GB/T31270.14-XXXX

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的

規(guī)定起草。

本文件是GB/T31270《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》的第14部分。GB/T31270已經(jīng)發(fā)布

了以下部分：

——第1部分：土壤代謝試驗(yàn)；

——第2部分：水解試驗(yàn)；

——第3部分：水中直接光解試驗(yàn)；

——第4部分：土壤吸附/解吸試驗(yàn)；

——第5部分：土壤淋溶試驗(yàn)；

——第6部分：揮發(fā)性試驗(yàn)；

——第7部分：生物富集試驗(yàn)；

——第8部分：水-沉積物系統(tǒng)代謝試驗(yàn)；

——第9部分：鳥類短期飼喂毒性試驗(yàn)；

——第10部分：蜜蜂急性毒性試驗(yàn)；

——第11部分：家蠶急性毒性試驗(yàn)；

——第12部分：魚類急性毒性試驗(yàn)；

——第13部分：溞類急性活動抑制試驗(yàn)；

——第14部分：藻類生長抑制試驗(yàn)；

——第15部分：蚯蚓急性毒性試驗(yàn)；

——第16部分：土壤微生物毒性試驗(yàn)；

——第17部分：天敵赤眼蜂急性毒性試驗(yàn)；

——第18部分：天敵兩棲類急性毒性試驗(yàn)；

——第19部分：非靶標(biāo)植物影響試驗(yàn)；

——第20部分：家畜短期飼喂毒性試驗(yàn)；

——第21部分：大型甲殼類生物毒性試驗(yàn)；

——第22部分：土壤表面光解試驗(yàn)；

——第23部分：鳥類急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)。

本文件代替GB/T31270.14-2014《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則第9部分：藻類急性毒性

試驗(yàn)》，與GB/T31270.14-2014相比，除結(jié)構(gòu)調(diào)整和編輯性改動外，主要技術(shù)變化如下：

GB/T31270.14-XXXX

a)增加了規(guī)范性引用文件款項(xiàng)（見第2章）；

b)更改了術(shù)語和定義，更改了平均生長率、生物量增長的定義，刪除了供試物、化學(xué)農(nóng)藥、

原藥、制劑、有效成分、參比物質(zhì)的定義（見3.2、3.3，2014年版的2.4、2.5、2.6、2.7、

2.8、2.9）；

c)更改了試驗(yàn)條件要求（見第5章,2014年版的4.1.5）；

d)增加了試劑要求（見6.1）；

e)更改了供試生物要求，新增了硅藻和藍(lán)藻類供試藻種，刪除了普通小球藻，將“羊角月牙

藻”修改為“近頭狀尖胞藻”（見6.2,2014年版的4.1.1）

f)增加了試驗(yàn)容器基本要求（見6.3）；

g)更改了培養(yǎng)基要求（見6.4,2014年版的4.1.4）；

h)更改了儀器設(shè)備相關(guān)要求（見第7章,2014年版的4.1.3）；

i)更改了被試物要求（見第8.1,2014年版的4.1.2）；

j)更改了藻液預(yù)培養(yǎng)方法（見第9.1,2014年版的4.2.1）；

k)增加了試驗(yàn)藥液制備相關(guān)要求（見9.3.2）；

l)更改了染毒和培養(yǎng)方法（見9.3.3、9.3.4,2014年版的4.2.3）；

m)更改了觀察與測定方法（見9.3.5,2014年版的4.2.3）；

n)增加了濃度檢測方法（見9.3.6）；

o)增加了試驗(yàn)數(shù)據(jù)整理要求（見10.1）；

p)更改了試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法（見10.4,2014年版的4.3.3）；

q)更改了質(zhì)量控制條件，新增了參比物試驗(yàn)結(jié)果有效性參考值（見第11章,2014年版的4.4）；

r)更改了試驗(yàn)報(bào)告相關(guān)要求（見第12章，2014年版的第5章）；

s)刪除了SE培養(yǎng)基配方（2014年版的4.4附錄A表A.3）；

t)增加了OECD藻類培養(yǎng)基配方（見附錄A表A.3）；

u)增加了對照組平均生長速率變異系數(shù)的計(jì)算示例（見附錄B）；

v)刪除了農(nóng)藥對藻類毒性等級劃分相關(guān)內(nèi)容（2014年版的附錄B）。

請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。

本文件由中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出并歸口。

本文件起草單位：農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所等。

本文件主要起草人：陳朗、曲甍甍、趙榆、楊海榮、周艷明、袁善奎、王菲迪、俞瑞鮮、藍(lán)

帥、周彬彬、蒲倩云。

本文件及其所代替文件的歷次版本發(fā)布情況為：

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——2014年首次發(fā)布為GB/T31270.14-2014。

——本次為第一次修訂。

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化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則

