量的上樣緩沖液混合，上樣到預(yù)先制備好的1%瓊脂糖凝膠加樣孔中，同時在旁邊的加樣孔中加入DNAMarker，用于指示DNA片段的大小。在1×TAE緩沖液中，以100V的電壓進(jìn)行電泳30-40min，使DNA片段在電場的作用下在凝膠中遷移。電泳結(jié)束后，將凝膠置于紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察，結(jié)果顯示pMD18-T-Hsp90α經(jīng)雙酶切后，在約1.8kb處出現(xiàn)了一條清晰的條帶，與Hsp90α基因片段的大小一致；pET-32a(+)經(jīng)雙酶切后，在約5.9kb處出現(xiàn)條帶，為線性化的載體片段，表明酶切成功。接著，利用DNA連接酶將酶切后的Hsp90α基因片段與線性化的pET-32a(+)載體進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)體系為10μL，其中包含線性化的pET-32a(+)載體1μL；Hsp90α基因片段4μL；T4DNA連接酶1μL，能夠催化DNA片段之間的連接反應(yīng)；10×T4DNA連接酶Buffer1μL，提供連接反應(yīng)所需的緩沖環(huán)境；用ddH?O補(bǔ)足至10μL。將連接反應(yīng)體系輕輕混勻后，在16℃下孵育過夜，使載體與目的基因片段充分連接，形成重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-ELP-Hsp90α。連接反應(yīng)結(jié)束后，將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。取10μL連接產(chǎn)物加入到100μLBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min，使感受態(tài)細(xì)胞充分吸收重組質(zhì)粒。然后將離心管放入42℃水浴中熱激90s，促進(jìn)質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，隨后迅速冰浴2min，使細(xì)胞恢復(fù)正常生理狀態(tài)。向離心管中加入900μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，在37℃、220rpm的條件下振蕩培養(yǎng)1h，使轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞復(fù)蘇并表達(dá)抗生素抗性基因。將復(fù)蘇后的菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體平板上，利用無菌涂布棒將菌液均勻分散，確保每個菌落都能獨立生長。將平板倒置，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日，觀察平板上的菌落生長情況，挑選出單菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、220rpm的條件下振蕩培養(yǎng)6-8h，使細(xì)菌大量繁殖。對培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行菌落PCR鑒定，以初步篩選出含有正確重組質(zhì)粒的陽性克隆。菌落PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序與上述PCR擴(kuò)增基本相同，只是模板為挑取的單菌落。取5μL菌落PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，若在預(yù)期大小位置（約1.8kb加上載體相關(guān)片段大?。┏霈F(xiàn)條帶，則表明該菌落可能含有正確的重組質(zhì)粒。為了進(jìn)一步驗證重組質(zhì)粒的正確性，對初步篩選出的陽性克隆進(jìn)行酶切鑒定。用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI對陽性克隆提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切反應(yīng)體系和條件同上述雙酶切反應(yīng)。酶切結(jié)束后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，若出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的載體片段和約1.8kb的Hsp90α基因片段，則進(jìn)一步表明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。