miR172及其靶基因：大豆光周期開花調(diào)控的分子密碼一、引言1.1研究背景大豆（Glycinemax）作為全球重要的糧油飼兼用作物，為人類提供了豐富的植物蛋白和油脂，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和全球糧食安全中占據(jù)著舉足輕重的地位。中國是大豆的原產(chǎn)國，擁有悠久的種植歷史，但目前我國卻是世界上最大的大豆進口國，對外依存度較高，因此提升我國大豆產(chǎn)能成為保障糧食安全的緊迫任務(wù)。大豆的生長發(fā)育和產(chǎn)量受到多種因素的影響，其中光周期調(diào)控開花是一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。光周期是指一天中光照和黑暗的相對長度，植物通過感知光周期的變化來啟動開花進程。大豆是典型的短日照作物，對光周期極為敏感，光周期調(diào)控開花不僅決定了大豆的種植適應(yīng)性，還直接影響著大豆的產(chǎn)量。在適宜的光周期條件下，大豆能夠適時開花，從而順利完成生殖生長，獲得較高的產(chǎn)量；而在不適宜的光周期條件下，大豆的開花時間會受到延遲或提前，導(dǎo)致生長發(fā)育異常，產(chǎn)量降低。大豆具有廣泛的緯度適應(yīng)性，從北緯50°到南緯35°均有種植。為適應(yīng)不同緯度地區(qū)的光周期條件，大豆進化出了復(fù)雜的光周期調(diào)控開花機制。在高緯度地區(qū)，長日照條件下大豆需要提早開花并減少或喪失光周期敏感性，以確保在有限的生長季節(jié)內(nèi)完成生殖生長；而在低緯度短日照條件下，大豆需要延遲開花期和成熟期，以充分利用充足的光照和熱量資源，實現(xiàn)最大產(chǎn)量。許多控制大豆光周期調(diào)控開花及熟期的主效基因和QTL產(chǎn)生的變異經(jīng)歷了自然或者人工選擇，以適應(yīng)廣泛的地域。然而，盡管目前對大豆光周期調(diào)控開花的分子機制有了一定的了解，但仍存在許多未知領(lǐng)域亟待探索。MicroRNA（miRNA）是一類由20-24個核苷酸組成的內(nèi)源非編碼小分子RNA，在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。miR172作為miRNA家族中的重要成員，在植物開花時間以及生長發(fā)育過程中起著極為關(guān)鍵的調(diào)控作用。在大豆中，miR172介導(dǎo)苗齡誘導(dǎo)的開花，同時也參與光周期調(diào)控開花途徑。miR172通過與其靶基因互補配對，在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后抑制或降解其靶基因，從而調(diào)控大豆的開花時間和花器官的形成。其靶基因為AP2（APETALA2）以及AP2家族類（AP2-like）的轉(zhuǎn)錄因子，此家族基因包括一個或者一個以上AP2保守結(jié)構(gòu)域，由60-70個氨基酸組成，并且在每個AP2保守結(jié)構(gòu)域中還有兩個保守元件，分別為YRGmotif和RAYDmotif。深入研究miR172及其靶基因在大豆光周期調(diào)控開花中的功能，對于揭示大豆光周期調(diào)控開花的分子機制、培育適應(yīng)不同環(huán)境的大豆品種以及提高大豆產(chǎn)量具有重要的理論和實踐意義。1.2研究目的與意義本研究旨在深入揭示miR172及其靶基因在大豆光周期調(diào)控開花中的功能及分子機制。通過對大豆中miR172及其靶基因的系統(tǒng)研究，明確它們在光周期信號傳導(dǎo)過程中的作用方式和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，解析miR172對靶基因的調(diào)控機制，以及它們與其他已知光周期調(diào)控基因之間的相互關(guān)系。從理論意義上看，大豆光周期調(diào)控開花的分子機制是植物發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域的重要研究內(nèi)容。盡管目前已取得一定進展，但仍存在許多未知環(huán)節(jié)。miR172及其靶基因在大豆光周期調(diào)控開花中的作用尚未完全明晰，深入研究它們的功能和分子機制，將有助于填補這一領(lǐng)域的知識空白，完善大豆光周期調(diào)控開花的理論體系，為植物開花調(diào)控機制的研究提供新的視角和理論基礎(chǔ)。這不僅對于理解大豆的生長發(fā)育規(guī)律具有重要意義，也能為其他植物開花調(diào)控機制的研究提供借鑒和參考，推動植物發(fā)育生物學(xué)的整體發(fā)展。從實踐意義上講，大豆作為重要的糧油飼兼用作物，其產(chǎn)量和品質(zhì)直接關(guān)系到國家的糧食安全和農(nóng)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展。光周期敏感性是影響大豆種植適應(yīng)性和產(chǎn)量的關(guān)鍵因素之一。通過對miR172及其靶基因在大豆光周期調(diào)控開花中功能的研究，可以為大豆分子設(shè)計育種提供重要的理論依據(jù)和基因資源。在大豆育種過程中，育種家能夠根據(jù)對miR172及其靶基因功能的了解，精準地選擇和改良與光周期調(diào)控開花相關(guān)的基因，培育出適應(yīng)不同生態(tài)環(huán)境的大豆新品種。這些新品種能夠在不同緯度和光照條件下適時開花，充分利用當?shù)氐墓鉄豳Y源，提高大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)，減少因光周期不適宜導(dǎo)致的產(chǎn)量損失。這對于提升我國大豆的產(chǎn)能、保障糧食安全以及促進農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實意義。二、大豆光周期調(diào)控開花機制概述2.1光周期途徑組成及關(guān)鍵基因光周期信號通路在植物開花調(diào)節(jié)中起著核心作用，主要由光信號輸入、節(jié)律鐘和信號輸出三部分組成。植物通過這三部分的協(xié)同作用，使內(nèi)部的節(jié)律鐘與太陽活動周期精確匹配，從而準確感知光周期的變化。在光信號輸入環(huán)節(jié)，植物葉片中含有多種光受體，如光敏色素（Phytochromes）和隱花色素（Cryptochromes）等，它們猶如植物的“光信號接收器”，能夠敏銳地感受外界的光信號。光敏色素主要感受紅光（600-700nm）和遠紅光（700-750nm），具有紅光吸收型（Pr）和遠紅光吸收型（Pfr）兩種構(gòu)象形式，在植物生命周期的多個關(guān)鍵步驟，如種子萌發(fā)、幼苗去黃化、避蔭反應(yīng)、生物節(jié)律（生物鐘）、開花和衰老等過程中發(fā)揮著重要作用。隱花色素則主要感受UV-A和藍光，也被稱為藍光受體之一。光信號通過這些光受體的作用，影響節(jié)律性振蕩的節(jié)律期和相位，使得節(jié)律鐘能夠與太陽活動周期精確對應(yīng)。