第14部分：藻類生長抑制試驗(yàn)

1范圍

本文件規(guī)定了化學(xué)農(nóng)藥藻類生長抑制試驗(yàn)的試驗(yàn)條件、試劑或材料、儀器設(shè)備、樣品、試驗(yàn)

步驟、試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理、質(zhì)量控制以及試驗(yàn)報(bào)告等的基本要求。

本文件適用于為化學(xué)農(nóng)藥登記而進(jìn)行的藻類生長抑制試驗(yàn)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引

用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修

改單）適用于本文件。

NY/T3273難處理農(nóng)藥水生生物毒性試驗(yàn)指南

NY/T4195.6農(nóng)藥登記環(huán)境影響試驗(yàn)生物試材培養(yǎng)第6部分：近頭狀尖胞藻

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

半效應(yīng)濃度medianeffectiveconcentration

在生長抑制試驗(yàn)中，與對照相比，引起受試藻生物量增長或者平均生長速率下降50％時(shí)的被

試物濃度，用EC50表示。在本文件中，通過藻類生物量增長的抑制率計(jì)算而得到的EC50用EyC50

表示，通過藻類平均生長速率的抑制率計(jì)算而得的EC50用ErC50表示。

注：單位為毫克每升（mg/L）。

3.2

平均生長速率averagegrowthrate（averagespecificgrowthrate）

特定暴露時(shí)段內(nèi)的平均生長速率，即暴露結(jié)束與暴露開始時(shí)受試藻生物量的自然對數(shù)值

之差除以時(shí)長（如3d），用μ表示。

3.3

生物量增長量yield

特定暴露時(shí)段內(nèi)的生物量增長量，即暴露結(jié)束時(shí)的生物量減去暴露開始時(shí)的生物量，用Y表

示。

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4原理

用被試物及藻類培養(yǎng)基配制一系列不同濃度的試驗(yàn)藥液，將試驗(yàn)藥液與藻液混合后，連續(xù)染

毒72h。試驗(yàn)期間觀察受試藻的生長抑制情況，求出半效應(yīng)濃度72h-EC50（EyC50、ErC50）及其

95％置信區(qū)間。

5試驗(yàn)條件

試驗(yàn)期間應(yīng)滿足以下條件：

a)環(huán)境溫度21℃～24℃，但單次試驗(yàn)應(yīng)控制在±1℃；

b)連續(xù)均勻光照，光源為400nm～700nm波長的冷白燈或日光燈，光照強(qiáng)度4440lux～8880

lux，不同位點(diǎn)光照強(qiáng)度差異應(yīng)控制在15%范圍內(nèi)；

c)空白對照pH變化范圍不超過1.5；

d)以一定轉(zhuǎn)速持續(xù)振蕩或攪拌藻液，例如每分鐘（100±20）轉(zhuǎn)。

6試劑或材料

6.1試劑

6.1.13,5-二氯苯酚（C6H4Cl2O，CAS號：591-35-5），分析純以上。

6.1.2重鉻酸鉀（K?Cr?O?，CAS號：7778-50-9），分析純以上。

6.1.3丙酮（C3H6O，CAS號：67-64-1）和叔丁醇（C4H10O，CAS號：75-65-0）等有機(jī)溶劑。

6.2供試生物

6.2.1宜選擇不易附著于瓶壁上的藻類作為供試生物，例如：

a）綠藻

——近頭狀尖胞藻（Raphidocelissubcapitata，曾用名Pseudokirchneriellasubcapitata），按照

NY/T4195.6培養(yǎng)；

——近具棘鏈帶藻（Desmodesmussubspicatus）。

b）硅藻

——舟形藻（Naviculapelliculosa）。

c）藍(lán)藻

——水華魚腥藻（Anabaenaflos-aquae）；

——聚球藻（Synechococcusleopoliensis）。

6.2.2如使用其他藻種，應(yīng)說明原因，報(bào)告藻種名稱及來源。確保供試藻在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)時(shí)能

保持指數(shù)生長狀態(tài)。

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6.3試驗(yàn)容器

6.3.1容器材質(zhì)

