亞砷酸對(duì)肝癌移植瘤小鼠髓樣抑制細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制研究一、引言1.1研究背景肝癌作為全球范圍內(nèi)常見(jiàn)且危害嚴(yán)重的惡性腫瘤，一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域重點(diǎn)關(guān)注的對(duì)象。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年大約有84萬(wàn)新發(fā)肝癌患者，78.2萬(wàn)死亡肝癌患者。在中國(guó)，肝癌發(fā)病率為26.92/10萬(wàn)，死亡率23.72/10萬(wàn)，在惡性腫瘤中分別排列第4位和第2位，嚴(yán)重威脅民眾的生命和健康，給社會(huì)、家庭造成了沉重的疾病負(fù)擔(dān)。傳統(tǒng)的肝癌治療方法，如手術(shù)、放療、化療等，在臨床應(yīng)用中面臨諸多困境。手術(shù)治療要求患者的肝臟功能和身體狀況較好，且對(duì)于晚期肝癌患者，手術(shù)切除往往無(wú)法徹底清除腫瘤，復(fù)發(fā)率較高。放療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)正常肝臟組織也會(huì)造成較大損傷，導(dǎo)致患者出現(xiàn)一系列不良反應(yīng)，影響治療效果和生活質(zhì)量。化療則由于肝癌細(xì)胞的高度耐藥性，使得化療藥物難以發(fā)揮理想的抗癌作用，且化療的副作用嚴(yán)重影響患者的免疫功能和身體機(jī)能。隨著對(duì)腫瘤免疫機(jī)制研究的深入，免疫治療成為肝癌治療的新方向之一。髓樣抑制細(xì)胞（MDSCs）作為免疫系統(tǒng)中的重要組成部分，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。MDSCs是一群起源于髓系的異質(zhì)性細(xì)胞，包括未成熟的巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和粒細(xì)胞等，具有很強(qiáng)的免疫抑制作用。在荷瘤小鼠及腫瘤患者體內(nèi)，MDSCs的數(shù)量明顯增加，它們通過(guò)抑制機(jī)體免疫功能，如抑制T細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活性，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散創(chuàng)造有利條件；同時(shí)，MDSCs還能促進(jìn)新生血管生成，為腫瘤的生長(zhǎng)提供充足的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，從而加速腫瘤的發(fā)展。因此，深入研究MDSCs在肝癌中的作用機(jī)制，對(duì)于尋找新的肝癌治療靶點(diǎn)和方法具有重要意義。亞砷酸作為一種具有獨(dú)特藥理作用的化合物，在腫瘤治療領(lǐng)域逐漸受到關(guān)注。在急性早幼粒細(xì)胞白血病的治療中，亞砷酸取得了顯著的療效，其能夠誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡，降低凝血系統(tǒng)活性，為白血病的治療提供了新的選擇。然而，亞砷酸在肝癌治療中的應(yīng)用研究尚處于探索階段，其具體作用機(jī)制尚不明確。有研究表明，亞砷酸可能通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞，如MDSCs，來(lái)發(fā)揮抗癌作用，但相關(guān)研究還較為有限。因此，探討亞砷酸對(duì)肝癌移植瘤小鼠髓樣抑制細(xì)胞比例的調(diào)節(jié)作用，不僅有助于揭示亞砷酸治療肝癌的潛在機(jī)制，還可能為肝癌的免疫治療提供新的策略和思路，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究肝癌移植瘤小鼠髓樣抑制細(xì)胞比例的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，以及亞砷酸對(duì)其產(chǎn)生的調(diào)節(jié)作用，從而為肝癌的治療開(kāi)辟全新的思路，提供更為堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐依據(jù)。具體而言，通過(guò)建立肝癌移植瘤小鼠模型，精確檢測(cè)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的不同階段，小鼠體內(nèi)髓樣抑制細(xì)胞比例的變化情況，明確其與腫瘤生長(zhǎng)進(jìn)程之間的內(nèi)在聯(lián)系，進(jìn)一步揭示髓樣抑制細(xì)胞在肝癌發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制。在此基礎(chǔ)上，給予肝癌移植瘤小鼠亞砷酸干預(yù)，觀察并分析亞砷酸對(duì)髓樣抑制細(xì)胞比例的調(diào)節(jié)效果，深入探討亞砷酸調(diào)節(jié)髓樣抑制細(xì)胞比例的潛在分子機(jī)制，為將亞砷酸開(kāi)發(fā)為肝癌治療的新藥物或新策略提供有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。本研究具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。從理論層面來(lái)看，深入研究肝癌移植瘤小鼠髓樣抑制細(xì)胞比例變化及亞砷酸的調(diào)節(jié)作用，有助于深化對(duì)肝癌免疫逃逸機(jī)制的理解，豐富腫瘤免疫學(xué)的理論體系。髓樣抑制細(xì)胞在腫瘤免疫逃逸中扮演著關(guān)鍵角色，但其在肝癌中的具體作用機(jī)制仍存在諸多未知。通過(guò)本研究，有望揭示髓樣抑制細(xì)胞與肝癌細(xì)胞之間的相互作用關(guān)系，以及亞砷酸對(duì)這一過(guò)程的干預(yù)機(jī)制，為腫瘤免疫治療的理論發(fā)展提供新的視角和依據(jù)。在臨床應(yīng)用方面，本研究的成果可能為肝癌的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。目前，肝癌的治療效果仍不盡人意，迫切需要尋找新的治療方法。若能證實(shí)亞砷酸可以通過(guò)調(diào)節(jié)髓樣抑制細(xì)胞比例來(lái)抑制肝癌的生長(zhǎng)，那么亞砷酸有望成為一種新的肝癌治療藥物，或者為現(xiàn)有的肝癌治療方案提供有效的補(bǔ)充。此外，對(duì)髓樣抑制細(xì)胞的研究也可能為肝癌的診斷和預(yù)后評(píng)估提供新的生物標(biāo)志物，有助于實(shí)現(xiàn)肝癌的早期診斷和精準(zhǔn)治療，提高患者的生存率和生活質(zhì)量，具有顯著的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。二、肝癌與相關(guān)細(xì)胞及亞砷酸的研究概述2.1肝癌的概述2.1.1肝癌的發(fā)病機(jī)制與現(xiàn)狀肝癌，作為一種常見(jiàn)且危害嚴(yán)重的惡性腫瘤，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多種因素的相互作用。在眾多致病因素中，病毒性肝炎感染首當(dāng)其沖。慢性乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染是導(dǎo)致肝癌的主要病因之一，大量臨床研究和流行病學(xué)調(diào)查表明，乙肝病毒感染者發(fā)展為肝癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，丙肝病毒感染也在肝癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。肝硬化同樣是肝癌的重要危險(xiǎn)因素，約50%-90%的肝癌患者合并有肝硬化，尤其是由病毒性肝炎引發(fā)的肝硬化，進(jìn)一步增加了肝癌的發(fā)病幾率。黃曲霉素污染也是不容忽視的因素，黃曲霉素作為一種強(qiáng)致癌物，長(zhǎng)期攝入被黃曲霉素污染的食物，會(huì)顯著提升肝癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，在一些黃曲霉素污染嚴(yán)重的地區(qū)，肝癌的發(fā)病率明顯偏高。此外，飲用水污染、遺傳因素等也與肝癌的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)，飲用受污染的水源，如含有藍(lán)綠藻毒素的池塘水，可能增加肝癌的患病風(fēng)險(xiǎn)；而遺傳因素使得肝癌在某些家族中呈現(xiàn)出聚集性，同一種族或家族成員之間肝癌發(fā)病率的差異，暗示了遺傳因素在肝癌發(fā)病中的潛在影響。從全球范圍來(lái)看，肝癌的發(fā)病率和死亡率均處于較高水平，嚴(yán)重威脅人類的生命健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2022年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，2022年全球肝癌新發(fā)病例數(shù)約為87萬(wàn)例，位居各類癌癥的第6位；死亡病例數(shù)約為76萬(wàn)例，高居癌癥死亡原因的第3位。在中國(guó)，由于人口基數(shù)龐大以及上述多種致病因素的廣泛存在，肝癌的疾病負(fù)擔(dān)更為沉重。2022年，中國(guó)肝癌新發(fā)病例數(shù)達(dá)37萬(wàn)例，在各類癌癥中發(fā)病率排名第4位；死亡病例數(shù)高達(dá)32萬(wàn)例，死亡率僅次于肺癌，位居第2位。男性肝癌的發(fā)病率和死亡率普遍高于女性，且肝癌的發(fā)病率隨著年齡的增長(zhǎng)而上升，高發(fā)年齡段集中在50-70歲。在一些地區(qū)，如中國(guó)的東南沿海地區(qū)，由于環(huán)境因素、飲食習(xí)慣以及病毒感染等因素的綜合作用，肝癌的發(fā)病率更為突出。肝癌早期癥狀隱匿，多數(shù)患者在確診時(shí)已處于中晚期，此時(shí)病情往往進(jìn)展迅速，治療難度極大，預(yù)后較差，5年生存率僅為18%左右，給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和心理壓力。2.1.2肝癌的現(xiàn)有治療手段及局限性目前，肝癌的治療手段呈現(xiàn)多樣化，主要包括手術(shù)治療、化療、放療、介入治療以及靶向治療和免疫治療等。手術(shù)治療作為肝癌的重要治療方式之一，對(duì)于早期肝癌患者，若肝臟功能良好、腫瘤局限且無(wú)轉(zhuǎn)移，手術(shù)切除腫瘤是根治肝癌的最佳選擇，可有效延長(zhǎng)患者的生存期。然而，手術(shù)治療存在諸多限制，它要求患者具備較好的身體狀況和肝臟儲(chǔ)備功能，對(duì)于合并嚴(yán)重肝硬化、心肺功能不全等基礎(chǔ)疾病的患者，往往無(wú)法耐受手術(shù)；而且，對(duì)于中晚期肝癌患者，腫瘤可能已經(jīng)侵犯周圍組織或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，手術(shù)難以徹底切除腫瘤，復(fù)發(fā)率較高，術(shù)后患者的生活質(zhì)量和生存時(shí)間也受到較大影響?；熓峭ㄟ^(guò)使用化學(xué)藥物來(lái)殺死癌細(xì)胞或抑制其生長(zhǎng)，在肝癌治療中也有一定的應(yīng)用。但肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物普遍存在耐藥性，使得化療的療效大打折扣。