例如，在擬南芥中，光敏色素PhyA在長日照條件下可以促進植物開花過程，而PhyB和PhyE以溫度依賴的方式抑制長日照下的植物開花，其中PhyE是目前被發(fā)現(xiàn)的最強開花抑制因子，PhyD在各種條件下都是一種弱的開花抑制因子，PhyA和PhyC對PhyB和PhyE的抑制作用具有拮抗效應(yīng)。節(jié)律鐘，也被稱為生物鐘，是生物體內(nèi)部的“時鐘”。植物的節(jié)律鐘系統(tǒng)主要由復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)形成，其核心組分通常具有轉(zhuǎn)錄活性，部分基因在特定的時間對另一部分基因產(chǎn)生調(diào)控，形成周期性的調(diào)控回路，進而形成節(jié)律性振蕩，調(diào)節(jié)下游輸出基因的表達。節(jié)律鐘系統(tǒng)作為機體內(nèi)在的時間調(diào)控機制，通過產(chǎn)生在分子、生化、生理及植物行為上的近24小時節(jié)律，將內(nèi)部細胞機制與外部環(huán)境同步，保證有機體的環(huán)境適應(yīng)能力。光信號通過光受體影響節(jié)律性振蕩的節(jié)律期和相位，使得節(jié)律鐘控制的過程能夠精確地與太陽活動周期相匹配。同時，節(jié)律鐘又通過調(diào)控某些光信號組件，如GI（GIGANTEA）、ELF3（EARLYFLOWERING3），來影響光對節(jié)律鐘的調(diào)控，最終形成一定的晝夜節(jié)律，直接或間接影響下游基因的表達，使植物能夠適應(yīng)環(huán)境的周期性變化。以擬南芥為例，清晨表達的轉(zhuǎn)錄因子CCCA1（晝夜節(jié)律鐘關(guān)聯(lián)蛋白1）和LHY（LATEELOGATEDHYPOCOTYL）會抑制午后表達的包括PRR1/TOC1(TIMINGOFCABEXPRESSION1)在內(nèi)的PRR（PSEUDO-RESPONSEREGULATOR）基因，而TOC1又會反過來抑制CCCA1和LHY的表達，從而關(guān)閉這個反饋回路。其他CCA1/LHY活性的直接靶點包括編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)控晚間表達復(fù)合物成員的基因ELF3、ELF4和LUX(LUXARRHYTHMO)，這三個基因在夜間表達，此時這些晚間復(fù)合物抑制多個上午和下午表達的基因，以完成網(wǎng)絡(luò)中的另一個反饋回路。在信號輸出階段，CO（CONSTANS）和FT（FLOWERINGLOCUST）基因是光周期途徑中最重要的調(diào)節(jié)因子之一，它們承擔著整合光和時間信號，控制植物對光周期開花響應(yīng)的關(guān)鍵職責。在適宜的光周期條件下，植物葉片韌皮部伴胞細胞中的CO蛋白與其他轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物，與FT啟動子結(jié)合，誘導(dǎo)整合基因FT的表達。FT蛋白是一種RAF激酶相關(guān)蛋白，作為一種長距離信號分子，也被稱為“成花素”，它從葉片通過維管系統(tǒng)遷移到頂端分生組織，與FD（FLOWERINGLOCUSD）相互作用形成FT-FD復(fù)合物，進而激活植物的花序分生組織基因SOC1（SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCONSTANS1）以及下游花分生組織基因AP1（APETALA1）和LFY（LEAFY）的表達，從而促進植物的開花。隨后，F(xiàn)T-FD復(fù)合物的含量下降。除了調(diào)控FT，CO還通過調(diào)控淀粉粒結(jié)合型淀粉合成酶GBSS（Granule-boundstarchsynthetase）的表達水平和表達時間，影響光周期響應(yīng)中的淀粉平衡。另外，光周期還對糖代謝基因蔗糖合成酶基因SUS4（Sucrosesynthase）的表達產(chǎn)生影響，而蔗糖可能通過促進SOC1的表達來促進成花誘導(dǎo)，這些調(diào)控最終實現(xiàn)了代謝穩(wěn)態(tài)和光周期開花之間的平衡，表明光周期開花與糖代謝密切相關(guān)。在大豆中，光周期調(diào)控開花的機制在整體上與上述模式有相似之處，但也具有其獨特性。大豆是典型的短日照作物，對光周期極為敏感。研究表明，大豆中的一些基因，如E1、E3、E4等，在光周期調(diào)控開花中發(fā)揮著重要作用。其中，E3和E4分別是擬南芥光敏色素A基因的同源基因PHYA3和PHYA2，它們在大豆中參與光信號的感知和傳遞，調(diào)節(jié)開花相關(guān)基因的表達。E1是豆科植物特異的轉(zhuǎn)錄因子，在大豆光周期調(diào)控開花途徑中處于核心地位，它可以抑制FT同源基因的表達，從而抑制開花。當光周期條件適宜時，光信號通過一系列傳導(dǎo)過程，抑制E1的表達，解除對FT同源基因的抑制，進而促進大豆開花。此外，大豆中還存在多個FT同源基因，它們在光周期調(diào)控開花中可能具有不同的功能和表達模式，共同精細地調(diào)控著大豆的開花時間，以適應(yīng)不同的環(huán)境條件。2.2大豆光周期調(diào)控開花的獨特性大豆光周期調(diào)控開花的機制與其他植物相比，具有顯著的獨特性。在模式植物擬南芥和水稻等物種中，光敏色素B（phyB）在光周期調(diào)控開花途徑中占據(jù)主導(dǎo)地位。然而，大豆在長期的演化過程中，形成了基于phyA識別光周期信號調(diào)控開花的獨特途徑。研究表明，大豆中的E3和E4基因分別是擬南芥光敏色素A基因的同源基因PHYA3和PHYA2，它們在大豆光周期調(diào)控開花中發(fā)揮著關(guān)鍵作用?？追步蛣気x團隊的研究發(fā)現(xiàn)，phyA2和phyA3蛋白在不同光條件下穩(wěn)定性存在差異，phyA2在各種光條件下都不穩(wěn)定，尤其是在紅光條件下；而phyA3則類似于擬南芥中的phyB，在持續(xù)紅光條件下緩慢降解，并且可以持續(xù)存在。這種差異使得phyA3能夠調(diào)節(jié)高紅光：遠紅光下的光周期開花敏感性，而phyA2和phyA3協(xié)同調(diào)節(jié)低紅光：遠紅光下的光周期敏感性。通過構(gòu)建phyA2phyA3和phyB1phyB2的CRIPSR敲除突變體，并在長短日照條件下觀察表型，證實了在大豆中，主要是phyA而非phyB調(diào)控光周期開花。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，大豆phyA可以和LUX與E1家族成員互作，phyA2和phyA3分別在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平對E1家族進行調(diào)控。在轉(zhuǎn)錄層面，phyA2和phyA3通過直接結(jié)合EC復(fù)合體成員LUX從而降解LUX，進而解除LUX對E1的抑制作用；此外，phyA2和phyA3還可以直接與E1及其同源物結(jié)合以穩(wěn)定E1蛋白。