試驗(yàn)容器及任何可能接觸到試驗(yàn)藥液的器件均應(yīng)由玻璃或其他化學(xué)惰性材料制成。不應(yīng)使用

硅膠管、硅膠密封圈等吸附性較強(qiáng)的材料，確需使用時(shí)，相關(guān)器件不能重復(fù)利用，試驗(yàn)后立即作

為廢棄物處理。

6.3.2容器體積

試驗(yàn)容器應(yīng)與試驗(yàn)藥液體積相匹配，常見配置如下：

a)125mL三角瓶，盛裝試驗(yàn)藥液體積宜為（40～60）mL。

b)250mL三角瓶，盛裝試驗(yàn)藥液體積宜為（70～100）mL。

c)500mL三角瓶，盛裝試驗(yàn)藥液體積宜為（100～150）mL。

6.3.3其他要求

試驗(yàn)容器應(yīng)配備便于CO2傳遞的透氣塞，所有器具均應(yīng)在試驗(yàn)前進(jìn)行徹底清洗和滅菌處

理。

6.4培養(yǎng)基

6.4.1近具棘鏈帶藻宜使用水生4號培養(yǎng)基或OECD藻類培養(yǎng)基，近頭狀尖胞藻宜使用BG11培

養(yǎng)基或OECD藻類培養(yǎng)基，硅藻和藍(lán)藻宜使用OECD藻類培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的配制參見附錄A。

若使用其他培養(yǎng)基應(yīng)同時(shí)提供培養(yǎng)基名稱和配方等信息。

6.4.2若使用其他藻種，應(yīng)選擇適宜的培養(yǎng)基，并同時(shí)提供培養(yǎng)基名稱和配方等信息。

6.4.3當(dāng)被試物具有金屬螯合作用或在其他特定pH條件下開展試驗(yàn)需調(diào)整培養(yǎng)基配方時(shí)，應(yīng)詳細(xì)

描述改良的配方并評價(jià)其適用性。

7儀器設(shè)備

7.1pH計(jì)。

7.2電子天平、移液器、量筒、容量瓶等量器量具。

7.3高壓蒸汽滅菌鍋。

7.4超凈工作臺等無菌操作設(shè)備、器具。

7.5溫度監(jiān)控設(shè)備。

7.6配備球形傳感器或余弦傳感器的照度計(jì)。

7.7光照振蕩培養(yǎng)箱等培養(yǎng)設(shè)備。

7.8顯微鏡與血球計(jì)數(shù)板、分光光度計(jì)、流式細(xì)胞儀、電子顆粒計(jì)數(shù)儀等藻細(xì)胞計(jì)數(shù)設(shè)備。

7.9離心機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀等前處理設(shè)備。

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7.10氣相色譜儀、高效液相色譜儀、質(zhì)譜儀、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀

等化學(xué)分析設(shè)備。

8樣品

8.1被試物

農(nóng)藥原（母）藥、制劑或純品。試驗(yàn)開始前，收集被試物以下信息：

a)劑型，以及有效成分結(jié)構(gòu)式、分子量、純度/含量等基本信息；

b)在水中和有機(jī)溶劑中的溶解度；

c)在水中的穩(wěn)定性和光解穩(wěn)定性，光吸收特性；

d)飽和蒸氣壓；

e)正辛醇/水分配系數(shù)；

f)解離常數(shù)；

g)生物降解性數(shù)據(jù)（如有）；

h)作用方式；

i)用于定量檢測試驗(yàn)藥液中被試物濃度的分析方法等。

8.2參比物

3,5-二氯苯酚或重鉻酸鉀。

9試驗(yàn)步驟

9.1藻液預(yù)培養(yǎng)

無菌操作環(huán)境下將藻種接種到新鮮無菌培養(yǎng)基，按試驗(yàn)條件培養(yǎng)。每隔48h～96h接種1次，

反復(fù)接種2次～3次，使其處于指數(shù)生長期，備用。每次接種時(shí)在顯微鏡下檢查藻種的生長情況。

也可從儲備培養(yǎng)中移取一定量藻液，接種至新鮮無菌培養(yǎng)基，在試驗(yàn)條件下培養(yǎng)2d～4d，使其

達(dá)到指數(shù)生長狀態(tài)，備用。

9.2預(yù)試驗(yàn)

按正式試驗(yàn)的條件，以較大的間距設(shè)置若干組濃度，為正式試驗(yàn)濃度設(shè)置提供參考。

9.3正式試驗(yàn)

9.3.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)

按照預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，以一定比例間距（幾何級差≤3.2）設(shè)置5個(gè)～7個(gè)處理組，同時(shí)設(shè)空白對

照，使用溶劑助溶時(shí)還應(yīng)增設(shè)溶劑對照。每個(gè)處理組均設(shè)3個(gè)重復(fù)，對照組以6個(gè)重復(fù)為宜。處

理組濃度的設(shè)置以引起受試藻平均生長速率產(chǎn)生5%～75%的抑制效應(yīng)為宜?？蓡为?dú)制備一套試驗(yàn)

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藥液用于被試物濃度檢測，但也應(yīng)接種同等生物量的藻細(xì)胞并在置于相同試驗(yàn)條件下培養(yǎng)。