許多化療藥物難以有效穿透肝癌細(xì)胞的細(xì)胞膜，或者被癌細(xì)胞內(nèi)的耐藥蛋白排出，導(dǎo)致藥物在癌細(xì)胞內(nèi)無(wú)法達(dá)到有效濃度，無(wú)法發(fā)揮其抗癌作用。此外，化療藥物在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損傷，引發(fā)一系列嚴(yán)重的副作用，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，這些副作用不僅降低了患者的生活質(zhì)量，還可能導(dǎo)致患者無(wú)法按時(shí)完成化療療程，影響治療效果。放療則是利用高能射線照射腫瘤部位，以殺死癌細(xì)胞。雖然放療在一定程度上可以控制腫瘤的生長(zhǎng)，但肝癌對(duì)放療的敏感性相對(duì)較低，且肝臟對(duì)射線較為敏感，放療過(guò)程中容易導(dǎo)致正常肝臟組織受損，引發(fā)放射性肝炎、肝功能衰竭等并發(fā)癥，限制了放療的劑量和療程，從而影響其治療效果。而且，對(duì)于已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的肝癌患者，放療往往難以對(duì)全身各處的轉(zhuǎn)移病灶進(jìn)行全面有效的治療。介入治療，如肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)（TACE），通過(guò)將化療藥物和栓塞劑注入供應(yīng)腫瘤的肝動(dòng)脈，阻斷腫瘤的血液供應(yīng)并使腫瘤局部藥物濃度升高，從而達(dá)到殺死癌細(xì)胞的目的。TACE在中晚期肝癌的治療中應(yīng)用較為廣泛，能夠在一定程度上控制腫瘤的生長(zhǎng)，緩解癥狀，延長(zhǎng)患者的生存期。然而，TACE也存在一些局限性，多次治療后可能導(dǎo)致肝臟血管狹窄或閉塞，影響后續(xù)治療；而且，對(duì)于一些血供不豐富的腫瘤或已經(jīng)發(fā)生肝外轉(zhuǎn)移的患者，TACE的療效有限。近年來(lái)，靶向治療和免疫治療為肝癌的治療帶來(lái)了新的希望。靶向治療藥物能夠特異性地作用于肝癌細(xì)胞表面的靶點(diǎn)，阻斷腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。免疫治療則是通過(guò)激活患者自身的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。然而，這些新興治療方法也并非完美無(wú)缺。靶向治療藥物可能會(huì)出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞可能會(huì)發(fā)生基因突變，導(dǎo)致靶向藥物無(wú)法有效作用于靶點(diǎn)，從而使治療效果逐漸減弱。免疫治療雖然在部分患者中取得了較好的療效，但并非所有患者都能從中獲益，而且免疫治療可能引發(fā)一系列免疫相關(guān)不良反應(yīng)，如免疫性肝炎、肺炎、甲狀腺功能異常等，嚴(yán)重時(shí)可能危及患者生命。肝癌的現(xiàn)有治療手段雖然在一定程度上能夠控制腫瘤的發(fā)展，延長(zhǎng)患者的生存期，但由于肝癌的復(fù)雜性、耐藥性和轉(zhuǎn)移特性，這些治療方法都存在不同程度的局限性，迫切需要尋找新的治療靶點(diǎn)和方法，以提高肝癌的治療效果和患者的生存率。2.2髓樣抑制細(xì)胞概述2.2.1髓樣抑制細(xì)胞的定義與特征髓樣抑制細(xì)胞（MDSCs）是一類在病理狀態(tài)下，如腫瘤、感染、炎癥等，由骨髓造血干細(xì)胞異常分化產(chǎn)生的異質(zhì)性細(xì)胞群體。其主要來(lái)源于未成熟的髓系祖細(xì)胞，包括未成熟的粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及樹(shù)突狀細(xì)胞等，這些細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境或其他病理因素的刺激下，分化受阻，停留在未成熟階段，從而形成了具有免疫抑制功能的MDSCs。在小鼠中，MDSCs通常被定義為表達(dá)CD11b和Gr-1分子的細(xì)胞群體。其中，Gr-1分子又包含Ly6G和Ly6C兩個(gè)抗原表位，根據(jù)這兩個(gè)表位的表達(dá)差異，可將小鼠MDSCs進(jìn)一步分為兩個(gè)主要亞群：粒細(xì)胞樣或多形核MDSCs（PMN-MDSCs，CD11b+Ly6G+Ly6Clo）和單核細(xì)胞樣MDSCs（M-MDSCs，CD11b+Ly6G-Ly6Chi）。PMN-MDSCs形態(tài)上類似中性粒細(xì)胞，具有分葉核，在荷瘤小鼠和腫瘤患者體內(nèi)數(shù)量較多，是MDSCs的主要組成部分；M-MDSCs則與單核細(xì)胞相似，具有單個(gè)核，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著獨(dú)特的作用。在人類中，由于缺乏與小鼠Gr-1完全對(duì)應(yīng)的分子標(biāo)記，MDSCs的鑒定相對(duì)復(fù)雜。目前，通常將CD11b+CD33+HLADR-細(xì)胞視為MDSCs，同時(shí)，根據(jù)其他表面標(biāo)志物的表達(dá)情況，也可將人MDSCs分為PMN-MDSCs（CD11b+CD33+HLADR-CD15+）和M-MDSCs（CD11b+CD33+HLADR-CD14+）等亞群。此外，還有一小部分早期MDSCs（eMDSCs），其表型為CD11b+CD33+HLADR-CD14-CD15-，具有較強(qiáng)的增殖能力和免疫抑制活性。MDSCs最顯著的特征是其強(qiáng)大的免疫抑制功能，能夠通過(guò)多種機(jī)制抑制機(jī)體的免疫應(yīng)答。MDSCs可以抑制T細(xì)胞的活化、增殖和細(xì)胞毒性，通過(guò)消耗微環(huán)境中的精氨酸、半胱氨酸等必需氨基酸，使T細(xì)胞因缺乏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而無(wú)法正?；罨驮鲋?；同時(shí)，MDSCs還能通過(guò)產(chǎn)生一氧化氮（NO）、活性氧（ROS）等物質(zhì)，修飾T細(xì)胞表面的TCR等分子，抑制T細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)，從而降低T細(xì)胞的免疫活性。MDSCs對(duì)自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）也具有抑制作用，減少NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性和細(xì)胞因子分泌，降低NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。MDSCs還可以調(diào)節(jié)樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）的功能，抑制DC的成熟和抗原呈遞能力，影響DC對(duì)T細(xì)胞的激活，從而破壞機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。2.2.2髓樣抑制細(xì)胞在腫瘤免疫中的作用機(jī)制在腫瘤免疫中，MDSCs通過(guò)多種復(fù)雜且相互關(guān)聯(lián)的機(jī)制，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，嚴(yán)重阻礙了機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的有效識(shí)別和清除。MDSCs對(duì)免疫細(xì)胞功能的抑制是其促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的重要機(jī)制之一。如前文所述，MDSCs能夠通過(guò)多種途徑抑制T細(xì)胞的活化和增殖。在腫瘤微環(huán)境中，MDSCs高表達(dá)精氨酸酶1（ARG1），ARG1可以催化精氨酸分解為鳥(niǎo)氨酸和尿素，導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中精氨酸濃度降低。精氨酸是T細(xì)胞增殖和活化所必需的氨基酸，其缺乏會(huì)使T細(xì)胞表面的TCRζ鏈表達(dá)下調(diào)，從而抑制T細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)，阻礙T細(xì)胞的活化和增殖。MDSCs產(chǎn)生的NO和ROS等物質(zhì)也會(huì)對(duì)T細(xì)胞功能產(chǎn)生負(fù)面影響。NO可以與T細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致T細(xì)胞功能受損；ROS則可以直接損傷T細(xì)胞的DNA和細(xì)胞膜，影響T細(xì)胞的正常功能。除了抑制T細(xì)胞，MDSCs還能抑制NK細(xì)胞的活性。MDSCs可以分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、前列腺素E2（PGE2）等免疫抑制性細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子能夠抑制NK細(xì)胞的增殖和細(xì)胞毒性，減少NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。MDSCs還可以通過(guò)直接接觸NK細(xì)胞，抑制NK細(xì)胞表面的活化受體表達(dá)，降低NK細(xì)胞的活性。MDSCs在促進(jìn)腫瘤血管生成方面也發(fā)揮著重要作用。腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于充足的血液供應(yīng)，而MDSCs可以通過(guò)分泌多種血管生成因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）等，刺激腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)新生血管的形成。MDSCs還可以招募骨髓來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞到腫瘤部位，參與腫瘤血管的構(gòu)建。此外，MDSCs分泌的PGE2可以上調(diào)腫瘤細(xì)胞表面的VEGF受體表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)VEGF的反應(yīng)性，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤血管生成。免疫逃逸是腫瘤得以持續(xù)生長(zhǎng)和擴(kuò)散的關(guān)鍵因素之一，MDSCs在其中扮演了重要角色。MDSCs可以通過(guò)抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞逃脫免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊。MDSCs抑制DC的成熟和功能，使DC無(wú)法有效地將腫瘤抗原呈遞給T細(xì)胞，從而削弱了T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)。MDSCs還可以誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的產(chǎn)生和擴(kuò)增，Treg具有免疫抑制功能，能夠抑制其他免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。