15DetectionofListeriamonocytogenesinanimalpadding2021-01-25發(fā)布本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定I動(dòng)物墊料中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測(cè)GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格GB/T33682基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒別微生物方SN/T1538.1培養(yǎng)基制法指南第1部分：實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基制SN/T1538.2培養(yǎng)基制法指南第2部分：培養(yǎng)基性能4設(shè)備和材料4.1冰箱：2℃~5℃。4.3均質(zhì)器。4.4振蕩器。4.6全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)。4.7飛行時(shí)間質(zhì)譜儀。4.8二級(jí)生物安全柜。4.9光學(xué)顯微鏡。4.11微量移液器。14.12無(wú)菌錐形瓶：500mL，250mL。4.14無(wú)菌培養(yǎng)皿：15mm×904.15無(wú)菌試管：18mm×180mm。4.16無(wú)菌量筒：250mL，1000m4.20無(wú)菌勺。4.21無(wú)菌玻片。4.22無(wú)菌接種環(huán)。5.13生化鑒定試劑盒。5.14革蘭氏陽(yáng)性菌生化鑒定卡。5.15飛行時(shí)間質(zhì)譜儀靶板。5.16單核細(xì)胞增生李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)2李斯特氏菌顯色平板牛津瓊脂平板應(yīng)遵循隨機(jī)性、代表性的原則。取樣過(guò)程遵循無(wú)菌操作程序，防止一切可能的外來(lái)污染。3無(wú)菌操作將滅菌規(guī)格板（5cmí5cm）放在平面墊料表面，用浸有無(wú)菌稀釋液（磷酸緩沖液或生理鹽水）的棉拭子，在規(guī)格板內(nèi)來(lái)回均勻涂抹整個(gè)方格3次，并隨之轉(zhuǎn)動(dòng)棉拭子，然后用滅菌剪刀剪去棉拭子與手接觸的部分，將棉拭子頭置入裝有25mL無(wú)菌稀釋液的無(wú)菌錐形瓶中，根據(jù)樣品面積大小1234±1℃培養(yǎng)24h～48h，觀察2種平板上生長(zhǎng)的菌落4挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落穿刺半固體或SIM動(dòng)力培養(yǎng)基，于25℃~30℃培養(yǎng)48h±2h，李斯特氏菌有動(dòng)力，在半固體或SIM培養(yǎng)基上方呈傘狀生長(zhǎng)。如傘狀生長(zhǎng)不明顯，可繼續(xù)培養(yǎng)用劃線(xiàn)接種法或穿刺接種法，將可疑菌落或典型菌落純養(yǎng)24h～48h，在明亮處觀察，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌呈現(xiàn)狹表2單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生化特征與其他李斯MR-VP++++/+-+-+-+++/++--+++++/+--++-+++/+-V++++++/+--++-+++/+-V-+：＋；－綜合生化鑒定結(jié)果、動(dòng)力試驗(yàn)結(jié)果、溶血試驗(yàn)結(jié)果和輔助鑒定結(jié)果，報(bào)告25g9生物安全措施5檢測(cè)過(guò)程中的廢棄物需經(jīng)121℃高壓滅菌處理至少306A.1培養(yǎng)基制法及質(zhì)量保證A.2含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆瓊脂(A.2.1成分A.2.2制法A.3.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基A.3.1.1成分A.3.1.2制法將上述各成分溶于水后加熱溶解，調(diào)節(jié)pH至7.2A.3.2氯化鋰溶液A.3.2.1成分7A.3.2.2制法A.3.3萘啶酮酸鈉鹽溶液A.3.3.1成分A.3.3.2制法將萘啶酮酸鈉鹽溶解于氫氧化鈉溶液中，過(guò)濾A.3.4鹽酸吖啶黃素溶液A.3.4.1成分鹽酸吖啶黃素0.25gA.3.4.2制法A.3.5檸檬酸鐵銨溶液A.3.5.1成分A.3.5.2制法A.3.6.1成分A.3.6.2制法A.3.7Fraser肉湯8A.3.7.1成分A.3.7.2制法臨用前，按照需用量將A.3.2～A.3.5四種溶液加入到A.3.1溶液中A.4牛津瓊脂（OXA）A.4.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基A.4.1.1成分A.4.1.2制法將上述各成分溶于水后煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH至7.2A.4.2用于1000mL培養(yǎng)基的添A.4.2.1成分A.4.2.2制法A.5革蘭氏染液A.5.1結(jié)晶紫染液9A.5.1.1成分A.5.1.2制法A.5.2革蘭氏碘液A.5.2.1成分A.5.2.2制法將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300mA.5.3沙黃復(fù)染液A.5.3.1成分A.5.3.2制法A.5.4革蘭氏染色法A.6.1成分硫代硫酸鈉A.6.2制法將上述各成分加熱混勻，調(diào)節(jié)pH至7.2±0.2，分裝A.6.3試驗(yàn)方法挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落穿刺接種到SIM培養(yǎng)基中，于25℃~30℃培養(yǎng)48h，觀察結(jié)果。A.7.1成分A.7.2制法A.7.3.1成分A.7.3.2制法A.7.3.3試驗(yàn)方法取適量瓊脂培養(yǎng)物接種于緩沖葡萄糖蛋白胨水中，36A.7.4V-P試驗(yàn)成分及制法:取α-萘酚6.0g，加無(wú)水乙醇溶解，定容至A.7.4.240%氫氧化鉀溶液成分及制法:A.7.4.3試驗(yàn)方法乙醇溶液0.5mL和40%氫氧化鉀溶液0.2mL,充分振搖試管，觀察結(jié)A.8血瓊脂A.8.1成分A.8.2制法A.9.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基A.9.1.1成分A.9.1.2制法將上述各成分溶于水后加熱溶解，調(diào)節(jié)pH值6.8±0A.9.2糖溶液A.9.2.1成分糖（L-鼠李糖或D-木糖）5.0gA.9.2.2制法A.10過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)A.10.1試劑A.10.2試驗(yàn)方法用細(xì)玻璃棒或一次性接種針挑取單個(gè)菌落，置于潔凈玻璃平皿內(nèi)，滴加3%過(guò)氧化氫溶液2滴，觀察結(jié)果。30s內(nèi)發(fā)生氣泡者為陽(yáng)性，不發(fā)