9.3.2試驗(yàn)藥液制備

9.3.2.1用培養(yǎng)基將被試物或由被試物制備而成的儲備液稀釋成試驗(yàn)藥液，通過超聲、攪拌等方法

混合均勻。應(yīng)觀察并記錄試驗(yàn)藥液的顏色和狀態(tài)（例如是否澄清、是否為均勻分散的懸浮液或乳

狀液、是否出現(xiàn)沉淀等）。

9.3.2.2被試物揮發(fā)性強(qiáng)、吸附性強(qiáng)、在測試條件下不穩(wěn)定或難溶于水而難以達(dá)到或者保持暴露濃

度，或?qū)е略囼?yàn)藥液有顏色時(shí)，按照NY/T3273規(guī)定的程序開展試驗(yàn)。

9.3.2.3確需使用助溶劑的，應(yīng)使用對藻類低毒的有機(jī)溶劑（如丙酮、叔丁醇），其用量應(yīng)≤0.1mL

（g）/L，且所有處理組和對照組的用量應(yīng)一致。

注：出于對人體健康和安全的考慮，應(yīng)盡可能避免使用二甲基甲酰胺和二甲基亞砜。

9.3.2.4試驗(yàn)藥液短暫靜置后出現(xiàn)沉淀時(shí)，可采用虹吸管、離心、過濾膜等方式分離沉淀物，但不

應(yīng)改變被試物特性。例如，對于農(nóng)藥混配制劑，試驗(yàn)藥液中有效成分的比例不應(yīng)與其產(chǎn)品配比發(fā)

生顯著變化。

9.3.3染毒

按一定比例將藻液接種到試驗(yàn)藥液中。所有處理組包括對照組應(yīng)含有相同濃度的培養(yǎng)基和初

始藻細(xì)胞生物量。近具棘鏈帶藻初始藻細(xì)胞濃度為2.0×103個(gè)/mL～5.0×103個(gè)/mL，近頭狀尖胞

藻初始藻細(xì)胞濃度為5.0×103個(gè)/mL～5.0×104個(gè)/mL。

9.3.4培養(yǎng)

染毒后，用透氣塞蓋上試驗(yàn)容器，搖勻，在培養(yǎng)設(shè)備中隨機(jī)擺放。通過持續(xù)振蕩或攪拌，確

保藻細(xì)胞保持懸浮狀態(tài)。當(dāng)pH波動＞1.5，可增大振蕩、攪拌頻率，或減少初始藻細(xì)胞濃度。試

驗(yàn)周期為72h。

9.3.5觀察與測定

9.3.5.1每隔24h取樣測定藻細(xì)胞數(shù)，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)觀察藻細(xì)胞是否出現(xiàn)異常外觀。依據(jù)試驗(yàn)藥液性

狀選擇適宜的計(jì)數(shù)方法：

a)血球計(jì)數(shù)板法：在顯微鏡下準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，同一樣品至少計(jì)數(shù)2次，如48h、72h計(jì)數(shù)結(jié)果相

差＞15%，應(yīng)重復(fù)計(jì)數(shù)。

b)其他檢測方法，例如分光光度法等，應(yīng)確保選用的方法與血球計(jì)數(shù)法具有足夠的相關(guān)性。

注：采用分光光度法，應(yīng)使用光程至少為4cm的比色皿。

9.3.5.2試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)，測定各個(gè)試驗(yàn)容器中的pH值。

9.3.6濃度檢測

9.3.6.1數(shù)據(jù)表明試驗(yàn)期間被試物濃度能維持在設(shè)定濃度的80%~120%時(shí)，可僅檢測最高濃度、最

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低濃度和接近EC50的處理組，以及對照組，否則，應(yīng)測定所有處理組濃度，并提高采樣頻率（如

每24h檢測1次）。

9.3.6.2檢測方法應(yīng)確保測定結(jié)果能夠反映被試物的溶解態(tài)濃度。當(dāng)試驗(yàn)藥液濃度高于其有效成分

水中溶解度時(shí)，在對水樣進(jìn)行提取等化學(xué)分析前處理操作之前，應(yīng)進(jìn)行離心或過膜處理：

a)離心法：在（100000～400000）m/s2（10197×g～40789×g）的轉(zhuǎn)速下離心30min。

b)濾膜過濾法：使用孔徑為（0.22～0.45）μm的惰性材料濾膜過濾，濾膜在使用前先用純水

潤洗，然后再用試驗(yàn)藥液潤洗。

9.3.6.3當(dāng)被試物不穩(wěn)定時(shí)，對采集的樣品應(yīng)立即進(jìn)行檢測，否則應(yīng)驗(yàn)證儲存穩(wěn)定性。

9.4限度試驗(yàn)