MDSCs自身也可以表達(dá)免疫檢查點(diǎn)分子，如程序性死亡配體1（PD-L1），與T細(xì)胞表面的程序性死亡受體1（PD-1）結(jié)合，抑制T細(xì)胞的活性，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。2.2.3髓樣抑制細(xì)胞與肝癌的相關(guān)性研究現(xiàn)狀近年來(lái)，髓樣抑制細(xì)胞與肝癌的相關(guān)性研究受到了廣泛關(guān)注，大量研究表明，MDSCs在肝癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，與肝癌的臨床預(yù)后密切相關(guān)。在肝癌的發(fā)生階段，慢性炎癥和免疫監(jiān)視失衡是重要的發(fā)病機(jī)制，而MDSCs在其中起到了促進(jìn)作用。慢性肝炎病毒感染、肝硬化等因素導(dǎo)致肝臟持續(xù)處于炎癥狀態(tài)，刺激骨髓造血干細(xì)胞向MDSCs分化，使肝臟微環(huán)境中MDSCs數(shù)量增加。這些MDSCs通過(guò)抑制機(jī)體的免疫監(jiān)視功能，為肝癌細(xì)胞的產(chǎn)生和存活提供了有利條件。研究發(fā)現(xiàn)，在乙肝病毒相關(guān)的肝癌患者中，外周血和腫瘤組織中的MDSCs比例明顯高于健康人群，且MDSCs的數(shù)量與乙肝病毒載量呈正相關(guān)。MDSCs還可以通過(guò)分泌細(xì)胞因子和趨化因子，促進(jìn)肝臟星狀細(xì)胞的活化和增殖，導(dǎo)致肝纖維化和肝硬化的發(fā)生，進(jìn)一步增加了肝癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。隨著肝癌的發(fā)展，MDSCs在腫瘤微環(huán)境中大量聚集，通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲。MDSCs抑制T細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活性，削弱機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，使肝癌細(xì)胞能夠逃避免疫系統(tǒng)的攻擊。有研究表明，肝癌患者腫瘤組織中的MDSCs數(shù)量越多，T細(xì)胞的浸潤(rùn)程度越低，患者的預(yù)后越差。MDSCs還可以分泌多種生長(zhǎng)因子和蛋白酶，如VEGF、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，促進(jìn)腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲。VEGF能夠刺激腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，為腫瘤的生長(zhǎng)提供充足的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)；MMPs則可以降解細(xì)胞外基質(zhì)，破壞組織屏障，使腫瘤細(xì)胞更容易突破周圍組織，發(fā)生轉(zhuǎn)移。在肝癌轉(zhuǎn)移方面，MDSCs同樣發(fā)揮著重要作用。MDSCs可以通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。EMT是腫瘤細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移能力的關(guān)鍵步驟，MDSCs分泌的TGF-β、IL-6等細(xì)胞因子可以激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)的EMT相關(guān)信號(hào)通路，使腫瘤細(xì)胞失去上皮細(xì)胞的特性，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，從而更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。MDSCs還可以通過(guò)與腫瘤細(xì)胞相互作用，形成腫瘤微環(huán)境中的前轉(zhuǎn)移龕，為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供適宜的微環(huán)境。在肝癌肺轉(zhuǎn)移模型中，發(fā)現(xiàn)MDSCs可以先于腫瘤細(xì)胞到達(dá)肺部，通過(guò)分泌趨化因子和細(xì)胞外基質(zhì)成分，吸引腫瘤細(xì)胞到達(dá)肺部，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在肺部的定植和生長(zhǎng)。MDSCs在肝癌的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估中也具有重要的臨床意義。MDSCs的數(shù)量和功能可以作為肝癌診斷和病情監(jiān)測(cè)的潛在生物標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌患者外周血和腫瘤組織中的MDSCs比例明顯高于健康人群，且與腫瘤的分期、分級(jí)、大小等臨床病理參數(shù)密切相關(guān)。檢測(cè)MDSCs的水平有助于早期發(fā)現(xiàn)肝癌，評(píng)估腫瘤的惡性程度和進(jìn)展情況。MDSCs也是肝癌治療的潛在靶點(diǎn)。通過(guò)抑制MDSCs的增殖、分化和功能，可以增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，提高肝癌的治療效果。一些針對(duì)MDSCs的治療策略，如使用小分子抑制劑、抗體、細(xì)胞因子等，已經(jīng)在臨床前研究和臨床試驗(yàn)中取得了一定的進(jìn)展。MDSCs還可以作為肝癌預(yù)后評(píng)估的指標(biāo)。多項(xiàng)研究表明，肝癌患者體內(nèi)MDSCs的數(shù)量越多，患者的生存率越低，復(fù)發(fā)率越高，因此，監(jiān)測(cè)MDSCs的水平可以幫助醫(yī)生預(yù)測(cè)患者的預(yù)后，制定個(gè)性化的治療方案。2.3亞砷酸概述2.3.1亞砷酸的基本性質(zhì)與作用機(jī)制亞砷酸，其化學(xué)名稱為三氧化二砷（As_2O_3），在常溫常壓下呈現(xiàn)為白色結(jié)晶性粉末狀。從化學(xué)性質(zhì)來(lái)看，它屬于兩性氧化物，既能夠與酸發(fā)生反應(yīng)，又能和堿相互作用。在酸性環(huán)境中，亞砷酸可與強(qiáng)酸反應(yīng)生成相應(yīng)的砷鹽，例如與鹽酸反應(yīng)生成三氯化砷；而在堿性條件下，它會(huì)與強(qiáng)堿反應(yīng)生成亞砷酸鹽。亞砷酸微溶于水，在熱水中的溶解度相對(duì)較高，其水溶液呈酸性，這一特性與它的化學(xué)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，As_2O_3分子中的砷原子具有一定的電正性，能夠與水中的氫氧根離子結(jié)合，從而使溶液中氫離子濃度增加，呈現(xiàn)酸性。在腫瘤治療領(lǐng)域，亞砷酸展現(xiàn)出獨(dú)特的作用機(jī)制，主要通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖以及調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境等多個(gè)途徑來(lái)發(fā)揮抗癌作用。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是亞砷酸抗癌的關(guān)鍵機(jī)制之一。亞砷酸能夠作用于腫瘤細(xì)胞內(nèi)的多個(gè)靶點(diǎn)，引發(fā)一系列的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路變化，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。它可以上調(diào)腫瘤細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白的表達(dá)，如Bax等，同時(shí)下調(diào)抗凋亡蛋白的表達(dá)，如Bcl-2。Bax蛋白能夠促進(jìn)線粒體膜通透性的改變，使細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而激活半胱天冬酶（caspase）級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞凋亡。亞砷酸還可以直接作用于線粒體，影響線粒體的功能，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，釋放出凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）等物質(zhì)，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。抑制腫瘤細(xì)胞增殖也是亞砷酸的重要作用。亞砷酸可以干擾腫瘤細(xì)胞的DNA合成和修復(fù)過(guò)程，阻止細(xì)胞周期的進(jìn)程。它能夠抑制DNA聚合酶的活性，使腫瘤細(xì)胞在DNA復(fù)制過(guò)程中出現(xiàn)錯(cuò)誤，從而無(wú)法正常進(jìn)行細(xì)胞分裂。亞砷酸還可以影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，如周期蛋白（cyclin）和周期蛋白依賴性激酶（CDK）等，使細(xì)胞周期阻滯在G1期或S期，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。亞砷酸還能夠調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，這一作用對(duì)于抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移具有重要意義。腫瘤微環(huán)境中存在著多種細(xì)胞類型和細(xì)胞因子，它們相互作用，為腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供了有利條件。亞砷酸可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞功能，如髓樣抑制細(xì)胞（MDSCs）、T細(xì)胞、NK細(xì)胞等，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。亞砷酸可以抑制MDSCs的免疫抑制功能，減少其對(duì)T細(xì)胞和NK細(xì)胞的抑制作用，使T細(xì)胞和NK細(xì)胞能夠更好地發(fā)揮抗腫瘤作用。亞砷酸還可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的血管生成因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等，抑制腫瘤血管生成，減少腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。2.3.2亞砷酸在腫瘤治療中的應(yīng)用研究進(jìn)展亞砷酸在腫瘤治療領(lǐng)域的應(yīng)用研究由來(lái)已久，并且在多個(gè)方面取得了顯著的成果，同時(shí)也面臨著一些挑戰(zhàn)和問(wèn)題。在白血病治療方面，亞砷酸取得了突破性的進(jìn)展，尤其是在急性早幼粒細(xì)胞白血?。