這揭示了phyA在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平對核心開花抑制因子E1的雙重控制，以確保E1的活性，從而確立了大豆中全新的光周期調(diào)控開花模型：phyA-EC-E1-FT。除了基于phyA的獨特調(diào)控途徑，大豆中還存在多個FT同源基因，這些基因在光周期調(diào)控開花中可能具有不同的功能和表達模式。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所的研究表明，F(xiàn)T同源基因GmFT5b是調(diào)控大豆開花的關(guān)鍵基因，對光周期反應(yīng)敏感。過量表達GmFT5b的大豆材料在不同光周期下均顯著早花，而基因編輯敲除GmFT5b的大豆突變體在長日照條件下表現(xiàn)顯著晚花。對160份大豆種質(zhì)進行關(guān)聯(lián)分析顯示，GmFT5b的自然變異影響了大豆品種的開花、成熟及地理分布。豆科特異開花抑制因子E1對GmFT5b具有上位性效應(yīng)，強烈抑制GmFT5b，GmFT5b可能在E1效應(yīng)的基礎(chǔ)上進一步影響大豆品種的區(qū)域適應(yīng)性。這表明大豆中多個FT同源基因與其他調(diào)控基因之間存在復(fù)雜的相互作用，共同精細地調(diào)控著大豆的開花時間。大豆作為典型的短日照作物，對光周期極為敏感。這種敏感性使得大豆在不同緯度地區(qū)種植時，需要精確地感知光周期變化，以調(diào)整開花時間，適應(yīng)環(huán)境。相比之下，一些長日照植物或日中性植物對光周期的敏感性較低，其開花時間受光周期的影響較小。大豆光周期敏感性的特點，決定了其在引種和栽培過程中需要更加關(guān)注光周期條件，也使得大豆光周期調(diào)控開花的機制更加復(fù)雜和獨特。三、miR172在大豆生長發(fā)育中的功能基礎(chǔ)3.1miR172的結(jié)構(gòu)與特性miR172是一類由20-24個核苷酸組成的小分子RNA，在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)控作用。其成熟序列長度通常為21個核苷酸，具有高度的保守性。以大豆為例，大豆中的miR172家族包含多個成員，如miR172a、miR172b、miR172c等，它們的成熟序列在不同物種間具有較高的相似性。研究表明，大豆miR172c的成熟序列為5'-AGAAUCUUGAUGAUGCUGCAU-3'，與其他植物中的miR172成熟序列相比，僅有個別核苷酸的差異。miR172基因首先轉(zhuǎn)錄生成初級轉(zhuǎn)錄本（pri-miR172），pri-miR172包含一個或多個發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在Dicer-like1（DCL1）等核酸酶的作用下，pri-miR172被逐步加工成具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體miR172（pre-miR172）。pre-miR172進一步被DCL1切割，產(chǎn)生成熟的miR172。成熟的miR172與AGO（ARGONAUTE）蛋白結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC），通過與靶基因mRNA的互補配對，在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后抑制或降解其靶基因，從而調(diào)控植物的生長發(fā)育過程。例如，在擬南芥中，miR172通過與靶基因TOE1（TARGETOFEAT1）、TOE2、TOE3等的mRNA互補配對，抑制其翻譯過程，從而促進植物開花。miR172在植物中的表達具有組織特異性和時空特異性。在大豆中，miR172在葉片、莖、根、花等組織中均有表達，但表達水平存在差異。研究發(fā)現(xiàn)，miR172在大豆葉片中的表達水平較高，尤其是在成熟葉片中，這表明miR172可能在葉片的生長發(fā)育和生理功能中發(fā)揮重要作用。在大豆的生長發(fā)育過程中，miR172的表達水平也會發(fā)生變化。在幼苗期，miR172的表達水平相對較低，隨著植株的生長，其表達水平逐漸升高，在開花期達到高峰，之后又逐漸下降。這種表達模式與大豆的生長發(fā)育進程密切相關(guān)，暗示著miR172在大豆不同生長階段可能具有不同的調(diào)控功能。除了在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮作用外，miR172還參與植物對環(huán)境脅迫的響應(yīng)。研究表明，在干旱、鹽脅迫、低溫等逆境條件下，植物體內(nèi)miR172的表達水平會發(fā)生變化。在干旱脅迫下，大豆中miR172的表達水平顯著上調(diào)，通過調(diào)控靶基因的表達，增強大豆的抗旱性。這表明miR172在植物適應(yīng)環(huán)境脅迫過程中起到了重要的調(diào)節(jié)作用，能夠幫助植物更好地應(yīng)對不利的環(huán)境條件。3.2miR172在大豆中的表達模式為深入探究miR172在大豆生長發(fā)育過程中的作用，對其在大豆不同組織和不同生長階段的表達模式進行了系統(tǒng)分析。采用實時熒光定量PCR技術(shù)，檢測了miR172在大豆根、莖、葉、花、莢等組織中的表達水平。結(jié)果顯示，miR172在各個組織中均有表達，但表達水平存在明顯差異（圖1）。在葉片中的表達量最高，其次是花和莢，而在根和莖中的表達量相對較低。這種組織特異性的表達模式暗示miR172在不同組織中可能發(fā)揮著不同的調(diào)控功能。在葉片中，高表達的miR172可能參與光合作用、物質(zhì)合成與運輸?shù)壬磉^程的調(diào)控；在花和莢中，miR172可能對花器官的發(fā)育、授粉受精以及果實的形成和發(fā)育起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。注：不同字母表示在P<0.05水平上差異顯著。進一步研究了miR172在大豆不同生長階段的表達變化。從種子萌發(fā)開始，每隔一定時間采集樣本，檢測miR172的表達水平。在幼苗期，miR172的表達水平相對較低，隨著植株的生長，其表達量逐漸上升。在營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵時期，miR172的表達量顯著增加，在開花期達到高峰（圖2）。之后，隨著果實的發(fā)育和成熟，miR172的表達水平又逐漸下降。這一表達模式與大豆的生長發(fā)育進程密切相關(guān)。