限度試驗(yàn)僅設(shè)1個(gè)處理組。處理組和對照組（必要時(shí)還包括溶劑對照組）均設(shè)6個(gè)重復(fù)。試

驗(yàn)藥液制備、染毒、培養(yǎng)、觀察與測定，以及濃度檢測均與正式試驗(yàn)相同。當(dāng)與對照組相比，處

理組未對藻類生長產(chǎn)生顯著影響（例如t檢驗(yàn)結(jié)果顯示P>0.05），無需開展正式試驗(yàn)。處理組濃

度設(shè)為下述2個(gè)濃度中的低值：

a)以農(nóng)藥有效成分計(jì)，100mg/L；

b)實(shí)際可配制得到的最高濃度，即采取超聲、攪拌、振蕩或溶劑助溶等措施后，被試物在試

驗(yàn)液中的最高濃度。

9.5參比物試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)室內(nèi)采用3,5-二氯苯酚或重鉻酸鉀對定期（至少1年2次）進(jìn)行參比物試驗(yàn)。

10試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

10.1數(shù)據(jù)整理

以表格形式總結(jié)數(shù)據(jù)，給出每個(gè)觀察時(shí)間，每個(gè)處理組和對照組（包括溶劑對照組）每個(gè)重

復(fù)的藻細(xì)胞計(jì)數(shù)或測定結(jié)果、異常外觀等，并繪制生長曲線圖。在藻細(xì)胞指數(shù)生長期，通過對其

數(shù)量進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換，生長曲線能擬合成1條直線，其斜率即代表藻細(xì)胞在此期間的平均生長速率。

10.2基于生物量增長計(jì)算抑制率

基于藻類生物量增長計(jì)算的處理組受抑制率按公式（1）計(jì)算。

YY

ct…………………（）

Iy1001

Yc

式中：

Iy——基于生物量增長計(jì)算的處理組受抑制率（%）；

Yc——對照組生物量增長量，用細(xì)胞數(shù)表示時(shí)單位為個(gè)/mL；

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Yt——處理組生物量增長量，用細(xì)胞數(shù)表示時(shí)單位為個(gè)/mL。