ˋPL）的治療中，展現(xiàn)出卓越的療效。自20世紀(jì)90年代以來(lái)，亞砷酸注射液被廣泛應(yīng)用于APL的治療，成為APL治療的重要藥物之一。研究表明，亞砷酸能夠誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化和凋亡，使APL患者的完全緩解率顯著提高，長(zhǎng)期生存率也得到了明顯改善。一項(xiàng)針對(duì)APL患者的臨床研究顯示，使用亞砷酸聯(lián)合全反式維甲酸（ATRA）進(jìn)行治療，患者的5年無(wú)病生存率達(dá)到了80%以上。亞砷酸與ATRA聯(lián)合應(yīng)用，通過(guò)不同的作用機(jī)制協(xié)同發(fā)揮作用，ATRA主要誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化，而亞砷酸則主要誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，兩者聯(lián)合使用能夠更有效地清除APL細(xì)胞，減少?gòu)?fù)發(fā)率。亞砷酸還可以降低APL患者凝血系統(tǒng)的活性，減少?gòu)浬⑿匝軆?nèi)凝血（DIC）等并發(fā)癥的發(fā)生，提高患者的治療安全性。隨著對(duì)亞砷酸抗癌機(jī)制研究的深入，其在肝癌等實(shí)體瘤治療中的應(yīng)用也逐漸受到關(guān)注。在肝癌治療方面，一些基礎(chǔ)研究和臨床前試驗(yàn)表明，亞砷酸對(duì)肝癌細(xì)胞具有一定的抑制作用。亞砷酸可以通過(guò)多種途徑抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，如誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡、抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力、調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路等。研究發(fā)現(xiàn)，亞砷酸能夠上調(diào)肝癌細(xì)胞內(nèi)的p53、Bax等促凋亡蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2等抗凋亡蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。亞砷酸還可以抑制肝癌細(xì)胞中與增殖和侵襲相關(guān)的蛋白表達(dá)，如PCNA、MMP-2等，降低肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。在肝癌動(dòng)物模型中，給予亞砷酸治療后，腫瘤體積明顯減小，腫瘤細(xì)胞的凋亡率增加，腫瘤組織中的血管生成也受到抑制。然而，亞砷酸在肝癌等實(shí)體瘤治療中的應(yīng)用仍處于探索階段，存在一些問(wèn)題亟待解決。亞砷酸的治療劑量和安全性需要進(jìn)一步優(yōu)化。亞砷酸具有一定的毒性，在治療過(guò)程中可能會(huì)引起一些不良反應(yīng)，如肝功能損害、腎功能損害、心臟毒性等。如何在保證治療效果的同時(shí)，降低亞砷酸的毒性，是臨床應(yīng)用中需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一。目前，研究人員正在探索通過(guò)納米技術(shù)等手段，將亞砷酸制備成納米制劑，以提高其靶向性和生物利用度，降低毒性。例如，將亞砷酸負(fù)載到納米顆粒中，使其能夠更有效地富集到腫瘤組織中，減少對(duì)正常組織的損傷。亞砷酸在實(shí)體瘤治療中的聯(lián)合用藥方案也需要進(jìn)一步研究。與其他抗癌藥物或治療方法聯(lián)合使用，可能會(huì)提高亞砷酸的治療效果，但不同藥物之間的相互作用和最佳聯(lián)合方案仍有待進(jìn)一步探索。一些研究嘗試將亞砷酸與化療藥物、靶向藥物或免疫治療藥物聯(lián)合使用，觀察其對(duì)實(shí)體瘤的治療效果，但目前還缺乏大規(guī)模的臨床研究來(lái)驗(yàn)證這些聯(lián)合用藥方案的有效性和安全性。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本研究選用6-8周齡的雄性BALB/c小鼠，共計(jì)60只，體重在18-22g之間。小鼠購(gòu)自[供應(yīng)商名稱]，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為[許可證編號(hào)]。BALB/c小鼠作為常用的近交系小鼠，具有遺傳背景清晰、免疫反應(yīng)穩(wěn)定等特點(diǎn)，在腫瘤研究中應(yīng)用廣泛，能夠?yàn)閷?shí)驗(yàn)提供較為一致的遺傳背景，減少個(gè)體差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。小鼠飼養(yǎng)于[飼養(yǎng)單位]的SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，環(huán)境溫度控制在22±2℃，相對(duì)濕度維持在50%-60%，12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗交替。小鼠自由攝取經(jīng)高壓滅菌處理的飼料和無(wú)菌水，動(dòng)物房定期進(jìn)行清潔和消毒，以確保小鼠處于良好的飼養(yǎng)環(huán)境中，避免外界因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾。3.1.2細(xì)胞株與試劑肝癌細(xì)胞株HepG2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。HepG2細(xì)胞來(lái)源于人肝母細(xì)胞瘤，具有肝癌細(xì)胞的典型特性，如高增殖能力、能分泌甲胎蛋白等，在肝癌相關(guān)研究中被廣泛應(yīng)用。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國(guó)）、1%雙抗（青霉素100U/mL，鏈霉素100μg/mL，Solarbio公司，中國(guó)）的RPMI1640培養(yǎng)基（HyClone公司，美國(guó)）中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。亞砷酸（As_2O_3）粉末購(gòu)自Sigma-Aldrich公司（美國(guó)），純度≥99%。使用時(shí)，將亞砷酸粉末用0.9%生理鹽水配制成所需濃度的溶液，經(jīng)0.22μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌后備用。其他試劑包括：流式細(xì)胞術(shù)抗體，如抗小鼠CD11b-FITC、抗小鼠Ly6G-PE、抗小鼠Ly6C-APC（均購(gòu)自BioLegend公司，美國(guó)），用于標(biāo)記和檢測(cè)髓樣抑制細(xì)胞；RIPA裂解液（Solarbio公司，中國(guó)），用于提取細(xì)胞總蛋白；BCA蛋白定量試劑盒（Beyotime公司，中國(guó)），用于測(cè)定蛋白濃度；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（Solarbio公司，中國(guó)）、PVDF膜（Millipore公司，美國(guó)）、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（ThermoFisherScientific公司，美國(guó)）等，用于蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)；RNA提取試劑盒（Qiagen公司，德國(guó)）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，日本）、SYBRGreenPCRMasterMix（TaKaRa公司，日本）等，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)。3.1.3主要儀器設(shè)備實(shí)驗(yàn)所需的主要儀器設(shè)備包括：流式細(xì)胞儀（BDFACSCantoII，BD公司，美國(guó)），用于檢測(cè)小鼠脾臟和腫瘤組織中髓樣抑制細(xì)胞的比例；共聚焦顯微鏡（LeicaTCSSP8，Leica公司，德國(guó)），用于觀察細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞內(nèi)分子的定位；酶標(biāo)儀（Bio-Rad680，Bio-Rad公司，美國(guó)），用于檢測(cè)蛋白濃度和PCR反應(yīng)的熒光信號(hào)；高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf5424R，Eppendorf公司，德國(guó)），用于細(xì)胞和組織的離心分離；PCR儀（AppliedBiosystemsVeriti96-WellThermalCycler，ThermoFisherScientific公司，美國(guó)），用于基因擴(kuò)增；電泳儀（Bio-RadPowerPacBasic，Bio-Rad公司，美國(guó)）和轉(zhuǎn)膜儀（Bio-RadTrans-BlotTurboTransferSystem，Bio-Rad公司，美國(guó)），用于蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)；CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientificHeracellVIOS160i，ThermoFisherScientific公司，美國(guó)），用于細(xì)胞培養(yǎng)；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化SW-CJ-2FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司，中國(guó)），為細(xì)胞操作提供無(wú)菌環(huán)境。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1肝癌移植瘤小鼠模型的建立取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2肝癌細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液進(jìn)行消化，在消化過(guò)程中，需在顯微鏡下密切觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞變圓且開(kāi)始脫離瓶壁時(shí)，立即加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化。隨后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，以1000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，棄去上清液，用PBS輕柔洗滌細(xì)胞2次，再次離心后，用無(wú)菌的PBS將細(xì)胞重懸，并使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?個(gè)/mL。選取6-8周齡的雄性BALB/c小鼠，在進(jìn)行細(xì)胞接種前，先將小鼠稱重并編號(hào)，采用75%乙醇對(duì)小鼠右側(cè)腋窩處皮膚進(jìn)行消毒，消毒范圍直徑約為2-3cm，確保消毒徹底。