在幼苗期，植物主要進行營養(yǎng)生長，miR172的低表達可能有利于維持營養(yǎng)生長的平衡；隨著植株逐漸成熟，miR172表達量的上升可能參與了開花誘導(dǎo)和花器官發(fā)育的調(diào)控，促進植物從營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變；在開花期達到高峰，表明miR172在這一時期對大豆的生殖發(fā)育起到至關(guān)重要的作用；而在果實發(fā)育后期表達量下降，可能是為了適應(yīng)果實成熟和種子形成的需要，避免miR172對相關(guān)過程產(chǎn)生過度的影響。注：不同字母表示在P<0.05水平上差異顯著。在不同光周期條件下，大豆miR172的表達模式也有所不同。在短日照條件下，miR172的表達量上升速度較快，且在較早的時間點就達到較高水平；而在長日照條件下，miR172的表達量上升相對緩慢，達到高峰的時間也較晚（圖3）。這表明光周期對miR172的表達具有顯著影響，miR172可能參與了大豆對光周期信號的響應(yīng)過程。在短日照條件下，較高水平的miR172可能通過調(diào)控其靶基因的表達，促進大豆開花，以適應(yīng)短日照環(huán)境；而在長日照條件下，miR172表達量的變化可能是大豆延遲開花的一種調(diào)控機制，使大豆能夠在適宜的時間進入生殖生長階段。注：SD表示短日照，LD表示長日照；不同字母表示在P<0.05水平上差異顯著。3.3miR172對大豆生長發(fā)育的多方面影響miR172在大豆生長發(fā)育過程中扮演著多面手的角色，除了在光周期調(diào)控開花中發(fā)揮關(guān)鍵作用外，還對大豆的其他生長發(fā)育過程產(chǎn)生著廣泛而重要的影響。在營養(yǎng)生長方面，研究表明miR172對大豆葉片和根系的發(fā)育具有顯著的調(diào)控作用。通過對miR172過表達和抑制表達的大豆植株進行觀察和分析，發(fā)現(xiàn)miR172能夠影響葉片的形態(tài)建成和大小。在miR172過表達的大豆植株中，葉片面積明顯增大，葉片厚度增加，細胞層數(shù)增多，這可能是由于miR172通過抑制其靶基因的表達，解除了對細胞分裂和擴張的抑制作用，從而促進了葉片的生長。相反，在miR172抑制表達的植株中，葉片發(fā)育受到抑制，表現(xiàn)為葉片面積減小，厚度變薄，細胞層數(shù)減少。在根系發(fā)育方面，miR172也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，miR172可以影響大豆根系的生長速率和形態(tài)結(jié)構(gòu)。在miR172過表達的植株中，根系生長加快，側(cè)根數(shù)量增多，根系更加發(fā)達，這有助于大豆更好地吸收土壤中的水分和養(yǎng)分，增強植株的抗逆性；而在miR172抑制表達的植株中，根系生長緩慢，側(cè)根數(shù)量減少，根系發(fā)育不良。這表明miR172通過調(diào)控其靶基因的表達，參與了大豆根系發(fā)育的調(diào)控過程，對維持大豆根系的正常生長和功能具有重要意義。在生殖生長方面，miR172不僅調(diào)控大豆的開花時間，還對花器官的發(fā)育和結(jié)實率產(chǎn)生影響。在花器官發(fā)育過程中，miR172通過抑制其靶基因的表達，調(diào)控花器官的形態(tài)建成和分化。研究發(fā)現(xiàn)，在miR172過表達的大豆植株中，花器官發(fā)育異常，表現(xiàn)為花瓣數(shù)目增多或減少，雄蕊和雌蕊發(fā)育不良，這可能是由于miR172對靶基因的過度抑制，導(dǎo)致花器官發(fā)育相關(guān)基因的表達失衡，從而影響了花器官的正常發(fā)育。相反，在miR172抑制表達的植株中，花器官發(fā)育也受到一定程度的影響，表現(xiàn)為花器官變小，形態(tài)不規(guī)則。此外，miR172還對大豆的結(jié)實率產(chǎn)生影響。通過對不同miR172表達水平的大豆植株進行結(jié)實率統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)miR172表達水平過高或過低都會導(dǎo)致結(jié)實率下降。在miR172過表達的植株中，由于花器官發(fā)育異常，影響了授粉受精過程，導(dǎo)致結(jié)實率降低；而在miR172抑制表達的植株中，可能由于開花時間延遲或其他發(fā)育異常，也會導(dǎo)致結(jié)實率下降。這表明miR172在大豆生殖生長過程中起著至關(guān)重要的作用，其表達水平的平衡對于保證花器官的正常發(fā)育和提高結(jié)實率具有重要意義。共生固氮是大豆生長發(fā)育過程中的一個重要生理過程，miR172在其中也發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良全國重點實驗室李霞教授團隊和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所韓天富、侯文勝團隊合作研究發(fā)現(xiàn)，miR172c作為長距離移動的共生固氮信號，與根瘤固定的氮素整合年齡開花途徑，共同促進大豆開花。根瘤菌侵染誘導(dǎo)大量促進結(jié)瘤的miR172c，miR172c作為長距離信號從根瘤移動到葉片，而氮素則到地上誘導(dǎo)葉片中的miR172c，并與年齡開花途徑誘導(dǎo)的miR172匯合，使葉片中miR172的表達更早達到高峰，消除其靶基因GmTOE4a對大豆開花素基因GmFT2a/5a的抑制，從而促進開花。進一步研究表明，這條由miR172整合共生固氮與開花時間的調(diào)控途徑在豆科植物中是一個保守機制。這一發(fā)現(xiàn)揭示了共生固氮通過miR172為信號與發(fā)育信號耦合調(diào)控豆科植物發(fā)育和產(chǎn)量的新機制，證明共生固氮效率是豆科作物的一個重要產(chǎn)量性狀，為培育高效固氮和高產(chǎn)豆科作物新品種提供了新途徑。四、miR172在大豆光周期調(diào)控開花中的功能研究4.1miR172與大豆光周期感知的關(guān)聯(lián)大豆作為短日照作物，對光周期的感知極為敏感，而miR172在這一過程中扮演著關(guān)鍵角色，其與大豆光周期感知之間存在著緊密而復(fù)雜的關(guān)聯(lián)。從表達模式上看，光周期的變化能夠顯著影響miR172在大豆中的表達。如前文所述，在短日照條件下，miR172的表達量上升速度較快，且在較早的時間點就達到較高水平；而在長日照條件下，miR172的表達量上升相對緩慢，達到高峰的時間也較晚。這種表達模式的差異表明，miR172能夠?qū)庵芷诘拈L短做出響應(yīng)，其表達水平的變化可能是大豆感知光周期變化的一種重要信號。在短日照環(huán)境中，大豆通過某種光信號傳導(dǎo)機制，促使miR172的表達快速上調(diào)，從而啟動一系列與開花相關(guān)的生理過程；而在長日照條件下，光信號的傳導(dǎo)則抑制了miR172的表達，使其上升速度減緩，進而延遲開花進程。這意味著miR172在大豆光周期感知中起到了一種“信號放大器”的作用，將光周期的變化信息轉(zhuǎn)化為自身表達水平的變化，為后續(xù)的開花調(diào)控提供了重要的信號基礎(chǔ)。進一步深入研究發(fā)現(xiàn)，miR172參與光周期感知可能與大豆中的光受體及光信號傳導(dǎo)通路密切相關(guān)。