10.3基于生長速率計(jì)算抑制率

基于藻類平均生長速率計(jì)算的處理組受抑制率按公式（2）計(jì)算。

ct…………………（）

Ir1002

c

式中：

Ir——基于平均生長速率計(jì)算的處理組受抑制率（%）；

μc——對照組平均生長速率；

μt——處理組平均生長速率。

其中μ按公式（3）計(jì)算：

lnXlnX

ji…………………（）

ji3

tjti

式中：

μj-i——在時(shí)間點(diǎn)i到時(shí)間點(diǎn)j之間的平均生長速率；

Xi——在時(shí)間點(diǎn)i時(shí)的藻類生物量，用細(xì)胞數(shù)表示時(shí)單位為個(gè)/mL；

Xj——在時(shí)間點(diǎn)j時(shí)的藻類生物量，用細(xì)胞數(shù)表示時(shí)單位為個(gè)/mL。

10.4半效應(yīng)濃度

10.4.1繪制濃度?效應(yīng)曲線圖。

選擇適宜的統(tǒng)計(jì)方法（如概率單位法、二項(xiàng)式法）和統(tǒng)計(jì)軟件，分別以設(shè)定濃度和實(shí)測濃度

估算EC50（EyC50、ErC50）及其95%置信區(qū)間（限度試驗(yàn)除外）。宜選用基于實(shí)測濃度（幾何均值）

表示試驗(yàn)結(jié)果。實(shí)測濃度與設(shè)定濃度（或初始實(shí)測濃度）偏差＜20%時(shí)，也可以設(shè)定濃度（或初始

實(shí)測濃度）表示。

11質(zhì)量控制

質(zhì)量控制條件包括：

a)受試藻應(yīng)為處于指數(shù)生長期的純種藻；

b)初始藻細(xì)胞濃度滿足要求：近具棘鏈帶藻濃度在2.0×103個(gè)/mL～5.0×103個(gè)/mL，近頭

狀尖胞藻在5.0×103個(gè)/mL～5.0×104個(gè)/mL；

d)試驗(yàn)期間對照組藻細(xì)胞呈指數(shù)生長，且72h內(nèi)生物量至少增加16倍，即平均生長速率≥

0.92/d。否則，應(yīng)延長試驗(yàn)周期；

e)對照組各時(shí)段（0h～24h、24h～48h、48h～72h）生長速率的平均變異系數(shù)（CV）≤

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35%，計(jì)算方法參見附錄B表B.1；

f)對照組試驗(yàn)周期內(nèi)平均生長速率的變異系數(shù)應(yīng)≤7%（其他藻類可≤10%）。計(jì)算方法參見

附錄B表B.2。

g)參比物3,5-二氯苯酚對近具棘鏈帶藻和近頭狀尖胞藻的72h-ErC50分別為4.04mg/L～8.80

mg/L和2.08mg/L～4.68mg/L；重鉻酸鉀對近具棘鏈帶藻和近頭狀尖胞藻的72h-ErC50分別為0.72

mg/L～0.96mg/L和0.92mg/L～1.46mg/L。

h)對試驗(yàn)中偏離試驗(yàn)準(zhǔn)則的情形均進(jìn)行了描述和評估。

12試驗(yàn)報(bào)告

試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括下列內(nèi)容：

a)被試物：

1)供試農(nóng)藥名稱（有效成分及其含量、劑型）、外觀、來源、保存條件；

2)有效成分結(jié)構(gòu)式、分子量、CAS號，以及基本理化性質(zhì)如水溶解度、穩(wěn)定性等信息；

b)供試生物

1)名稱/品系；

2)來源/批次；

3)培養(yǎng)基，以及在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的保種與培養(yǎng)情況；

c)試驗(yàn)條件：

1）試驗(yàn)容器，如容量、型號、密閉方法、藥液盛裝體積等；

2）培養(yǎng)基；

3）試驗(yàn)日程；

4）儀器設(shè)備；

5）振蕩或通氣方式；

6）環(huán)境條件，如溫度、光照（光強(qiáng)和光周期）、pH等。

d)試驗(yàn)方法：

1）試驗(yàn)周期；

2）試驗(yàn)濃度設(shè)置及其依據(jù)；

3）儲備液及試驗(yàn)藥液配制方法，溶劑及其濃度，試驗(yàn)藥液外觀等；

4）初始藻細(xì)胞濃度；

5）藻細(xì)胞濃度計(jì)數(shù)、測定方法；

6）為測定溶解性濃度所做的相關(guān)操作，如離心、過濾等；

7）試驗(yàn)藥液濃度檢測，包括采樣方法與頻率、濃度檢測方法等；

8）毒性試驗(yàn)終點(diǎn)與各類指標(biāo)觀測方法等。

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e)試驗(yàn)結(jié)果：

1）檢測方法的重現(xiàn)性及靈敏度；

2）檢測方法的回收率、最低定量限等；

3）試驗(yàn)藥液濃度檢測結(jié)果，以列表形式給出結(jié)果：

——對照組和處理組每次濃度檢測結(jié)果；

——每個(gè)處理組初始測定濃度與設(shè)定濃度的百分比，試驗(yàn)結(jié)束與試驗(yàn)開始的測定濃度百

分比，實(shí)測濃度幾何平均值等；

——被試物為農(nóng)藥混配制劑時(shí)，應(yīng)分別給出單個(gè)有效成分檢測結(jié)果和總檢測結(jié)果；

4）試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)的pH值，試驗(yàn)期間水溫等；

5）每個(gè)觀測時(shí)間點(diǎn)每個(gè)容器中的藻細(xì)胞生物量、各時(shí)段的生物量增長量、平均生長速率；

6）生長曲線，即生物量隨時(shí)間變化的曲線；

7）如可能，濃度-效應(yīng)曲線圖、斜率；

8）如可能，24h、48h和72h的EC50（EyC50和/或ErC50）及其95%置信區(qū)間，并給出所采

用的計(jì)算與統(tǒng)計(jì)方法；

9）試驗(yàn)質(zhì)量控制條件描述，包括參比物試驗(yàn)日期、結(jié)果、是否滿足質(zhì)量控制條件等；

10）試驗(yàn)過程中發(fā)生的可能影響結(jié)果的事件，偏離試驗(yàn)準(zhǔn)則的情況、后果及相關(guān)解釋與

評價(jià)；

11）分析方法驗(yàn)證和濃度檢測典型譜圖。

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附錄A

(資料性)

培養(yǎng)基的配制

水生4號的配方及配制過程見表A.1，BG11的配方及配制過程見表A.2，OECD藻類培養(yǎng)

