演講人：日期:細胞培養(yǎng)基礎常識CATALOGUE目錄01實驗室基礎準備02細胞操作核心流程03污染控制要點04培養(yǎng)質量控制05特殊培養(yǎng)場景06設備使用與維護01實驗室基礎準備細胞房環(huán)境標準氣體環(huán)境細胞房應提供足夠的氧氣和二氧化碳，以保證細胞正常呼吸和生長。03細胞房應保持適宜的溫度和濕度，通常溫度為37℃左右，濕度為95%左右。02溫濕度潔凈度細胞房應保持高度潔凈，避免塵埃、微生物等污染細胞。01培養(yǎng)基配置要求血清培養(yǎng)基中通常需要添加血清，以提供細胞生長因子和其他必需物質。pH值培養(yǎng)基的pH值應適宜，不同種類的細胞對pH值的要求不同。成分培養(yǎng)基應包含細胞生長所需的全部營養(yǎng)成分，如氨基酸、維生素、無機鹽等。實驗器具滅菌方法高壓蒸汽滅菌適用于耐高溫、耐高壓的實驗器具和物品，如玻璃器皿、金屬器械等。化學消毒劑適用于一些無法用高壓蒸汽或紫外線滅菌的物品，如塑料制品、電子儀器等，但需注意消毒劑的殘留問題。紫外線滅菌適用于表面滅菌，如超凈工作臺、培養(yǎng)皿等。02細胞操作核心流程細胞復蘇與凍存步驟從液氮或-80℃冰箱中取出細胞，快速放入37℃水浴中解凍，待細胞完全解凍后，用70%乙醇擦拭凍存管外部，然后將其轉移到生物安全柜中。細胞復蘇將細胞懸液轉移至凍存管中，加入適量的凍存液，通常細胞濃度為1×10^6個/mL，然后將凍存管放入程序降溫盒中，放入-80℃冰箱過夜，最后轉入液氮中長期保存。細胞凍存細胞傳代操作規(guī)范貼壁細胞傳代懸浮細胞傳代首先吸去舊培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞1-2次，加入適量的胰酶消化液，消化時間不宜過長，待細胞形態(tài)變圓、間隙增大時，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打使細胞懸浮，然后按1:3-1:5的比例傳代培養(yǎng)。將細胞懸液轉移至離心管中，離心后棄去上清液，加入新的培養(yǎng)基重懸細胞，然后按1:2-1:4的比例傳代培養(yǎng)。生長狀態(tài)監(jiān)測技巧細胞形態(tài)觀察正常細胞形態(tài)飽滿，輪廓清晰，折光性強，且細胞之間連接緊密。若細胞形態(tài)變圓、變大、變模糊，或出現(xiàn)空泡、拉絲等現(xiàn)象，可能說明細胞狀態(tài)不佳。細胞生長速度監(jiān)測正常細胞生長速度適中，過快或過慢都可能是細胞狀態(tài)不佳的表現(xiàn)?？梢酝ㄟ^繪制生長曲線來監(jiān)測細胞的生長速度。細胞密度監(jiān)測細胞密度過高或過低都會影響細胞的生長和狀態(tài)。一般貼壁細胞在培養(yǎng)皿中的適宜密度為80%-90%，懸浮細胞則需根據(jù)具體細胞類型進行調整。03污染控制要點微生物污染特征識別細菌污染菌落形態(tài)、生長速度、顏色、氣味等特征明顯。真菌污染菌落呈絨毛狀、絮狀、蜘蛛網(wǎng)狀，顏色多樣，生長速度快。支原體污染細胞形態(tài)變化、生長緩慢、產生絲狀物質等。病毒污染細胞病變效應、細胞融合、包涵體形成等特征。遵循無菌操作規(guī)程，減少微生物進入培養(yǎng)體系的機會。無菌操作技術使用專用器材和試劑，避免交叉污染。專用器材與試劑01020304使用紫外線、化學消毒劑等方法殺滅環(huán)境中的微生物。實驗室環(huán)境消毒選用無污染的細胞株，定期檢測、純化。細胞株選擇與處理交叉污染預防措施初步判斷觀察細胞培養(yǎng)物是否出現(xiàn)異常現(xiàn)象，如渾濁、沉淀等。