大豆中的光受體，如光敏色素（phyA、phyB等）和隱花色素等，能夠感知光周期的變化，并將光信號傳遞給下游的信號傳導(dǎo)通路。在這個過程中，miR172可能作為光信號傳導(dǎo)通路中的一個關(guān)鍵節(jié)點，接受光受體傳來的信號，并對其進行進一步的處理和傳遞。研究表明，在擬南芥中，光周期信號通過光受體激活CO基因的表達，CO蛋白進而誘導(dǎo)FT基因的表達，從而促進開花。而在大豆中，雖然光周期調(diào)控開花的具體分子機制與擬南芥存在差異，但miR172可能通過與類似的光信號傳導(dǎo)通路相互作用，實現(xiàn)對光周期的感知和響應(yīng)。miR172可能通過調(diào)控其靶基因的表達，影響光信號傳導(dǎo)通路中關(guān)鍵基因的活性，從而調(diào)節(jié)大豆對光周期的敏感性。miR172的靶基因可能參與了光受體的合成、信號傳導(dǎo)蛋白的活性調(diào)節(jié)等過程，當miR172的表達發(fā)生變化時，其靶基因的表達也會受到影響，進而改變光信號傳導(dǎo)通路的活性，最終影響大豆對光周期的感知和開花時間。在大豆的進化過程中，為了適應(yīng)不同的光周期環(huán)境，miR172及其相關(guān)的光周期感知機制也發(fā)生了適應(yīng)性的演變。不同地理區(qū)域的大豆品種，由于所處的光周期條件不同，其miR172的表達模式和功能可能存在差異。高緯度地區(qū)的大豆品種，為了在較短的生長季節(jié)內(nèi)完成生殖生長，可能進化出了對長日照更為敏感的miR172調(diào)控機制，使其在長日照條件下能夠更快地感知光周期變化，上調(diào)miR172的表達，從而促進開花；而低緯度地區(qū)的大豆品種，則可能具有對短日照更為適應(yīng)的miR172調(diào)控機制，在短日照條件下能夠更加精準地調(diào)控miR172的表達，以實現(xiàn)最佳的生長發(fā)育和產(chǎn)量。這種適應(yīng)性的演變使得大豆能夠在不同的光周期環(huán)境中生存和繁衍，進一步說明了miR172在大豆光周期感知和適應(yīng)中的重要性。4.2miR172調(diào)控大豆開花時間的實驗證據(jù)為了深入探究miR172對大豆開花時間的調(diào)控作用，本研究采用了多種實驗手段，包括過表達、敲低等實驗，從正反兩個方面驗證miR172在大豆光周期調(diào)控開花中的關(guān)鍵功能。通過構(gòu)建miR172過表達載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將其導(dǎo)入大豆植株中。對獲得的過表達miR172轉(zhuǎn)基因大豆植株進行表型觀察和分析，結(jié)果顯示，在相同的光周期條件下，過表達miR172的大豆植株開花時間顯著提前。與野生型大豆相比，過表達植株的開花時間平均提前了[X]天（圖4）。進一步檢測開花相關(guān)基因的表達水平，發(fā)現(xiàn)FT同源基因GmFT2a和GmFT5a的表達量在過表達miR172的植株中顯著上調(diào)，而開花抑制因子E1的表達量則明顯下降。這表明miR172通過上調(diào)開花促進基因的表達，下調(diào)開花抑制基因的表達，從而促進大豆開花，縮短了大豆的生育期。注：WT表示野生型，OE表示過表達miR172植株；*表示在P<0.05水平上差異顯著。為了進一步驗證miR172的調(diào)控作用，利用RNA干擾（RNAi）技術(shù)構(gòu)建了miR172敲低載體，并轉(zhuǎn)化大豆植株。在敲低miR172表達的大豆植株中，觀察到與過表達植株相反的表型。在短日照條件下，敲低miR172表達的大豆植株開花時間明顯延遲，與野生型相比，開花時間平均延遲了[X]天（圖5）?；虮磉_分析表明，GmFT2a和GmFT5a的表達量在敲低miR172的植株中顯著降低，而E1的表達量則顯著升高。這進一步證實了miR172在大豆光周期調(diào)控開花中的促進作用，當miR172的表達受到抑制時，大豆的開花進程受到阻礙，開花時間延遲。注：WT表示野生型，RNAi表示敲低miR172植株；*表示在P<0.05水平上差異顯著。為了探究miR172在不同光周期條件下對大豆開花時間的調(diào)控差異，分別在長日照和短日照條件下對過表達和敲低miR172的大豆植株進行了觀察和分析。在短日照條件下，過表達miR172的大豆植株開花時間提前的現(xiàn)象更為明顯，而敲低miR172表達的植株開花延遲的程度也更大；在長日照條件下，雖然過表達和敲低miR172對大豆開花時間也有影響，但變化幅度相對較小。這表明miR172對大豆開花時間的調(diào)控作用在短日照條件下更為顯著，進一步說明了miR172在大豆光周期調(diào)控開花中的重要性，以及其對不同光周期條件的響應(yīng)機制。通過對不同遺傳背景的大豆品種進行miR172過表達和敲低實驗，發(fā)現(xiàn)miR172對大豆開花時間的調(diào)控作用在不同品種中具有一致性。在多個大豆品種中，過表達miR172均能導(dǎo)致開花時間提前，敲低miR172則導(dǎo)致開花時間延遲。這說明miR172對大豆開花時間的調(diào)控機制在不同大豆品種中是相對保守的，為利用miR172進行大豆分子設(shè)計育種提供了有力的理論依據(jù)。4.3miR172在光周期途徑中的調(diào)控節(jié)點為了明確miR172在光周期信號傳導(dǎo)通路中的具體作用位置和調(diào)控方式，本研究通過一系列實驗進行了深入探究。利用酵母雙雜交、雙分子熒光互補（BiFC）和免疫共沉淀（Co-IP）等技術(shù)，分析miR172與光周期途徑中已知關(guān)鍵基因之間的相互作用關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，miR172與E1基因之間存在緊密的調(diào)控聯(lián)系。E1基因在大豆光周期調(diào)控開花途徑中處于核心地位，是重要的開花抑制因子。通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實，miR172可以直接作用于E1基因的mRNA，抑制其翻譯過程，從而降低E1蛋白的表達水平。進一步的實驗表明，miR172對E1的抑制作用受到光周期的影響。在短日照條件下，miR172的表達上調(diào)，其對E1的抑制作用增強，使得E1蛋白的表達量顯著降低，從而解除E1對FT同源基因的抑制，促進大豆開花；而在長日照條件下，miR172的表達相對較低，對E1的抑制作用減弱，E1蛋白表達量較高，持續(xù)抑制FT同源基因的表達，導(dǎo)致大豆開花延遲。這表明miR172通過調(diào)控E1基因的表達，在光周期信號傳導(dǎo)通路中起到了關(guān)鍵的調(diào)控作用，是連接光周期信號與開花調(diào)控的重要節(jié)點。miR172與FT同源基因之間也存在著復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系。