基的配方及配制過程見表A.3。

表A.1水生4號培養(yǎng)基

序號組分用量

1硫酸銨（(NH4)2SO4，CAS號：7783-20-2）2.00g

2過磷酸鈣飽和液（[Ca(H2PO4)2?H2O?（CaSO4?H2O）]，CAS號：10031-30-8）10.0mL

3七水合硫酸鎂（MgSO4·7H2O，CAS號：10034-99-8）0.80g

4碳酸氫鈉（NaHCO3，CAS號：144-55-8）1.00g

5氯化鉀（KCl，CAS號：7447-40-7）0.25g

61%三氯化鐵溶液（FeCl3，CAS號：7705-08-0）1.50mL

7土壤提取液*5.00mL

土壤提取液：取花園土未施過肥200g置于燒杯或三角瓶中，加入蒸餾水1000mL，瓶口用透氣塞封口，

在水浴中沸水加熱3h，冷卻，沉淀24h，此過程連續(xù)進(jìn)行3次，然后過濾，取上清液，于高壓滅菌鍋中滅

菌后于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

以上成分用蒸餾水溶解并定容至1000mL，經(jīng)高壓滅菌（121℃，15min），密封并貼好標(biāo)簽，4℃冰箱

保存，有效期2個(gè)月。該培養(yǎng)基用經(jīng)高壓滅菌（121℃，15min）的蒸餾水稀釋10倍后即可使用。

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表A.2BG11培養(yǎng)基

序號組分母液濃度母液用量

1硝酸鈉（NaNO3，CAS號：7631-99-4）15g/100mLdH2O10mL

2磷酸氫二鉀（K2HPO4，CAS號：7758-11-4）2g/500mLdH2O10mL

3七水合硫酸鎂（MgSO4?7H2O，CAS號：10034-99-8）3.75g/500mLdH2O10mL

4二水合氯化鈣（CaCl2?2H2O，CAS號：10035-04-8）1.8g/500mLdH2O10mL

5檸檬酸（C6H8O7，CAS號：77-92-9）0.3g/500mLdH2O10mL

6檸檬酸鐵銨（FeC6H5O7·NH4OH，CAS號：1185-57-5）0.3g/500mLdH2O10mL

7EDTA鈉鹽（EDTANa2，CAS號：6381-92-6）0.05g/500mLdH2O10ml

8碳酸鈉（Na2CO3，CAS號：497-19-8）1.0g/500mLdH2O10mL

9硼酸（H3BO3，CAS號：10043-35-3）2.86g/LdH2O

A5四水氯化錳（MnCl2?4H2O，CAS號：13446-34-9）1.86g/LdH2O

(微量金七水硫酸鋅（ZnSO4?7H2O，CAS號：7446-20-0）0.22g/LdH2O1mL

屬溶液)二水鉬酸鈉（Na2MoO4?2H2O，CAS號：10028-24-7）0.39g/LdH2O

1mL/L五水硫酸銅（CuSO4?.5H2O，CAS號：7758-99-8）0.08g/LdH2O

六水硝酸鈷（Co(NO3)2?6H2O，CAS號：10026-22-9）0.05g/LdH2O

將以上各成分配制成相應(yīng)母液濃度，并按照標(biāo)明順序依次將相應(yīng)母液用量轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中，定容，經(jīng)高

壓滅菌（121℃，15min），密封并貼好標(biāo)簽，4℃冰箱保存，有效期2個(gè)月。該培養(yǎng)基用經(jīng)高壓滅菌（121℃，15

min）的蒸餾水稀釋10倍后即可使用。

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表A.3OECD藻類培養(yǎng)基

營養(yǎng)鹽儲備液中的質(zhì)量濃度取用體積最終定容體積

儲備液1：常量營養(yǎng)鹽

氯化銨（NH4Cl，CAS號：12125-02-9）1.5g/L

六水合氯化鎂（MgCl2?6H2O，CAS號：7791-18-6）1.2g/L

10mL

二水合氯化鈣（CaCl2?2H2O，CAS號：10035-04-8）1.8g/L

七水合硫酸鎂（MgSO4?7H2O，CAS號：10034-99-8）1.5g/L

磷酸二氫鉀（KH2PO4，CAS號：7778-77-0）0.16g/L

儲備液2：Fe-EDTA

六水合氯化鐵（FeCl3?6H2O，CAS號：10025-77-1）64mg/L

1mL

EDTA二鈉二水合物（Na2EDTA?2H2O，CAS號：205-100mg/L

358-3）

1000mL

儲備液3：微量元素

硼酸（H3BO3，CAS號：10043-35-3）185mg/L

四水合氯化錳（MnCl2?4H2O，CAS號：13446-34-9）415mg/L

氯化鋅（ZnCl2，CAS號：7646-85-7）3mg/L1mL

六水合氯化鈷（CoCl2?6H2O，CAS號：7791-13-1）1.5mg/L

二水合氯化銅（CuCl2?2H2O，CAS號：10125-13-0）0.01mg/L

二水合鉬酸鈉（Na2MoO4?2H2O，CAS號：10102-40-6）7mg/L

儲備液4：碳酸氫鹽

碳酸氫鈉（NaHCO3，CAS號：144-55-8）50g/L1mL

九水合硅酸鈉（Na2SiO3?9H2O，CAS號：13517-24-3）*

將配制好的儲備液經(jīng)0.2μm濾膜過濾或高壓滅菌（120℃，15min），4℃避光冷藏保存。儲備液2和儲備

液4只能通過濾膜過濾滅菌。

*僅供試生物為硅藻試驗(yàn)時(shí)需要添加，其在培養(yǎng)基中的濃度為1.4mgSi/L。

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附錄B

(資料性)