01緊急隔離將疑似污染的細胞培養(yǎng)物與其他培養(yǎng)物分開，防止污染擴散。02消毒處理對污染的環(huán)境、器材進行徹底消毒，消除污染源。03驗證處理效果重新培養(yǎng)細胞，觀察是否還有污染現(xiàn)象。04污染應急處置流程04培養(yǎng)質量控制細胞活性檢測方法臺盼藍染色法利用活細胞不被臺盼藍染色的原理，檢測細胞活性。01MTT檢測法通過檢測細胞代謝活性來評估細胞活性。02克隆形成率檢測檢測細胞增殖能力和活性，反映細胞狀態(tài)。03培養(yǎng)基更換頻率優(yōu)化細胞生長速度根據(jù)細胞生長速度確定培養(yǎng)基更換頻率，避免營養(yǎng)耗盡或代謝產物積累。培養(yǎng)基穩(wěn)定性選擇穩(wěn)定性好的培養(yǎng)基，減少更換頻率，保證細胞生長環(huán)境穩(wěn)定。實驗需求根據(jù)實驗需求確定培養(yǎng)基更換頻率，確保實驗結果的準確性。細胞形態(tài)評估標準細胞形態(tài)觀察細胞形態(tài)是否正常，如是否規(guī)則、有無突起等，判斷細胞健康狀況。細胞生長狀態(tài)觀察細胞生長是否密集、有無空斑等，評估細胞生長狀態(tài)。細胞大小比較細胞大小是否一致，過大或過小可能代表細胞生長異常。05特殊培養(yǎng)場景懸浮細胞培養(yǎng)要點細胞特性培養(yǎng)條件培養(yǎng)基要求擴增方法懸浮細胞不貼壁，可在培養(yǎng)液中自由懸浮生長，如淋巴細胞、雜交瘤細胞等。通常使用無需凝固的培養(yǎng)基，包含細胞生長所需的營養(yǎng)成分和生長因子。需進行無菌操作，保持培養(yǎng)液中的溶氧、pH值、滲透壓等條件適宜細胞生長。通過細胞分裂進行擴增，常用的方法有搖瓶培養(yǎng)、轉瓶培養(yǎng)等。貼壁細胞傳代差異細胞特性貼壁細胞需貼附于支持物表面生長，如上皮細胞、成纖維細胞等。傳代方法常用的傳代方法有胰酶消化法、機械刮除法、自然脫落法等。傳代次數(shù)有限細胞系傳代次數(shù)有限，需及時凍存和復蘇細胞。傳代后細胞特性傳代后的細胞在形態(tài)、生長速度、代謝等方面可能發(fā)生變化。三維培養(yǎng)概念三維培養(yǎng)是指細胞在三維空間結構中進行生長和培養(yǎng)，模擬體內環(huán)境。常見三維培養(yǎng)技術包括細胞球培養(yǎng)、細胞團培養(yǎng)、細胞外基質培養(yǎng)等。三維培養(yǎng)優(yōu)點能夠更好地模擬細胞在體內生長狀態(tài)，研究細胞形態(tài)、功能、分化等。三維培養(yǎng)應用在組織工程、藥物篩選、疾病模型等領域有廣泛應用。三維培養(yǎng)技術基礎06設備使用與維護生物安全柜操作規(guī)范操作前準備需用70%乙醇對生物安全柜內表面進行擦拭，開啟風機和紫外線燈照射30分鐘以上。操作時注意事項實驗操作應在工作臺面上進行，避免手臂頻繁進出；操作時不要阻擋氣流，以免影響空氣凈化效果；盡量使用滅菌的器材和試劑。操作后處理實驗結束后，需將實驗廢物放入專用的廢物容器中，關閉風機和紫外線燈，并用70%乙醇對生物安全柜內表面進行再次擦拭。CO?培養(yǎng)箱參數(shù)校準溫度校準使用標準溫度計對培養(yǎng)箱內的溫度進行校準，確保溫度控制在設定范圍內，以保證細胞的正常生長。01氣體濃度校準使用專業(yè)的氣體檢測儀器對培養(yǎng)箱內的CO?濃度進行校準，確保CO?濃度在適宜范圍內。02濕度校準使用濕度計對培養(yǎng)箱內的濕度進行校準，以確保細胞在適宜的濕度環(huán)境下生長。03離心機梯度設置原則離心管應放置在對稱的位置，以保證離心時平衡。離心管放置離心時