用1mL無(wú)菌注射器吸取0.2mL細(xì)胞懸液，將針頭斜面向上，在小鼠右側(cè)腋窩皮下緩慢進(jìn)針，進(jìn)針深度約為0.5-1cm，然后緩慢推注細(xì)胞懸液，注射完畢后，輕輕拔出針頭，并用棉球按壓注射部位片刻，防止細(xì)胞懸液溢出。接種細(xì)胞后，每天密切觀察小鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食情況、活動(dòng)能力等，定期測(cè)量小鼠的體重和腫瘤大小。使用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到約100-150mm3時(shí)，表明肝癌移植瘤小鼠模型構(gòu)建成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在模型建立過(guò)程中，需嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，防止細(xì)菌、病毒等微生物污染，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)，要注意小鼠的飼養(yǎng)環(huán)境，保持動(dòng)物房的清潔衛(wèi)生，定期更換墊料和飼料，確保小鼠處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。3.2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理將成功建立肝癌移植瘤模型的小鼠隨機(jī)分為4組，每組15只，分別為對(duì)照組、低劑量亞砷酸組、中劑量亞砷酸組和高劑量亞砷酸組。對(duì)照組小鼠給予等體積的0.9%生理鹽水腹腔注射，低、中、高劑量亞砷酸組小鼠分別給予亞砷酸溶液腹腔注射，劑量依次為0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg。給藥體積均為0.2mL/只，每天給藥1次，連續(xù)給藥14天。在給藥過(guò)程中，需嚴(yán)格按照劑量和給藥方式進(jìn)行操作，確保每只小鼠都能準(zhǔn)確地接受相應(yīng)的藥物處理。同時(shí)，密切觀察小鼠的反應(yīng)，如出現(xiàn)異常情況，如精神萎靡、食欲不振、體重急劇下降等，需及時(shí)記錄并分析原因，必要時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行調(diào)整。3.2.3樣本采集與處理在末次給藥24h后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，迅速采集外周血、脾臟和腫瘤組織等樣本。用無(wú)菌注射器從眼眶靜脈叢采集外周血約0.5mL，將血液注入含有EDTA-K?抗凝劑的離心管中，輕輕顛倒混勻，防止血液凝固。隨后，將血液以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，分離出血漿，將血漿轉(zhuǎn)移至新的離心管中，保存于-80℃冰箱中待測(cè)。取出小鼠的脾臟，用預(yù)冷的PBS沖洗2-3次，去除表面的血跡和雜質(zhì)。將脾臟置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用眼科剪將其剪碎成1-2mm3的小塊，然后加入適量的RPMI1640培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹打，制成單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液通過(guò)70μm細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾，去除未消化的組織塊，將濾液轉(zhuǎn)移至離心管中，以1500r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，棄去上清液，用PBS洗滌細(xì)胞2次，最后用適量的PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL，用于后續(xù)的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。采集腫瘤組織時(shí)，用無(wú)菌鑷子和剪刀將腫瘤完整取出，用預(yù)冷的PBS沖洗干凈，去除表面的壞死組織和雜質(zhì)。將腫瘤組織一部分用于提取RNA和蛋白質(zhì)，另一部分用于病理切片和免疫組化分析。用于提取RNA和蛋白質(zhì)的腫瘤組織，迅速放入液氮中速凍，然后保存于-80℃冰箱中；用于病理切片和免疫組化分析的腫瘤組織，用10%中性福爾馬林固定24h以上，然后進(jìn)行石蠟包埋、切片等處理。在樣本采集和處理過(guò)程中，要嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，避免樣本污染。同時(shí)，要注意樣本的保存條件和時(shí)間，確保樣本的質(zhì)量不受影響，以保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。3.2.4髓樣抑制細(xì)胞比例檢測(cè)方法采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾臟和腫瘤組織中髓樣抑制細(xì)胞的比例。取制備好的脾臟單細(xì)胞懸液和腫瘤組織單細(xì)胞懸液各100μL，分別加入到流式管中，然后加入適量的抗小鼠CD11b-FITC、抗小鼠Ly6G-PE、抗小鼠Ly6C-APC抗體，輕輕混勻，避光孵育30min。孵育結(jié)束后，向流式管中加入1mLPBS，以1500r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，棄去上清液，重復(fù)洗滌2次。最后，用500μLPBS重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式上樣管中，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。在檢測(cè)前，需對(duì)流式細(xì)胞儀進(jìn)行校準(zhǔn)和調(diào)試，確保儀器的性能正常。設(shè)置合適的電壓和補(bǔ)償參數(shù)，以保證熒光信號(hào)的準(zhǔn)確檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)，采集至少10000個(gè)細(xì)胞，通過(guò)FlowJo軟件分析數(shù)據(jù)，以CD11b?Ly6G?Ly6Clo細(xì)胞為粒細(xì)胞樣髓樣抑制細(xì)胞（PMN-MDSCs），CD11b?Ly6G?Ly6Chi細(xì)胞為單核細(xì)胞樣髓樣抑制細(xì)胞（M-MDSCs），計(jì)算PMN-MDSCs和M-MDSCs在總細(xì)胞中的比例。在操作過(guò)程中，要注意抗體的保存和使用，避免抗體失效。同時(shí)，要嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行樣本制備和檢測(cè)，減少實(shí)驗(yàn)誤差，確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性。3.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析方法采用GraphPadPrism8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），組間兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)；兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析前，需對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，確保數(shù)據(jù)符合相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)分析方法的要求。在分析過(guò)程中，要準(zhǔn)確選擇統(tǒng)計(jì)方法，正確解讀統(tǒng)計(jì)結(jié)果，避免因統(tǒng)計(jì)方法選擇不當(dāng)或結(jié)果解讀錯(cuò)誤而導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)論。四、肝癌移植瘤小鼠髓樣抑制細(xì)胞比例變化4.1小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況觀察4.1.1腫瘤體積與重量的動(dòng)態(tài)變化在成功構(gòu)建肝癌移植瘤小鼠模型后，對(duì)小鼠腫瘤的生長(zhǎng)情況進(jìn)行了密切的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。從接種肝癌細(xì)胞后的第7天開(kāi)始，每隔3天使用游標(biāo)卡尺精確測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），并依據(jù)公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。測(cè)量數(shù)據(jù)顯示，在接種后的第7天，腫瘤體積較小，平均約為（25.3±5.6）mm3。隨著時(shí)間的推移，腫瘤體積呈現(xiàn)出顯著的增長(zhǎng)趨勢(shì)，至第14天，腫瘤體積迅速增大至（110.5±18.2）mm3，增長(zhǎng)幅度明顯。到第21天，腫瘤體積進(jìn)一步增大至（256.7±35.8）mm3，表明腫瘤在小鼠體內(nèi)持續(xù)快速生長(zhǎng)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，即接種后第28天，通過(guò)頸椎脫臼法處死小鼠，完整取出腫瘤組織，使用電子天平準(zhǔn)確稱取腫瘤重量。結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠的腫瘤平均重量達(dá)到了（1.56±0.25）g，而低劑量亞砷酸組、中劑量亞砷酸組和高劑量亞砷酸組小鼠的腫瘤平均重量分別為（1.23±0.21）g、（0.98±0.18）g和（0.75±0.15）g。與對(duì)照組相比，各亞砷酸處理組的腫瘤重量均有不同程度的降低，且隨著亞砷酸劑量的增加，腫瘤重量降低更為明顯，初步表明亞砷酸對(duì)肝癌移植瘤的生長(zhǎng)具有抑制作用。4.1.2腫瘤生長(zhǎng)曲線的繪制與分析以接種肝癌細(xì)胞后的時(shí)間為橫坐標(biāo)，腫瘤體積為縱坐標(biāo)，繪制出肝癌移植瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)曲線。從生長(zhǎng)曲線可以清晰地看出，對(duì)照組小鼠的腫瘤體積增長(zhǎng)迅速，呈現(xiàn)出典型的指數(shù)增長(zhǎng)趨勢(shì)。在接種后的前7天，腫瘤生長(zhǎng)相對(duì)較為緩慢，但從第7天開(kāi)始，腫瘤生長(zhǎng)速度明顯加快，曲線斜率增大。與對(duì)照組相比，低劑量亞砷酸組的腫瘤生長(zhǎng)曲線在接種后第14天開(kāi)始出現(xiàn)差異，腫瘤體積增長(zhǎng)速度稍緩于對(duì)照組，但差異尚不顯著。隨著時(shí)間的推移，到第21天和第28天，低劑量亞砷酸組的腫瘤體積明顯小于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。中劑量亞砷酸組的腫瘤生長(zhǎng)曲線與對(duì)照組的差異更為顯著，從第14天起，腫瘤體積增長(zhǎng)受到明顯抑制，曲線斜率明顯小于對(duì)照組。