對照組生長速率變異系數(shù)的計(jì)算示例

B.1對照組各時(shí)段（0h～24h、24h～48h、48h～72h）平均生長速率的平均變異系數(shù)計(jì)算方法

見表B.1。

表B.1對照組各時(shí)段平均生長速率的平均變異系數(shù)（示例）

重復(fù)平均生長速率（μ）（d-1）

0h～24h24h～48h48h～72h平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差%CV

12.0180.9941.2551.4220.53237.4

21.5690.9481.3541.2900.31524.4

31.9741.6671.2671.6360.35521.7

41.5231.1691.4111.3680.18113.2

51.2671.3581.1181.2480.1219.7

61.3511.2791.2381.2890.0574.4

平均值1.3760.26018.5

B.2對照組試驗(yàn)期間平均生長速率變異系數(shù)計(jì)算示例見表B.2。

表B.2對照組平均生長速率變異系數(shù)計(jì)算（示例）

重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)3重復(fù)4重復(fù)5重復(fù)6平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差%CV

0h～

72h

1.4121.4421.3881.5031.4671.3591.4290.05283.7

GB/T31270.14-XXXX

參考文獻(xiàn)

[1]OECD(2011).Guideline201:FreshwaterAlgaandCyanobacteria,GrowthInhibitionTest.OECD

GuidelinesfortheTestingofChemicals.

[2]GuidanceDocumentonAquaticToxicityTestingofDifficultSubstancesandMixtures.OECD

EnvironmentalHealthandSafetyPublication.SeriesonTestingandAssessment.No.23(second

edition).Paris2019.

ICS65.100

CCSB13

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)

GB/T31270.14×××××

代替GB/T31270.14-2014

化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則

第14部分：藻類生長抑制試驗(yàn)

Testguidelinesonenvironmentalsafetyassessmentforchemical

pesticides——Part14:Algagrowthinhibitiontest

(征求意見稿)

在提交反饋意見時(shí)，請將您知道的相關(guān)專利連同支持性文件一并附上。

××-××-××發(fā)布××-××-××實(shí)施

GB/T31270.14-XXXX

化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則

第14部分：藻類生長抑制試驗(yàn)

1范圍

本文件規(guī)定了化學(xué)農(nóng)藥藻類生長抑制試驗(yàn)的試驗(yàn)條件、試劑或材料、儀器設(shè)備、樣品、試驗(yàn)

步驟、試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理、質(zhì)量控制以及試驗(yàn)報(bào)告等的基本要求。

本文件適用于為化學(xué)農(nóng)藥登記而進(jìn)行的藻類生長抑制試驗(yàn)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引

用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修

改單）適用于本文件。

NY/T3273難處理農(nóng)藥水生生物毒性試驗(yàn)指南

NY/T4195.6農(nóng)藥登記環(huán)境影響試驗(yàn)生物試材培養(yǎng)第6部分：近頭狀尖胞藻

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

半效應(yīng)濃度medianeffectiveconcentration

在生長抑制試驗(yàn)中，與對照相比，引起受試藻生物量增長或者平均生長速率下降50％時(shí)的被

試物濃度，用EC50表示。在本文件中，通過藻類生物量增長的抑制率計(jì)算而得到的EC50用EyC50

表示，通過藻類平均生長速率的抑制率計(jì)算而得的EC50用ErC50表示。

注：單位為毫克每升（mg/L）。

3.2

平均生長速率averagegrowthrate（averagespecificgrowthrate）

特定暴露時(shí)段內(nèi)的平均生長速率，即暴露結(jié)束與暴露開始時(shí)受試藻生物量的自然對數(shù)值

之差除以時(shí)長（如3d），用μ表示。

3.3

生物量增長量yield

特定暴露時(shí)段內(nèi)的生物量增長量，即暴露結(jié)束時(shí)的生物量減去暴露開始時(shí)的生物量，用Y表

示。

GB/T31270.14-XXXX

4原理

用被試物及藻類培養(yǎng)基配制一系列不同濃度的試驗(yàn)藥液，將試驗(yàn)藥液與藻液混合后，連續(xù)染

毒72h。試驗(yàn)期間觀察受試藻的生長抑制情況，求出半效應(yīng)濃度72h-EC50（EyC50、ErC50）及其

95％置信區(qū)間。

5試驗(yàn)條件

試驗(yàn)期間應(yīng)滿足以下條件：

a)環(huán)境溫度21℃～24℃，但單次試驗(yàn)應(yīng)控制在±1℃；

b)連續(xù)均勻光照，光源為400nm～700nm波長的冷白燈或日光燈，光照強(qiáng)度4440lux～8880

lux，不同位點(diǎn)光照強(qiáng)度差異應(yīng)控制在15%范圍內(nèi)；