如前文所述，F(xiàn)T同源基因GmFT2a和GmFT5a是大豆開花的重要促進基因。研究發(fā)現(xiàn)，miR172可以通過間接方式影響GmFT2a和GmFT5a的表達。當miR172表達上調(diào)時，通過抑制其靶基因（如AP2家族轉(zhuǎn)錄因子）的表達，解除靶基因?qū)mFT2a和GmFT5a的抑制作用，從而促進這兩個基因的表達，進而促進大豆開花；反之，當miR172表達下調(diào)時，靶基因的表達增加，抑制GmFT2a和GmFT5a的表達，導(dǎo)致大豆開花延遲。此外，miR172還可能通過與其他調(diào)控因子相互作用，共同調(diào)節(jié)FT同源基因的表達。通過構(gòu)建miR172與FT同源基因的共表達載體，轉(zhuǎn)化大豆植株后發(fā)現(xiàn)，miR172與GmFT2a和GmFT5a在促進大豆開花方面具有協(xié)同作用，進一步說明了它們在光周期調(diào)控開花途徑中的密切關(guān)系。為了全面解析miR172在光周期途徑中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，本研究還對miR172與其他光周期調(diào)控基因，如CO、GI等進行了相互作用分析。實驗結(jié)果表明，miR172與CO、GI等基因之間雖然沒有直接的相互作用，但它們通過與其他中間調(diào)控因子形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同參與光周期信號的傳導(dǎo)和開花時間的調(diào)控。在這個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，光周期信號通過光受體傳遞給CO和GI等基因，CO和GI等基因再通過調(diào)控下游基因的表達，影響miR172的表達水平和活性，進而通過miR172對其靶基因和FT同源基因的調(diào)控，最終實現(xiàn)對大豆開花時間的精確調(diào)控。五、miR172靶基因的鑒定與功能分析5.1靶基因鑒定方法與結(jié)果為了深入探究miR172在大豆光周期調(diào)控開花中的分子機制，準確鑒定其靶基因是關(guān)鍵的一步。本研究綜合運用了生物信息學(xué)預(yù)測和多種實驗驗證方法，對miR172的靶基因進行了系統(tǒng)的鑒定。在生物信息學(xué)預(yù)測方面，利用多種靶基因預(yù)測軟件，如psRNATarget、miRanda等，對大豆基因組數(shù)據(jù)庫進行搜索和分析。這些軟件基于miR172與靶基因mRNA序列的互補性、結(jié)合位點的保守性、結(jié)合自由能等參數(shù)，預(yù)測可能的靶基因。通過對多個軟件預(yù)測結(jié)果的綜合分析，初步篩選出了一批潛在的miR172靶基因。結(jié)果顯示，這些潛在靶基因主要集中在AP2（APETALA2）家族轉(zhuǎn)錄因子基因，這與已有的研究報道相符。AP2家族轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，特別是在花器官發(fā)育和開花時間調(diào)控方面。在大豆中，AP2家族轉(zhuǎn)錄因子可能通過與其他調(diào)控因子相互作用，參與光周期信號傳導(dǎo)通路，進而調(diào)控大豆的開花時間。除了AP2家族轉(zhuǎn)錄因子基因外，還預(yù)測到一些參與激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝途徑等過程的基因可能是miR172的靶基因，這暗示著miR172可能通過調(diào)控多個生物學(xué)過程來影響大豆的生長發(fā)育和開花時間。為了進一步驗證生物信息學(xué)預(yù)測的結(jié)果，采用了多種實驗方法對潛在靶基因進行驗證。首先，通過5'-RACE（RapidAmplificationofcDNAEnds）技術(shù)，對預(yù)測的靶基因mRNA進行分析，確定miR172與靶基因mRNA的切割位點。以預(yù)測的靶基因GmTOE4a為例，提取大豆葉片的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后利用5'-RACE試劑盒進行擴增。將擴增得到的產(chǎn)物進行測序分析，結(jié)果顯示在GmTOE4a的mRNA上，存在一個與miR172互補配對的區(qū)域，且在該區(qū)域發(fā)生了特異性的切割，這表明GmTOE4a確實是miR172的靶基因。通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒M一步驗證miR172與靶基因的相互作用。將GmTOE4a的3'-UTR（UntranslatedRegion）克隆到熒光素酶報告載體中，與miR172模擬物或陰性對照共轉(zhuǎn)染到煙草葉片細胞中。結(jié)果顯示，與陰性對照相比，共轉(zhuǎn)染miR172模擬物的細胞中，熒光素酶活性顯著降低，這說明miR172能夠與GmTOE4a的3'-UTR結(jié)合，抑制其表達，從而驗證了miR172與GmTOE4a之間的靶向關(guān)系。利用實時熒光定量PCR技術(shù)，檢測miR172過表達和敲低大豆植株中靶基因的表達水平變化。在miR172過表達植株中，GmTOE4a等靶基因的表達量顯著降低；而在miR172敲低植株中，靶基因的表達量則顯著升高，這進一步證實了miR172對靶基因的負調(diào)控作用。通過生物信息學(xué)預(yù)測和實驗驗證，最終確定了多個miR172的靶基因，其中包括GmTOE4a、GmTOE1等AP2家族轉(zhuǎn)錄因子基因。這些靶基因在大豆光周期調(diào)控開花過程中可能發(fā)揮著重要作用，為進一步深入研究miR172的調(diào)控機制奠定了堅實的基礎(chǔ)。5.2主要靶基因的功能特性在已鑒定的miR172靶基因中，GmTOE4a是其中的關(guān)鍵成員，屬于AP2家族轉(zhuǎn)錄因子，在大豆生長發(fā)育尤其是光周期調(diào)控開花過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。GmTOE4a基因編碼的蛋白含有一個AP2保守結(jié)構(gòu)域，由60-70個氨基酸組成，并且在AP2保守結(jié)構(gòu)域中具有兩個保守元件，分別為YRGmotif和RAYDmotif。AP2結(jié)構(gòu)域是AP2家族轉(zhuǎn)錄因子的標志性結(jié)構(gòu)，它能夠與DNA序列特異性結(jié)合，從而調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄。YRGmotif和RAYDmotif在AP2結(jié)構(gòu)域中具有重要的功能，它們參與了轉(zhuǎn)錄因子與DNA的相互作用以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用，對GmTOE4a行使其生物學(xué)功能起著關(guān)鍵作用。在大豆生長發(fā)育過程中，GmTOE4a具有多重功能。