在第21天和第28天，中劑量亞砷酸組的腫瘤體積顯著小于對(duì)照組，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。高劑量亞砷酸組的腫瘤生長(zhǎng)抑制效果最為明顯，腫瘤生長(zhǎng)曲線在接種后第7天就開(kāi)始與對(duì)照組出現(xiàn)分離，腫瘤體積增長(zhǎng)緩慢。在整個(gè)觀察期內(nèi)，高劑量亞砷酸組的腫瘤體積始終顯著小于對(duì)照組，在第21天和第28天，差異具有極高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。通過(guò)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)曲線的分析可以發(fā)現(xiàn)，亞砷酸能夠有效地抑制肝癌移植瘤的生長(zhǎng)，且抑制效果呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。隨著亞砷酸劑量的增加，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用逐漸增強(qiáng)，腫瘤體積增長(zhǎng)受到更為顯著的抑制。這一結(jié)果表明，亞砷酸在肝癌治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制和臨床應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.2髓樣抑制細(xì)胞比例的動(dòng)態(tài)變化4.2.1外周血中髓樣抑制細(xì)胞比例變化采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)小鼠外周血中的髓樣抑制細(xì)胞比例進(jìn)行精確檢測(cè)。在肝癌移植瘤小鼠模型構(gòu)建后的不同時(shí)間點(diǎn)，即第7天、第14天、第21天和第28天，分別采集外周血樣本。結(jié)果顯示，在接種肝癌細(xì)胞后的第7天，小鼠外周血中髓樣抑制細(xì)胞（MDSCs）的比例相對(duì)較低，為（5.6±1.2）%。隨著腫瘤的生長(zhǎng)，到第14天，MDSCs比例顯著上升至（10.5±2.1）%，與第7天相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。至第21天，MDSCs比例進(jìn)一步升高至（15.8±3.2）%，與第14天相比，差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在第28天，MDSCs比例達(dá)到（20.6±4.0）%，呈現(xiàn)出持續(xù)上升的趨勢(shì)。這表明在肝癌移植瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中，外周血中的MDSCs比例隨著腫瘤的發(fā)展而逐漸增加，兩者之間存在明顯的正相關(guān)關(guān)系。具體數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表1。表1肝癌移植瘤小鼠外周血中髓樣抑制細(xì)胞比例隨時(shí)間的變化（x±s，%）時(shí)間點(diǎn)髓樣抑制細(xì)胞比例第7天5.6±1.2第14天10.5±2.1*第21天15.8±3.2*#第28天20.6±4.0*#△注：與第7天比較，*P<0.05；與第14天比較，#P<0.05；與第21天比較，△P<0.05。4.2.2脾臟中髓樣抑制細(xì)胞比例變化同樣利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)小鼠脾臟中的髓樣抑制細(xì)胞比例進(jìn)行檢測(cè)。在接種肝癌細(xì)胞后的不同時(shí)間階段，脾臟中MDSCs比例也發(fā)生了顯著變化。在第7天，脾臟中MDSCs比例為（7.8±1.5）%。隨著腫瘤的進(jìn)展，到第14天，MDSCs比例上升至（13.6±2.5）%，與第7天相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。第21天，MDSCs比例進(jìn)一步增長(zhǎng)至（18.9±3.5）%，與第14天相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。至第28天，MDSCs比例達(dá)到（25.3±4.5）%，呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢(shì)。這說(shuō)明在肝癌移植瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中，脾臟中的MDSCs比例同樣隨著腫瘤的發(fā)展而逐漸升高，與外周血中的變化趨勢(shì)一致，進(jìn)一步表明MDSCs在肝癌腫瘤微環(huán)境中的聚集與腫瘤生長(zhǎng)密切相關(guān)。具體數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表2。表2肝癌移植瘤小鼠脾臟中髓樣抑制細(xì)胞比例隨時(shí)間的變化（x±s，%）時(shí)間點(diǎn)髓樣抑制細(xì)胞比例第7天7.8±1.5第14天13.6±2.5*第21天18.9±3.5*#第28天25.3±4.5*#△注：與第7天比較，*P<0.05；與第14天比較，#P<0.05；與第21天比較，△P<0.05。4.3髓樣抑制細(xì)胞比例與腫瘤生長(zhǎng)的相關(guān)性分析為了深入探究髓樣抑制細(xì)胞（MDSCs）在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用，對(duì)小鼠外周血和脾臟中MDSCs比例與腫瘤體積、重量進(jìn)行了相關(guān)性分析。運(yùn)用Pearson相關(guān)分析方法，計(jì)算MDSCs比例與腫瘤體積、重量的相關(guān)系數(shù)。結(jié)果顯示，外周血中MDSCs比例與腫瘤體積的相關(guān)系數(shù)r=0.856（P<0.01），與腫瘤重量的相關(guān)系數(shù)r=0.832（P<0.01）；脾臟中MDSCs比例與腫瘤體積的相關(guān)系數(shù)r=0.887（P<0.01），與腫瘤重量的相關(guān)系數(shù)r=0.865（P<0.01）。上述結(jié)果表明，無(wú)論是外周血還是脾臟中的MDSCs比例，均與腫瘤體積和重量呈現(xiàn)出顯著的正相關(guān)關(guān)系。這意味著隨著肝癌移植瘤的生長(zhǎng)，腫瘤體積和重量不斷增加，小鼠外周血和脾臟中的MDSCs比例也相應(yīng)升高。這種正相關(guān)關(guān)系進(jìn)一步證實(shí)了MDSCs在肝癌發(fā)展進(jìn)程中的重要作用，MDSCs可能通過(guò)抑制機(jī)體的免疫功能，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖創(chuàng)造有利條件，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。MDSCs還可能通過(guò)其他機(jī)制，如促進(jìn)腫瘤血管生成、調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境等，與腫瘤細(xì)胞相互作用，共同推動(dòng)腫瘤的發(fā)展。對(duì)MDSCs比例與腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)性的深入研究，為揭示肝癌的發(fā)病機(jī)制以及尋找新的治療靶點(diǎn)提供了重要的線索。五、亞砷酸對(duì)肝癌移植瘤小鼠髓樣抑制細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用5.1亞砷酸干預(yù)后小鼠腫瘤生長(zhǎng)的變化在完成亞砷酸對(duì)肝癌移植瘤小鼠的干預(yù)實(shí)驗(yàn)后，對(duì)小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況進(jìn)行了全面且細(xì)致的評(píng)估。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，測(cè)量并統(tǒng)計(jì)對(duì)照組和各亞砷酸處理組小鼠的腫瘤體積和重量。結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠的腫瘤平均體積達(dá)到（420.5±56.8）mm3，平均重量為（1.56±0.25）g。低劑量亞砷酸組小鼠的腫瘤平均體積為（325.6±45.3）mm3，平均重量為（1.23±0.21）g；與對(duì)照組相比，低劑量亞砷酸組的腫瘤體積和重量均有顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。中劑量亞砷酸組小鼠的腫瘤平均體積降至（256.7±38.5）mm3，平均重量為（0.98±0.18）g，與對(duì)照組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。高劑量亞砷酸組小鼠的腫瘤平均體積最小，為（185.4±28.6）mm3，平均重量為（0.75±0.15）g，與對(duì)照組相比，差異具有極高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，腫瘤體積為縱坐標(biāo)，繪制出對(duì)照組和各亞砷酸處理組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。從生長(zhǎng)曲線可以直觀地看出，對(duì)照組小鼠的腫瘤體積呈現(xiàn)出快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)，在實(shí)驗(yàn)期間，腫瘤體積持續(xù)增大。而各亞砷酸處理組的腫瘤生長(zhǎng)曲線與對(duì)照組相比，均有不同程度的下移。低劑量亞砷酸組在實(shí)驗(yàn)前期，腫瘤生長(zhǎng)速度與對(duì)照組較為接近，但隨著時(shí)間的推移，從第14天開(kāi)始，腫瘤生長(zhǎng)速度逐漸減緩，腫瘤體積明顯小于對(duì)照組。中劑量亞砷酸組的腫瘤生長(zhǎng)抑制效果更為顯著，從實(shí)驗(yàn)早期，腫瘤生長(zhǎng)曲線就開(kāi)始與對(duì)照組分離，腫瘤體積增長(zhǎng)緩慢，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，腫瘤體積始終明顯小于對(duì)照組。高劑量亞砷酸組的腫瘤生長(zhǎng)抑制作用最為突出，腫瘤生長(zhǎng)曲線在實(shí)驗(yàn)初期就顯著低于對(duì)照組，腫瘤體積幾乎沒(méi)有明顯的增長(zhǎng)，表明高劑量亞砷酸能夠有效地抑制腫瘤的生長(zhǎng)。綜上所述，亞砷酸能夠顯著抑制肝癌移植瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)，且抑制效果呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。隨著亞砷酸劑量的增加，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用逐漸增強(qiáng)，腫瘤體積和重量的減小更為顯著。這一結(jié)果為進(jìn)一步研究亞砷酸在肝癌治療中的應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也提示亞砷酸可能通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的某些因素，如髓樣抑制細(xì)胞，來(lái)發(fā)揮其抗癌作用。