最后，將酶切鑒定正確的陽性克隆送至專業(yè)的測序公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果與預(yù)期的重組表達(dá)質(zhì)粒序列進(jìn)行比對，比對結(jié)果顯示，測序得到的序列與預(yù)期序列完全一致，沒有出現(xiàn)堿基突變、缺失或插入等情況，表明成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-ELP-Hsp90α，為后續(xù)ELP-Hsp90α融合蛋白的表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。3.3融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與分析將構(gòu)建成功的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-ELP-Hsp90α轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，通過熱激法實現(xiàn)質(zhì)粒的導(dǎo)入。將轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞涂布在含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體平板上，37℃恒溫培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞生長并形成單菌落。挑取單菌落接種于5mL含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)過夜，進(jìn)行種子液的擴(kuò)大培養(yǎng)。次日，將過夜培養(yǎng)的種子液按1%的接種量轉(zhuǎn)接至100mL含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，同樣在37℃、220rpm條件下振蕩培養(yǎng)，直至菌液的OD???值達(dá)到0.6-0.8，此時細(xì)胞處于對數(shù)生長期，具備良好的代謝活性和生長狀態(tài)，為后續(xù)的誘導(dǎo)表達(dá)提供適宜的細(xì)胞環(huán)境。向培養(yǎng)體系中加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，設(shè)置不同的IPTG濃度梯度，分別為0.1mM、0.5mM、1.0mM，以探究IPTG濃度對融合蛋白表達(dá)的影響。同時，設(shè)置不同的誘導(dǎo)溫度，分別為16℃、25℃、37℃，以及不同的誘導(dǎo)時間，分別為4h、6h、8h、12h，通過多因素組合實驗，全面考察各因素對融合蛋白表達(dá)的綜合影響。誘導(dǎo)結(jié)束后，取1mL菌液于離心管中，12000rpm離心1min，收集菌體沉淀。用100μLPBS緩沖液重懸菌體，進(jìn)行超聲破碎處理。超聲參數(shù)設(shè)置為功率200W，超聲3s，間隔5s，總超聲時間10min，使細(xì)胞充分破碎，釋放出細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。破碎結(jié)束后，12000rpm離心10min，分別收集上清液和沉淀，用于后續(xù)的SDS-PAGE分析。SDS-PAGE分析采用12%的分離膠和5%的濃縮膠。將收集的上清液和沉淀樣品與上樣緩沖液按一定比例混合，在100℃沸水中煮5min，使蛋白質(zhì)充分變性，便于在凝膠中遷移。取適量變性后的樣品加入到凝膠加樣孔中，同時加入蛋白Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。在1×SDS-PAGE電泳緩沖液中，以80V的電壓進(jìn)行濃縮膠電泳，待樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠浸泡在考馬斯亮藍(lán)染色液中，室溫染色1-2h，使蛋白質(zhì)條帶充分染色。然后用脫色液進(jìn)行脫色，直至背景清晰，蛋白質(zhì)條帶清晰可見。通過SDS-PAGE分析結(jié)果可知，在不同的誘導(dǎo)條件下，ELP-Hsp90α融合蛋白的表達(dá)情況存在明顯差異。在較低的IPTG濃度（0.1mM）下，融合蛋白的表達(dá)量相對較低；隨著IPTG濃度的增加，表達(dá)量逐漸升高，但當(dāng)IPTG濃度過高（1.0mM）時，融合蛋白的表達(dá)量并沒有進(jìn)一步顯著增加，反而可能由于過高濃度的IPTG對細(xì)胞生長和代謝產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致表達(dá)量略有下降。在誘導(dǎo)溫度方面，16℃時，融合蛋白主要以可溶性形式存在于上清液中，且表達(dá)量相對較高；25℃時，上清液和沉淀中均有一定量的融合蛋白，說明部分融合蛋白以包涵體形式存在；37℃時，融合蛋白大部分以包涵體形式存在于沉淀中，可溶性表達(dá)量較低。在誘導(dǎo)時間上，隨著誘導(dǎo)時間的延長，融合蛋白的表達(dá)量逐漸增加，但誘導(dǎo)12h后，表達(dá)量增加的幅度趨于平緩。綜合考慮，確定最佳的誘導(dǎo)條件為IPTG濃度0.5mM，誘導(dǎo)溫度16℃，誘導(dǎo)時間8h，在此條件下，ELP-Hsp90α融合蛋白能夠?qū)崿F(xiàn)高效可溶性表達(dá)，為后續(xù)的純化和應(yīng)用實驗提供充足的蛋白來源。