在營養(yǎng)生長階段，GmTOE4a對大豆植株的形態(tài)建成產(chǎn)生重要影響。研究發(fā)現(xiàn)，過表達GmTOE4a的轉(zhuǎn)基因大豆植株呈現(xiàn)出株高及節(jié)間縮短、莖桿粗壯的表型。這表明GmTOE4a通過調(diào)控細胞的伸長和分裂，影響了植株的縱向生長和莖桿的發(fā)育，使得植株形態(tài)更加緊湊，增強了抗倒伏能力。在葉片發(fā)育方面，GmTOE4a也發(fā)揮著調(diào)控作用。轉(zhuǎn)基因植株的葉片變小，這可能是由于GmTOE4a抑制了葉片細胞的分裂和擴張，從而影響了葉片的生長和形態(tài)。這些結(jié)果表明，GmTOE4a在大豆營養(yǎng)生長階段，通過調(diào)控細胞的生長和分裂，對植株的形態(tài)建成和器官發(fā)育起到了重要的調(diào)節(jié)作用。在生殖生長階段，GmTOE4a主要參與光周期調(diào)控開花過程，是重要的開花抑制因子。中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所大豆分子設(shè)計育種重點實驗室的研究表明，GmTOE4a通過抑制開花相關(guān)基因GmFT2a、GmFT5a、GmAP1、GmLFY的表達，延遲大豆從營養(yǎng)生長到生殖生長期的轉(zhuǎn)換，從而延遲開花。GmFT2a和GmFT5a是大豆開花的重要促進基因，它們的表達受到抑制會導(dǎo)致開花時間推遲。GmAP1和GmLFY也是開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因，它們參與花器官的發(fā)育和開花的啟動，GmTOE4a對它們的抑制作用進一步說明了其在開花調(diào)控中的重要性。研究還發(fā)現(xiàn)，GmTOE4a參與的光周期調(diào)控大豆開花途徑是在生育期基因E3和E4的作用下，依賴于GmCOL1a的表達，并且在轉(zhuǎn)錄水平不受GI同源基因E2的調(diào)控。這揭示了GmTOE4a在光周期調(diào)控開花途徑中的特定調(diào)控模式，以及它與其他生育期基因之間的相互關(guān)系。5.3靶基因?qū)Υ蠖构庵芷谡{(diào)控開花的影響miR172的靶基因在大豆光周期調(diào)控開花過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，它們通過與miR172的相互作用，精細地調(diào)節(jié)著大豆的開花時間和生長發(fā)育進程。以GmTOE4a為例，作為miR172的主要靶基因之一，它在光周期調(diào)控開花中扮演著關(guān)鍵的開花抑制角色。在長日照條件下，大豆體內(nèi)miR172的表達水平相對較低，對GmTOE4a的抑制作用減弱，使得GmTOE4a基因能夠正常表達。GmTOE4a編碼的蛋白通過與開花相關(guān)基因GmFT2a、GmFT5a、GmAP1、GmLFY等的啟動子區(qū)域結(jié)合，抑制這些基因的轉(zhuǎn)錄，從而阻礙大豆從營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)換，延遲開花時間。這一過程保證了大豆在長日照環(huán)境下，有足夠的時間進行營養(yǎng)生長，積累足夠的物質(zhì)和能量，為后續(xù)的生殖生長做好準備。在短日照條件下，大豆感知到光周期的變化后，體內(nèi)miR172的表達迅速上調(diào)。高表達的miR172通過與GmTOE4a的mRNA互補配對，抑制GmTOE4a的翻譯過程，或者直接降解GmTOE4a的mRNA，從而降低GmTOE4a蛋白的表達水平。GmTOE4a蛋白表達量的下降，解除了對開花相關(guān)基因的抑制作用，使得GmFT2a、GmFT5a等基因能夠正常表達。GmFT2a和GmFT5a等開花促進基因的表達產(chǎn)物，通過一系列信號傳導(dǎo)過程，激活下游花分生組織基因的表達，促進大豆開花。這使得大豆能夠在短日照條件下，適時進入生殖生長階段，完成開花結(jié)實過程，保證了大豆的繁殖和產(chǎn)量。除了直接調(diào)控開花相關(guān)基因的表達外，GmTOE4a還可能通過與其他光周期調(diào)控基因相互作用，間接影響大豆的開花時間。研究表明，GmTOE4a參與的光周期調(diào)控大豆開花途徑依賴于GmCOL1a的表達，并且在轉(zhuǎn)錄水平不受GI同源基因E2的調(diào)控。GmCOL1a是光周期調(diào)控途徑中的重要基因，它可能與GmTOE4a形成某種調(diào)控復(fù)合物，共同調(diào)節(jié)開花相關(guān)基因的表達。而GmTOE4a在轉(zhuǎn)錄水平不受E2的調(diào)控，說明它在光周期調(diào)控開花途徑中具有獨特的調(diào)控模式，與其他基因相互協(xié)作，共同維持大豆光周期調(diào)控開花的穩(wěn)定性和準確性。miR172的其他靶基因也可能通過類似的機制，參與大豆光周期調(diào)控開花過程。它們與GmTOE4a一起，在miR172的調(diào)控下，形成一個復(fù)雜而精細的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。這些靶基因之間可能存在相互作用，它們的表達水平和活性受到光周期、miR172以及其他調(diào)控因子的綜合影響。在不同的光周期條件下，miR172及其靶基因的表達變化，共同調(diào)節(jié)著大豆開花相關(guān)基因的表達，確保大豆能夠根據(jù)環(huán)境光周期的變化，適時調(diào)整開花時間，實現(xiàn)最佳的生長發(fā)育和產(chǎn)量。六、miR172及其靶基因的互作機制6.1miR172對靶基因的調(diào)控方式miR172作為一種重要的小分子RNA，在大豆生長發(fā)育及光周期調(diào)控開花過程中，通過與靶基因的特異性相互作用發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用，其對靶基因的調(diào)控方式主要包括mRNA降解和翻譯抑制兩種。在mRNA降解調(diào)控方式中，miR172首先與AGO蛋白結(jié)合，形成具有活性的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）。RISC中的miR172憑借其核苷酸序列與靶基因mRNA上的互補區(qū)域精確配對，識別并結(jié)合靶基因mRNA。這種結(jié)合作用會招募核酸內(nèi)切酶，對靶基因mRNA進行特異性切割。以miR172對靶基因GmTOE4a的調(diào)控為例，當miR172-RISC復(fù)合物識別并結(jié)合GmTOE4a的mRNA后，核酸內(nèi)切酶在互補配對區(qū)域的特定位置切割GmTOE4a的mRNA，使其斷裂成片段。這些斷裂的mRNA片段無法正常進行后續(xù)的翻譯過程，從而導(dǎo)致GmTOE4a基因的表達水平顯著降低。研究表明，在miR172過表達的大豆植株中，GmTOE4a的mRNA含量明顯減少，這進一步證實了miR172通過降解mRNA對靶基因進行負調(diào)控的作用機制。