實驗九

WesternBlot鑒定目的蛋白實驗原理SDS轉膜結合一抗和二抗顯色蛋白質與SDS按1：1.4比例形成復合物，消除了各種蛋白質分子之間原有的電荷差異。蛋白質的遷移速度只取決于分子大小。在15-200KD之間，蛋白質的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關系：logMW=K-bmSDS實驗原理170kd130kd95kd72kd55kd43kd34kd26kd17kd10kd預染karkerWesternBlottingWesternBlotting顯色原理二氨基聯(lián)苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）是過氧化物酶（Peroxidase）的生色底物，在過氧化氫的存在下失去電子而呈現(xiàn)出顏色變化和積累，形成棕褐色不溶性產物。樣品和抗體大腸桿菌可溶蛋白（含GST-纖維素酶融合蛋白）一抗鼠抗GST抗體二抗辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體實驗步驟SDS（每班做4版膠，用2個電泳槽）1、洗凈玻璃板，蒸餾水沖洗3遍，吹干并安裝電泳槽。3、制作12%分離膠。按下表中所列順序加試劑，輕輕搖勻，加入兩塊玻璃板間。4、用1mL蒸餾水封住分離膠液面，室溫聚合約15min，至分離膠與水之間出現(xiàn)一條清亮的分界線，倒掉水層，用濾紙條吸干殘余的水。5、倒出水并用濾紙吸干，配好濃縮膠（10ml），輕輕搖勻，加入濃縮膠，迅速插入樣梳，靜置約20分鐘。

※水封的目的是為了使分離膠上沿平直，并排除氣泡。

※凝膠聚合好的標志是膠與水層之間形成清晰的界面?！鶚邮嵝枰淮纹椒€(wěn)插入。梳口處不得有氣泡，梳底需水平。12%分離膠試劑名稱12%分離膠ddH2O2.5mL30%Acr-Bis(29:1)3.0mL1.5MTris-HCl（pH8.8）2.0mL10%SDS75uLTEMED（加速劑）10uL10%APS（催化劑，最后加）75uL總體積7.5mL試劑名稱5%ddH2O1.7mL30%Acr-Bis（29:1）0.43mL1MTris-HCl（pH6.8）0.31mL10%SDS25uLTEMED（加速劑）10uL10%AP（催化劑，最后加）25uL總體積2.5mL5%濃縮膠6、將膠板放入電泳槽，加入1×Tris-Gly電泳緩沖液，拔掉梳子，液面應該完全沒過電極。7、點樣（待測蛋白樣，加入樣品緩沖液）每個點樣孔點30ul樣品，每板膠點5ul預染Marker（預染Marker是有顏色的，可以作為電泳和轉膜的指示）。

加樣前，樣品在沸水中加熱3分鐘，以除掉亞穩(wěn)態(tài)聚合8、80V電泳20min，等蛋白進入分離膠后，將電壓調節(jié)到120V，電泳2h。9、溴酚藍接近膠底部時，關閉電源。電泳結束10、撬開玻璃板，根據(jù)預染Marker和溴酚藍的位置切去濃縮膠和多余的分離膠，（不要染色）SDS1、用尺量出膠的長度和寬度

2、用裁紙刀裁出12張與膠大小一樣的濾紙和1張同樣大小硝酸纖維素膜（NC膜）。

3、加10mL轉膜緩沖液到培養(yǎng)皿中，將凝膠、NC膜、濾紙浸泡約5min。

4、將凝膠、NC膜、濾紙按照圖示安裝好。

5、20V電轉移20-30分鐘Westernblotting

轉膜

（操作過程帶手套）

5、取出NC膜，放在一個干凈的容器內，加入10mL封閉液，平緩搖動30min。（封閉膜上非特異結合位點）6、回收封閉液，用10mLTTBS洗膜5min，重復3次。（洗去過量的奶粉）7、加入一抗溶液（10mL），搖動30min。（與抗原結合）8、回收一抗溶液，10mLTTBS洗膜5min，重復3次。（一抗可以重復使用）9．加入二抗溶液（10mL），搖動30min。（與一抗結合）10、回收二抗溶液，10mLTTBS洗膜5min，重復3次。（二抗可重復使用）雜交

一抗和二抗溶液必須回收！！顯色

11、倒掉TTBS，加入顯色液，搖動顯色3-5min。12、倒掉顯色液，用蒸餾水漂洗3-5min，晾干。預染Marker實驗材料和試劑SDS試劑1、30%丙烯酰胺

29g丙烯酰胺，1gN，N’-亞甲基雙丙烯酰胺，溶于60ml去離子水中，攪拌加熱溶解后，補水至終體積為100mL。用濾紙過濾后避光4℃保存。2、10%AP（過硫酸銨）

0.1gAP，溶于1mL蒸餾水。存放一周以后會失效。3、10%SDS5gSDS，加水50mL。

4、1.5mol/LTris(pH8.8)18.15gTris

溶于80mL去離子水中，調pH至8.8，定容至100mL。5、1.5mol/LTris(pH6.8)18.15gTris

堿溶于80mL去離子水中，調pH至6.8，定容至100mL。6、5×SDSloadingbuffer1mol/LTris-HCl(pH6.8)12.5mLSDS5g

溴酚藍0.25g

甘油25mLH2O12.5Ml

使用前按上述配方配50mL

的總量，使用時分裝小管，每1mLbuffer加50uL巰基乙醇。SDS試劑WesternBlotting試劑1、轉膜緩沖液

Tris3.0g

甘氨酸14.4g3.7%SDS10mL

甲醇200mL

加水至1L。2、10×TBS緩沖液

Tris12.1g

NaCl87.7g

溶于800mL單蒸水，調pH至8.0，加水至1L。3、TTBS緩沖液

100mL1×TBS緩沖液中加入50uLTween20。4、封閉液

5g脫脂奶粉溶于100mLTTBS中。5、DAB/NiCl

顯色液

100mmol/lTris-HCl，pH7.510mLDAB儲存液（40mg/ml）200uL

NiCl溶液（80mg/ml）50uL30%H2O230uLWesternBlotting