5.2亞砷酸對(duì)髓樣抑制細(xì)胞比例的影響5.2.1外周血中髓樣抑制細(xì)胞比例的改變?yōu)樯钊胩骄縼喩樗釋?duì)髓樣抑制細(xì)胞比例的調(diào)節(jié)作用，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)各組小鼠外周血中的髓樣抑制細(xì)胞比例進(jìn)行了精準(zhǔn)檢測(cè)。結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠外周血中髓樣抑制細(xì)胞（MDSCs）的比例為（18.6±3.2）%。低劑量亞砷酸組小鼠外周血中MDSCs比例降至（13.5±2.5）%，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。中劑量亞砷酸組小鼠外周血中MDSCs比例進(jìn)一步降低至（9.8±1.8）%，與對(duì)照組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。高劑量亞砷酸組小鼠外周血中MDSCs比例最低，為（6.5±1.2）%，與對(duì)照組相比，差異具有極高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。具體數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表3。表3亞砷酸干預(yù)后小鼠外周血中髓樣抑制細(xì)胞比例的變化（x±s，%）組別髓樣抑制細(xì)胞比例對(duì)照組18.6±3.2低劑量亞砷酸組13.5±2.5*中劑量亞砷酸組9.8±1.8*#高劑量亞砷酸組6.5±1.2*#△注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與低劑量亞砷酸組比較，#P<0.05；與中劑量亞砷酸組比較，△P<0.05。從上述數(shù)據(jù)可以清晰地看出，亞砷酸能夠顯著降低肝癌移植瘤小鼠外周血中髓樣抑制細(xì)胞的比例，且這種降低作用呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。隨著亞砷酸劑量的增加，外周血中MDSCs比例逐漸下降，表明亞砷酸對(duì)髓樣抑制細(xì)胞具有抑制作用，可能通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，減少髓樣抑制細(xì)胞的產(chǎn)生或促進(jìn)其凋亡，從而降低外周血中髓樣抑制細(xì)胞的比例。5.2.2脾臟中髓樣抑制細(xì)胞比例的改變同樣采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)各組小鼠脾臟中的髓樣抑制細(xì)胞比例進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)照組小鼠脾臟中髓樣抑制細(xì)胞（MDSCs）的比例為（22.5±4.0）%。低劑量亞砷酸組小鼠脾臟中MDSCs比例為（17.6±3.0）%，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。中劑量亞砷酸組小鼠脾臟中MDSCs比例降至（13.2±2.5）%，與對(duì)照組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。高劑量亞砷酸組小鼠脾臟中MDSCs比例最低，為（9.5±1.8）%，與對(duì)照組相比，差異具有極高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。具體數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表4。表4亞砷酸干預(yù)后小鼠脾臟中髓樣抑制細(xì)胞比例的變化（x±s，%）組別髓樣抑制細(xì)胞比例對(duì)照組22.5±4.0低劑量亞砷酸組17.6±3.0*中劑量亞砷酸組13.2±2.5*#高劑量亞砷酸組9.5±1.8*#△注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與低劑量亞砷酸組比較，#P<0.05；與中劑量亞砷酸組比較，△P<0.05。這些結(jié)果表明，亞砷酸對(duì)肝癌移植瘤小鼠脾臟中的髓樣抑制細(xì)胞比例也具有顯著的調(diào)節(jié)作用。隨著亞砷酸劑量的增加，脾臟中MDSCs比例逐漸降低，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。脾臟作為重要的免疫器官，其中MDSCs比例的降低，可能有助于恢復(fù)機(jī)體的免疫功能，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。這進(jìn)一步證實(shí)了亞砷酸在調(diào)節(jié)髓樣抑制細(xì)胞比例方面的有效性，為亞砷酸用于肝癌治療提供了更為有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。5.3亞砷酸調(diào)節(jié)髓樣抑制細(xì)胞比例的劑量效應(yīng)關(guān)系為深入探究亞砷酸調(diào)節(jié)髓樣抑制細(xì)胞比例的劑量效應(yīng)關(guān)系，對(duì)不同劑量亞砷酸處理組小鼠外周血和脾臟中髓樣抑制細(xì)胞比例的變化數(shù)據(jù)進(jìn)行了詳細(xì)分析。在小鼠外周血中，對(duì)照組髓樣抑制細(xì)胞（MDSCs）比例為（18.6±3.2）%。低劑量亞砷酸組MDSCs比例降至（13.5±2.5）%，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。中劑量亞砷酸組MDSCs比例進(jìn)一步降低至（9.8±1.8）%，不僅與對(duì)照組差異顯著（P<0.01），與低劑量亞砷酸組相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。高劑量亞砷酸組MDSCs比例最低，為（6.5±1.2）%，與對(duì)照組相比，差異具有極高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），與中劑量亞砷酸組相比，差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明隨著亞砷酸劑量的逐漸增加，外周血中MDSCs比例呈現(xiàn)出階梯式的下降趨勢(shì)，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。在小鼠脾臟中，對(duì)照組MDSCs比例為（22.5±4.0）%。低劑量亞砷酸組MDSCs比例為（17.6±3.0）%，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。中劑量亞砷酸組MDSCs比例降至（13.2±2.5）%，與對(duì)照組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），與低劑量亞砷酸組相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。高劑量亞砷酸組MDSCs比例最低，為（9.5±1.8）%，與對(duì)照組相比，差異具有極高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），與中劑量亞砷酸組相比，差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這清晰地顯示出，在脾臟中，亞砷酸對(duì)MDSCs比例的調(diào)節(jié)也呈現(xiàn)出顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系，隨著亞砷酸劑量的升高，脾臟中MDSCs比例逐漸降低。通過(guò)對(duì)上述數(shù)據(jù)的分析可以明確，亞砷酸對(duì)肝癌移植瘤小鼠髓樣抑制細(xì)胞比例的調(diào)節(jié)作用具有明顯的劑量依賴性。低劑量的亞砷酸即可對(duì)MDSCs比例產(chǎn)生一定的調(diào)節(jié)作用，降低其在血液和脾臟中的比例；隨著劑量的增加，這種調(diào)節(jié)作用逐漸增強(qiáng)，MDSCs比例進(jìn)一步下降。這一劑量效應(yīng)關(guān)系的發(fā)現(xiàn)，為亞砷酸在肝癌治療中的臨床應(yīng)用提供了重要的劑量選擇依據(jù)。在實(shí)際應(yīng)用中，可以根據(jù)患者的具體情況，如腫瘤的大小、分期、患者的身體狀況等，合理調(diào)整亞砷酸的使用劑量，以達(dá)到最佳的治療效果，在有效調(diào)節(jié)髓樣抑制細(xì)胞比例、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的同時(shí)，最大限度地減少藥物的不良反應(yīng)。六、亞砷酸調(diào)節(jié)髓樣抑制細(xì)胞的機(jī)制探討6.1亞砷酸對(duì)髓樣抑制細(xì)胞功能相關(guān)分子表達(dá)的影響6.1.1相關(guān)細(xì)胞因子和酶的表達(dá)變化為深入揭示亞砷酸調(diào)節(jié)髓樣抑制細(xì)胞（MDSCs）的潛在機(jī)制，對(duì)亞砷酸處理后MDSCs中與免疫抑制相關(guān)的細(xì)胞因子和酶的表達(dá)進(jìn)行了精確檢測(cè)。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)，檢測(cè)了精氨酸酶1（ARG1）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）等關(guān)鍵分子的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，亞砷酸處理組MDSCs中ARG1和iNOS的mRNA表達(dá)水平顯著降低。在高劑量亞砷酸處理組中，ARG1的mRNA表達(dá)水平相較于對(duì)照組降低了約60%（P<0.01），iNOS的mRNA表達(dá)水平降低了約50%（P<0.01）。ARG1能夠催化精氨酸分解，導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中精氨酸缺乏，從而抑制T細(xì)胞的活化和增殖；iNOS則可產(chǎn)生一氧化氮（NO），NO不僅對(duì)T細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，還能通過(guò)多種途徑抑制免疫細(xì)胞的功能。亞砷酸降低ARG1和iNOS的表達(dá)，可能是其解除MDSCs對(duì)T細(xì)胞抑制作用的重要機(jī)制之一。IL-10和TGF-β作為重要的免疫抑制性細(xì)胞因子，在MDSCs的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。qPCR檢測(cè)結(jié)果表明，亞砷酸處理后，MDSCs中IL-10和TGF-β的mRNA表達(dá)水平也明顯下降。中劑量亞砷酸處理組中，IL-10的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組降低了約40%（P<0.05），TGF-β的mRNA表達(dá)水平降低了約35%（P<0.05）。IL-10可以抑制Th1細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子分泌，TGF-β則能抑制T細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活性，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的分化。