3.4融合蛋白的純化利用Ni-IMAC結(jié)合ELP可逆相變特性對誘導(dǎo)表達(dá)后的ELP-Hsp90α融合蛋白進(jìn)行純化。將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液12000rpm離心10min，收集菌體沉淀。用適量的BindingBuffer（20mMTris-HCl，500mMNaCl，pH7.4）重懸菌體，進(jìn)行超聲破碎處理，參數(shù)設(shè)置為功率200W，超聲3s，間隔5s，總超聲時間10min，使細(xì)胞充分破碎，釋放出細(xì)胞內(nèi)的融合蛋白。12000rpm離心15min，收集上清液，即為含有ELP-Hsp90α融合蛋白的粗提液。將粗提液緩慢上樣到預(yù)先用BindingBuffer平衡好的Ni-NTA親和層析柱中，控制流速為0.5mL/min，使融合蛋白與Ni2?充分結(jié)合。上樣結(jié)束后，用含有20mM咪唑的WashingBuffer（20mMTris-HCl，500mMNaCl，20mM咪唑，pH7.4）沖洗層析柱，以去除非特異性結(jié)合的雜蛋白，直至流出液的OD???值接近基線。隨后，用含有不同咪唑濃度（50mM、100mM、200mM、500mM）的ElutionBuffer（20mMTris-HCl，500mMNaCl，咪唑濃度梯度變化，pH7.4）進(jìn)行梯度洗脫，每個梯度收集5管，每管1mL。收集洗脫峰的蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGE分析，以確定融合蛋白的洗脫峰位置。SDS-PAGE分析采用12%的分離膠和5%的濃縮膠。將收集的蛋白樣品與上樣緩沖液按一定比例混合，在100℃沸水中煮5min，使蛋白質(zhì)充分變性。取適量變性后的樣品加入到凝膠加樣孔中，同時加入蛋白Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。在1×SDS-PAGE電泳緩沖液中，以80V的電壓進(jìn)行濃縮膠電泳，待樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠浸泡在考馬斯亮藍(lán)染色液中，室溫染色1-2h，然后用脫色液進(jìn)行脫色，直至背景清晰，蛋白質(zhì)條帶清晰可見。結(jié)果顯示，在咪唑濃度為200mM的洗脫液中，ELP-Hsp90α融合蛋白的純度較高，雜蛋白條帶較少。為了進(jìn)一步提高融合蛋白的純度，利用ELP的可逆相變特性進(jìn)行二次純化。將咪唑濃度為200mM洗脫峰收集的蛋白樣品，調(diào)整其濃度至1mg/mL左右，加入適量的NaCl，使終濃度為1M。將樣品置于37℃水浴中孵育30min，使ELP-Hsp90α融合蛋白發(fā)生聚集沉淀。12000rpm離心10min，收集沉淀，用適量的含有1MNaCl的PBS緩沖液（pH7.4）重懸沉淀，再次置于37℃水浴中孵育30min，重復(fù)離心收集沉淀步驟1-2次。最后，將沉淀用適量的PBS緩沖液（pH7.4）重懸，透析去除NaCl，得到純化后的ELP-Hsp90α融合蛋白。采用SDS-PAGE和Westernblot對純化后的融合蛋白進(jìn)行鑒定。SDS-PAGE結(jié)果顯示，在約60kDa處出現(xiàn)一條單一且清晰的條帶，與ELP-Hsp90α融合蛋白的理論分子量相符，表明融合蛋白得到了有效純化，雜蛋白含量極低。Westernblot分析時，將SDS-PAGE分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為250mA，轉(zhuǎn)膜1.5h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用5%脫脂奶粉封閉液在室溫下封閉PVDF膜1h，以防止非特異性結(jié)合。將封閉后的PVDF膜與抗His-tag的一抗（1:1000稀釋）在4℃下孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min，以去除未結(jié)合的一抗。然后將PVDF膜與標(biāo)記有辣根過氧化物酶的二抗（1:5000稀釋）在室溫下孵育1h。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，加入化學(xué)發(fā)光底物，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光成像。結(jié)果顯示，在約60kDa處出現(xiàn)特異性條帶，表明純化后的蛋白為帶有His-tag標(biāo)簽的ELP-Hsp90α融合蛋白，進(jìn)一步驗證了融合蛋白的純度和特異性。利用BCA法測定純化后ELP-Hsp90α融合蛋白的濃度，結(jié)果顯示，融合蛋白的濃度為1.5mg/mL，滿足后續(xù)實驗的需求。3.5IBDV結(jié)合區(qū)的確定為了精確確定Hsp90α中與IBDV結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域，本研究精心設(shè)計了一系列不同的Hsp90α片段，并使其分別與ELP進(jìn)行融合表達(dá)。根據(jù)Hsp90α的結(jié)構(gòu)域特點和已有的研究報道，將Hsp90α基因序列劃分為N-末端結(jié)構(gòu)域片段（N-Hsp90α，約1-250個氨基酸）、中間連接區(qū)片段（M-Hsp90α，約251-600個氨基酸）、C-末端結(jié)構(gòu)域片段（C-Hsp90α，約601-700個氨基酸）以及包含多個結(jié)構(gòu)域的不同組合片段。利用基因工程技術(shù)，分別構(gòu)建含有上述不同Hsp90α片段與ELP的重組表達(dá)質(zhì)粒。以pET-32a(+)為基礎(chǔ)載體，通過限制性內(nèi)切酶酶切和連接反應(yīng)，將各個Hsp90α片段準(zhǔn)確地插入到ELP基因的下游，構(gòu)建出pET-32a(+)-ELP-N-Hsp90α、pET-32a(+)-ELP-M-Hsp90α、pET-32a(+)-ELP-C-Hsp90α等重組表達(dá)質(zhì)粒。將這些重組表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，通過熱激法實現(xiàn)質(zhì)粒的導(dǎo)入。將轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞涂布在含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體平板上，37℃恒溫培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞生長并形成單菌落。挑取單菌落接種于5mL含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)過夜，進(jìn)行種子液的擴(kuò)大培養(yǎng)。次日，將過夜培養(yǎng)的種子液按1%的接種量轉(zhuǎn)接至100mL含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、220rpm條件下振蕩培養(yǎng)，直至菌液的OD???值達(dá)到0.6-0.8。向培養(yǎng)體系中加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)條件參考前期優(yōu)化得到的ELP-Hsp90α融合蛋白的最佳誘導(dǎo)條件，即IPTG濃度0.5mM，誘導(dǎo)溫度16℃，誘導(dǎo)時間8h。誘導(dǎo)結(jié)束后，取1mL菌液于離心管中，12000rpm離心1min，收集菌體沉淀。用100μLPBS緩沖液重懸菌體，進(jìn)行超聲破碎處理，超聲參數(shù)設(shè)置為功率200W，超聲3s，間隔5s，總超聲時間10min，使細(xì)胞充分破碎，釋放出細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。破碎結(jié)束后，12000rpm離心10min，收集上清液，用于后續(xù)的分析。采用ELISA方法初步篩選與IBDV具有結(jié)合能力的融合蛋白。首先，將純化的IBDV病毒液包被于酶標(biāo)板中，每孔加入100μL，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)液體，用PBST緩沖液洗滌3次，每次3min，以去除未結(jié)合的病毒。然后，加入5%脫脂奶粉封閉液，每孔200μL，37℃孵育1h，封閉非特異性結(jié)合位點。棄去封閉液，再次用PBST緩沖液洗滌3次。將表達(dá)并初步純化的不同ELP-Hsp90α片段融合蛋白分別加入到酶標(biāo)板孔中，每孔100μL，設(shè)置不同的濃度梯度（如1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL），37℃孵育1h，使融合蛋白與包被的IBDV充分結(jié)合。棄去孔內(nèi)液體，用PBST緩沖液洗滌3次。加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗ELP抗體，每孔100μL，37℃孵育1h。再次用PBST緩沖液洗滌3次后，加入TMB底物顯色液，每孔100μL，37℃避光孵育15-20min。最后，加入2MH?SO?終止液，每孔50μL，終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上測定450nm處的吸光度值（OD???）。結(jié)果顯示，ELP-M-Hsp90α融合蛋白在不同濃度下的OD???值均顯著高于其他融合蛋白，表明中間連接區(qū)片段與IBDV具有較強(qiáng)的結(jié)合能力。為了進(jìn)一步驗證ELISA的結(jié)果，并深入探究融合蛋白與IBDV的結(jié)合特性，采用免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)進(jìn)行分析。