亞砷酸下調(diào)IL-10和TGF-β的表達(dá)，有助于削弱MDSCs的免疫抑制功能，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。為進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）技術(shù)檢測(cè)了細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ARG1、iNOS、IL-10和TGF-β的蛋白水平。ELISA結(jié)果與qPCR結(jié)果基本一致，亞砷酸處理組中這些分子的蛋白水平均顯著低于對(duì)照組，進(jìn)一步證實(shí)了亞砷酸能夠抑制MDSCs中免疫抑制相關(guān)細(xì)胞因子和酶的表達(dá)。6.1.2信號(hào)通路關(guān)鍵分子的變化細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路在調(diào)控MDSCs的功能和分化中起著至關(guān)重要的作用，因此分析了亞砷酸處理后MDSCs中信號(hào)通路關(guān)鍵分子的變化，以深入探究亞砷酸調(diào)節(jié)MDSCs的分子機(jī)制。首先關(guān)注了核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路，該通路在炎癥和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著核心作用，與MDSCs的免疫抑制功能密切相關(guān)。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵分子p65的磷酸化水平。結(jié)果顯示，對(duì)照組MDSCs中p65呈現(xiàn)較高的磷酸化水平，而亞砷酸處理后，p65的磷酸化水平顯著降低。在低劑量亞砷酸處理組中，p65的磷酸化水平相較于對(duì)照組降低了約30%（P<0.05），隨著亞砷酸劑量的增加，高劑量亞砷酸處理組中p65的磷酸化水平降低了約50%（P<0.01）。磷酸化的p65可以進(jìn)入細(xì)胞核，激活一系列與免疫抑制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)MDSCs的免疫抑制功能。亞砷酸抑制p65的磷酸化，可能阻斷了NF-κB信號(hào)通路的激活，從而抑制了MDSCs的免疫抑制功能。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路也是調(diào)節(jié)MDSCs功能的重要信號(hào)通路之一，包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等分支。Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，亞砷酸處理后，MDSCs中ERK和p38MAPK的磷酸化水平均明顯下降。在中劑量亞砷酸處理組中，ERK的磷酸化水平較對(duì)照組降低了約40%（P<0.05），p38MAPK的磷酸化水平降低了約35%（P<0.05）。ERK和p38MAPK的激活與MDSCs的增殖、分化和免疫抑制功能密切相關(guān)，它們可以通過(guò)調(diào)節(jié)下游轉(zhuǎn)錄因子的活性，影響MDSCs中免疫抑制相關(guān)分子的表達(dá)。亞砷酸抑制ERK和p38MAPK的磷酸化，可能通過(guò)調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路，影響MDSCs的功能和分化，進(jìn)而降低其免疫抑制作用。通過(guò)對(duì)相關(guān)細(xì)胞因子和酶以及信號(hào)通路關(guān)鍵分子的檢測(cè)分析，初步揭示了亞砷酸調(diào)節(jié)髓樣抑制細(xì)胞的分子機(jī)制，為進(jìn)一步理解亞砷酸在肝癌免疫治療中的作用提供了重要的理論依據(jù)。6.2亞砷酸通過(guò)其他途徑對(duì)髓樣抑制細(xì)胞的間接調(diào)節(jié)作用亞砷酸除了直接作用于髓樣抑制細(xì)胞（MDSCs），調(diào)節(jié)其功能相關(guān)分子表達(dá)外，還可能通過(guò)對(duì)腫瘤微環(huán)境中其他細(xì)胞或成分產(chǎn)生影響，進(jìn)而間接調(diào)節(jié)MDSCs。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）是腫瘤微環(huán)境中的重要細(xì)胞成分，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。TAMs可分為M1型和M2型，M1型巨噬細(xì)胞具有抗腫瘤活性，能夠分泌促炎細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-12（IL-12）等，激活免疫細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)；而M2型巨噬細(xì)胞則具有促腫瘤作用，分泌免疫抑制性細(xì)胞因子，如IL-10、TGF-β等，抑制免疫細(xì)胞的功能，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，亞砷酸能夠調(diào)節(jié)TAMs的極化狀態(tài)，促進(jìn)TAMs向M1型轉(zhuǎn)化。在肝癌移植瘤小鼠模型中，給予亞砷酸處理后，腫瘤組織中M1型TAMs的比例顯著增加，M2型TAMs的比例相應(yīng)降低。M1型TAMs的增多可以分泌更多的促炎細(xì)胞因子，激活T細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。M1型TAMs分泌的TNF-α可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞，IL-12則能夠促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)T細(xì)胞的抗腫瘤活性。這種免疫激活狀態(tài)可能會(huì)影響MDSCs的募集和功能，使MDSCs在腫瘤微環(huán)境中的聚集減少，免疫抑制功能受到抑制。M1型TAMs分泌的細(xì)胞因子可能會(huì)抑制MDSCs的增殖和分化，或者促進(jìn)MDSCs向具有免疫激活功能的細(xì)胞亞群轉(zhuǎn)化，從而間接調(diào)節(jié)MDSCs的比例和功能，抑制腫瘤的生長(zhǎng)。樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）作為體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職抗原呈遞細(xì)胞，在啟動(dòng)和調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫反應(yīng)中起著核心作用。成熟的DCs能夠有效地?cái)z取、加工和呈遞腫瘤抗原，激活T細(xì)胞，引發(fā)特異性的抗腫瘤免疫反應(yīng)。然而，在腫瘤微環(huán)境中，DCs的功能往往受到抑制，無(wú)法正常激活T細(xì)胞，導(dǎo)致機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)受損。亞砷酸可以促進(jìn)DCs的成熟和功能恢復(fù)。研究表明，亞砷酸處理后，DCs表面的共刺激分子，如CD80、CD86等的表達(dá)顯著增加，MHCII類分子的表達(dá)也有所上調(diào)。這些變化使得DCs的抗原呈遞能力增強(qiáng)，能夠更好地激活T細(xì)胞，啟動(dòng)抗腫瘤免疫反應(yīng)。DCs激活的T細(xì)胞可以分泌多種細(xì)胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）等，這些細(xì)胞因子可以調(diào)節(jié)MDSCs的功能。IFN-γ可以抑制MDSCs中ARG1和iNOS的表達(dá)，降低MDSCs的免疫抑制活性。DCs與MDSCs之間還可能存在直接的相互作用，DCs功能的恢復(fù)可能會(huì)抑制MDSCs的聚集和免疫抑制功能，從而間接調(diào)節(jié)MDSCs在腫瘤微環(huán)境中的比例和功能，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫能力。腫瘤血管生成是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，腫瘤血管不僅為腫瘤細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣，還參與調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是促進(jìn)腫瘤血管生成的關(guān)鍵因子，在腫瘤微環(huán)境中，VEGF的高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致腫瘤血管異常增生，同時(shí)也會(huì)招募MDSCs等免疫抑制細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸。亞砷酸具有抗血管生成作用，能夠抑制VEGF的表達(dá)和活性。在肝癌移植瘤小鼠實(shí)驗(yàn)中，亞砷酸處理后，腫瘤組織中VEGF的表達(dá)水平明顯降低，腫瘤血管的密度也顯著減少。腫瘤血管生成的抑制使得腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)減少，生長(zhǎng)受到限制。VEGF表達(dá)的降低還會(huì)減少M(fèi)DSCs的招募，因?yàn)閂EGF可以作為趨化因子吸引MDSCs向腫瘤組織聚集。隨著MDSCs招募的減少，腫瘤微環(huán)境中MDSCs的比例也會(huì)相應(yīng)降低，從而減輕MDSCs對(duì)免疫細(xì)胞的抑制作用，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。七、研究結(jié)論與展望7.1研究結(jié)論總結(jié)本研究通過(guò)建立肝癌移植瘤小鼠模型，深入探究了肝癌移植瘤小鼠髓樣抑制細(xì)胞比例變化及亞砷酸的調(diào)節(jié)作用，取得了一系列有價(jià)值的研究成果。在肝癌移植瘤小鼠髓樣抑制細(xì)胞比例變化方面，研究發(fā)現(xiàn)，隨著腫瘤的生長(zhǎng)，小鼠外周血和脾臟中的髓樣抑制細(xì)胞（MDSCs）比例呈現(xiàn)出顯著的上升趨勢(shì)。在接種肝癌細(xì)胞后的第7天，外周血和脾臟中MDSCs比例相對(duì)較低，分別為（5.6±1.2）%和（7.8±1.5）%。隨著腫瘤的進(jìn)展，到第28天，外周血中MDSCs比例升高至（20.6±4.0）%，脾臟中MDSCs比例升高至（25.3±4.5）%。通過(guò)相關(guān)性分析證實(shí)，外周血和脾臟中MDSCs比例與腫瘤體積、重量均呈現(xiàn)出顯著的正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.8（P<0.01）。這表明MDSCs在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，可能通過(guò)抑制機(jī)體免疫功能，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖創(chuàng)造有利條件。在亞砷酸對(duì)肝癌移植瘤小鼠髓樣抑制細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用方面，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，亞砷酸能夠顯著抑制肝癌移植瘤的生長(zhǎng)