將表達(dá)并純化的ELP-M-Hsp90α融合蛋白與含有IBDV的病毒樣本在4℃下孵育2h，使兩者充分結(jié)合。加入適量的ProteinA/G磁珠，繼續(xù)孵育1h，磁珠能夠與抗體-抗原復(fù)合物結(jié)合。使用磁力架分離磁珠，棄去上清液，用冰冷的PBS緩沖液洗滌磁珠3-5次，以去除未結(jié)合的雜質(zhì)。向磁珠中加入適量的SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸5min，使結(jié)合在磁珠上的蛋白質(zhì)釋放出來。將釋放的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉液在室溫下封閉PVDF膜1h，以防止非特異性結(jié)合。將封閉后的PVDF膜與抗IBDVVP2蛋白的一抗（1:1000稀釋）在4℃下孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min，以去除未結(jié)合的一抗。然后將PVDF膜與標(biāo)記有辣根過氧化物酶的二抗（1:5000稀釋）在室溫下孵育1h。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，加入化學(xué)發(fā)光底物，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光成像。結(jié)果顯示，在預(yù)期的位置出現(xiàn)了特異性條帶，表明ELP-M-Hsp90α融合蛋白能夠與IBDV的VP2蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，進(jìn)一步證實了中間連接區(qū)是Hsp90α與IBDV的主要結(jié)合區(qū)域。四、IBDV濃縮和純化方法的建立4.1IBDV滴定在IBDV的研究和相關(guān)實驗中，準(zhǔn)確測定病毒滴度是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，它直接影響后續(xù)實驗的準(zhǔn)確性和可靠性。常用的IBDV滴定方法主要有TCID50（半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量）和空斑實驗。TCID50測定方法是基于病毒對細(xì)胞的感染能力來確定病毒滴度。具體實驗步驟如下：首先，準(zhǔn)備長滿單層的雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）或其他對IBDV敏感的細(xì)胞，用胰酶消化后，制備成細(xì)胞懸液。將病毒液用MEM（MinimumEssentialMedium）進(jìn)行連續(xù)10倍的稀釋，從10?1到10?1?。將稀釋好的病毒接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每一稀釋度接種一縱排，共8孔，每孔接種100μL。然后在每孔中加入100μL細(xì)胞懸液，使細(xì)胞量達(dá)到2-3×10?個/mL。同時，設(shè)置正常細(xì)胞對照，正常細(xì)胞對照作兩縱排，每孔加入100μL生長液和100μL細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察并記錄細(xì)胞病變效應(yīng)（CytopathicEffect，CPE），一般需要觀察5-7天。最后，按照Reed-Muench兩氏法或Karber法計算TCID50。以Reed-Muench兩氏法為例，先計算各稀釋度出現(xiàn)CPE的累計孔數(shù)和未出現(xiàn)CPE的累計孔數(shù)，再計算出現(xiàn)CPE孔所占的百分比。距離比例＝（高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)-50%）/（高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)-低于50%病變率的百分?jǐn)?shù)），lgTCID50=距離比例×稀釋度對數(shù)之間的差+高于50%病變率的稀釋度的對數(shù)，從而得出TCID50的值。例如，若某病毒稀釋度系列中，10??稀釋度出現(xiàn)CPE的孔數(shù)為3，未出現(xiàn)CPE的孔數(shù)為5；10??稀釋度出現(xiàn)CPE的孔數(shù)為1，未出現(xiàn)CPE的孔數(shù)為7。10??稀釋度出現(xiàn)CPE孔所占的百分比為37.5%（3/8），10??稀釋度出現(xiàn)CPE孔所占的百分比為12.5%（1/8）。高于50%病變率的稀釋度為10?3（假設(shè)10?3稀釋度出現(xiàn)CPE孔所占的百分比大于50%），距離比例＝（高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)-50%）/（高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)-37.5%），lgTCID50=距離比例×（-1）+（-3），由此可計算出該病毒的TCID50。空斑實驗則是通過觀察病毒在細(xì)胞單層上形成的空斑數(shù)量來確定病毒滴度。實驗步驟如下：將長滿單層的CEF細(xì)胞用胰酶消化后，接種到6孔板或其他合適的培養(yǎng)器皿中，待細(xì)胞長成致密單層。將病毒液進(jìn)行10倍系列稀釋，從10?1到10??。取不同稀釋度的病毒液0.1mL接種到細(xì)胞單層上，37℃吸附1-2h，期間輕輕搖晃培養(yǎng)器皿，使病毒均勻分布。吸附結(jié)束后，棄去病毒液，用PBS洗滌細(xì)胞單層2-3次，去除未吸附的病毒。然后加入含有0.5%-1%瓊脂糖或甲基纖維素的維持液，覆蓋細(xì)胞單層，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天。待空斑形成后，用中性紅等染料染色，未感染病毒的細(xì)胞被染色，而感染病毒的細(xì)胞形成的空斑則不著色，從而可以清晰地觀察和計數(shù)空斑。病毒滴度（PFU/mL）=空斑數(shù)×稀釋倍數(shù)×10。例如，若在10??稀釋度的病毒接種孔中觀察到50個空斑，則該病毒的滴度為50×10?×10=5×10?PFU/mL。準(zhǔn)確測定病毒滴度對后續(xù)實驗具有重要意義。在病毒濃縮和純化實驗中，已知的病毒滴度可以幫助確定合適的實驗參數(shù)，如融合蛋白與病毒的比例、結(jié)合時間和溫度等。若起始病毒滴度不準(zhǔn)確，可能導(dǎo)致融合蛋白與病毒結(jié)合不充分，影響病毒的濃縮和純化效率。在疫苗制備研究中，準(zhǔn)確的病毒滴度是確定疫苗抗原含量的關(guān)鍵依據(jù)?？乖窟^高或過低都可能影響疫苗的免疫效果，過高可能導(dǎo)致免疫反應(yīng)過強(qiáng)，引發(fā)不良反應(yīng)；過低則可能無法刺激機(jī)體產(chǎn)生足夠的免疫應(yīng)答，無法提供有效的保護(hù)。在病毒生物學(xué)特性研究中，病毒滴度可以反映病毒的感染能力和復(fù)制水平。通過比較不同條件下病毒滴度的變化，可以深入了解病毒的感染機(jī)制、復(fù)制動力學(xué)以及對不同環(huán)境因素的敏感性等。4.2融合蛋白結(jié)合IBDV的條件優(yōu)化為了實現(xiàn)基于ELP-Hsp90α融合蛋白對IBDV的高效捕獲，深入探究融合蛋白與IBDV的最佳結(jié)合條件至關(guān)重要。本研究從溫度、pH值、離子強(qiáng)度等關(guān)鍵因素入手，通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒炘O(shè)計和系統(tǒng)的數(shù)據(jù)分析，確定了最佳結(jié)合條件。首先，設(shè)置不同的溫度梯度，分別為4℃、25℃、37℃，探究溫度對融合蛋白與IBDV結(jié)合的影響。將純化后的ELP-Hsp90α融合蛋白與IBDV病毒樣本按1:50的比例混合，在不同溫度下孵育2h。孵育結(jié)束后，利用ELISA方法檢測結(jié)合在融合蛋白上的IBDV的量。結(jié)果顯示，在4℃時，融合蛋白與IBDV的結(jié)合量相對較低；在25℃時，結(jié)合量有所增加；而在37℃時，結(jié)合量達(dá)到最高。這表明37℃更有利于融合蛋白與IBDV的結(jié)合，可能是因為在該溫度下，融合蛋白和IBDV的分子構(gòu)象更加適配，有利于兩者之間的特異性結(jié)合。接著，研究pH值對結(jié)合的影響。設(shè)置不同的pH值梯度，分別為pH6.0、pH7.0、pH8.0、pH9.0。將融合蛋白與病毒樣本按1:50的比例混合，在37℃下孵育2h，同樣采用ELISA方法檢測結(jié)合的病毒量。實驗結(jié)果表明，在pH7.0時，融合蛋白與IBDV的結(jié)合量最高；當(dāng)pH值偏離7.0時，結(jié)合量逐漸降低。這說明中性環(huán)境（pH7.0）最適合融合蛋白與IBDV的結(jié)合，可能是因為在該pH值下，融合蛋白和IBDV表面的電荷分布較為穩(wěn)定，有利于兩者之間的靜電相互作用和特異性結(jié)合。離子強(qiáng)度也是影響融合蛋白與IBDV結(jié)合的重要因素。通過在結(jié)合緩沖液中添加不同濃度的NaCl，設(shè)置離子強(qiáng)度梯度為0mM、100mM、200mM、300mM。將融合蛋白與病毒樣本按1:50的比例混合，在37℃、pH7.0的條件下孵育2h，利用ELISA檢測結(jié)合的病毒量。結(jié)果顯示，隨著離子強(qiáng)度的增加，融合蛋白與IBDV的結(jié)合量先增加后減少。在離子強(qiáng)度為200mM時，結(jié)合量達(dá)到最高。這表明適當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度可以促進(jìn)融合蛋白與IBDV的結(jié)合，可能是因為離子強(qiáng)度的變化會影響融合蛋白和IBDV表面的電荷分布和水化層厚度，從而影響兩者之間的相互作用。當(dāng)離子強(qiáng)度過高時，可能會屏蔽融合蛋白與IBDV之間的特異性結(jié)合位點，導(dǎo)致結(jié)合量下降。為了