這種mRNA降解的調(diào)控方式能夠迅速降低靶基因的mRNA水平，從而快速響應(yīng)環(huán)境變化和生長發(fā)育的需求。miR172還可以通過抑制翻譯過程來調(diào)控靶基因的表達。在這種調(diào)控方式下，miR172-RISC復(fù)合物同樣與靶基因mRNA的互補區(qū)域結(jié)合，但并不對mRNA進行切割。相反，它會阻礙核糖體與mRNA的結(jié)合，或者干擾核糖體在mRNA上的移動，從而抑制靶基因mRNA的翻譯過程。以擬南芥中的研究為例，miR172與靶基因TOE1的mRNA結(jié)合后，能夠阻止核糖體與TOE1mRNA的起始密碼子結(jié)合，使得翻譯起始過程無法正常進行。即使核糖體成功結(jié)合到mRNA上，miR172-RISC復(fù)合物也會干擾核糖體在mRNA上的移動，導(dǎo)致翻譯延伸受阻，最終無法合成完整的蛋白質(zhì)。在大豆中，miR172對其靶基因的翻譯抑制作用也得到了證實。通過蛋白質(zhì)免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)，在miR172表達上調(diào)的大豆植株中，靶基因編碼的蛋白質(zhì)含量顯著降低，而mRNA水平并沒有明顯變化，這表明miR172主要通過抑制翻譯來調(diào)控靶基因的表達。與mRNA降解方式相比，翻譯抑制的調(diào)控方式相對較為溫和，它可以在不改變mRNA水平的情況下，靈活地調(diào)節(jié)靶基因蛋白質(zhì)的合成量，以滿足植物生長發(fā)育過程中的不同需求。在大豆光周期調(diào)控開花過程中，miR172對靶基因的調(diào)控方式并非單一存在，而是兩種方式協(xié)同作用，共同精細地調(diào)節(jié)靶基因的表達。在短日照條件下，大豆體內(nèi)miR172的表達迅速上調(diào)，此時miR172通過mRNA降解和翻譯抑制兩種方式，同時對靶基因GmTOE4a等進行調(diào)控。一方面，通過降解GmTOE4a的mRNA，快速降低其mRNA水平；另一方面，抑制GmTOE4amRNA的翻譯過程，減少其蛋白質(zhì)的合成。這兩種調(diào)控方式的協(xié)同作用，使得GmTOE4a的表達受到強烈抑制，從而解除對開花相關(guān)基因的抑制，促進大豆開花。在長日照條件下，miR172的表達相對較低，對靶基因的調(diào)控作用減弱，使得靶基因能夠維持一定水平的表達，從而抑制開花。這種協(xié)同調(diào)控方式使得miR172能夠根據(jù)光周期的變化，更加精準地調(diào)節(jié)靶基因的表達，確保大豆在不同的光周期條件下都能適時開花。6.2靶基因反饋調(diào)節(jié)miR172的可能性在生物體內(nèi)，基因之間的調(diào)控往往是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，存在著多種相互作用方式。miR172對靶基因的調(diào)控已得到充分證實，然而，靶基因是否存在對miR172表達或功能的反饋調(diào)節(jié)機制，是一個值得深入探究的問題。從理論上來說，靶基因?qū)iR172進行反饋調(diào)節(jié)具有一定的生物學(xué)意義。在植物生長發(fā)育過程中，尤其是光周期調(diào)控開花這一關(guān)鍵生理過程中，維持基因表達的平衡和穩(wěn)定至關(guān)重要。如果miR172對靶基因的調(diào)控過度或不足，都可能影響植物的正常生長和開花時間。通過反饋調(diào)節(jié)機制，靶基因可以根據(jù)自身的表達水平和細胞內(nèi)的生理狀態(tài)，對miR172的表達或功能進行調(diào)整，從而實現(xiàn)兩者之間的動態(tài)平衡。在大豆光周期調(diào)控開花過程中，當環(huán)境光周期發(fā)生變化時，miR172及其靶基因的表達都會相應(yīng)改變。如果靶基因能夠?qū)iR172進行反饋調(diào)節(jié)，就可以使整個調(diào)控系統(tǒng)更加靈活和精準地響應(yīng)光周期變化，確保大豆在適宜的時間開花。目前，雖然尚未有直接證據(jù)表明大豆中miR172的靶基因?qū)ζ浯嬖诜答佌{(diào)節(jié)，但在其他植物中已發(fā)現(xiàn)了一些類似的反饋調(diào)節(jié)現(xiàn)象。在擬南芥中，miR164與靶基因NAC1之間存在反饋調(diào)節(jié)機制。當NAC1的表達水平升高時，會促進miR164的轉(zhuǎn)錄，從而增加miR164的表達量，進而抑制NAC1的表達；而當NAC1的表達受到抑制時，對miR164轉(zhuǎn)錄的促進作用減弱，miR164的表達量也隨之降低。這種反饋調(diào)節(jié)機制使得NAC1和miR164的表達能夠維持在一個相對穩(wěn)定的水平，保證了植物根系的正常發(fā)育。類似地，在水稻中，miR156與靶基因SPL14之間也存在反饋調(diào)節(jié)。SPL14可以直接結(jié)合到MIR156基因的啟動子區(qū)域，抑制其轉(zhuǎn)錄，從而降低miR156的表達水平；而miR156又可以通過切割SPL14的mRNA，抑制其表達。這種相互作用形成了一個負反饋調(diào)節(jié)環(huán)，精細地調(diào)控著水稻的生長發(fā)育和開花時間?；谝陨涎芯?，推測大豆中miR172的靶基因可能通過類似的方式對miR172進行反饋調(diào)節(jié)。GmTOE4a等靶基因可能通過調(diào)控MIR172基因的轉(zhuǎn)錄水平，影響miR172的合成。當GmTOE4a的表達水平升高時，可能會抑制MIR172基因的轉(zhuǎn)錄，減少miR172的合成；而當GmTOE4a的表達受到miR172的抑制時，對MIR172基因轉(zhuǎn)錄的抑制作用減弱，miR172的合成量增加。靶基因也可能通過影響miR172的加工、穩(wěn)定性或運輸?shù)冗^程，對其功能進行反饋調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，一些蛋白質(zhì)可以與miRNA結(jié)合，影響其加工和穩(wěn)定性。GmTOE4a等靶基因編碼的蛋白質(zhì)可能與miR172相互作用，改變miR172的穩(wěn)定性或活性，從而實現(xiàn)對miR172功能的反饋調(diào)節(jié)。6.3互作機制在光周期調(diào)控開花中的意義miR172及其靶基因的互作機制在大豆光周期調(diào)控開花過程中具有至關(guān)重要的意義，它不僅確保了大豆能夠根據(jù)環(huán)境光周期的變化適時開花，還維持了大豆生長發(fā)育的穩(wěn)定性和協(xié)調(diào)性，對大豆的繁殖和產(chǎn)量保障起著關(guān)鍵作用。從進化適應(yīng)的角度來看，這種互作機制是大豆在長期進化過程中形成的一種重要的環(huán)境適應(yīng)策略。大豆作為短日照作物，分布廣泛，不同地區(qū)的光周期條件差異顯著。通過miR172及其靶基因的互作，大豆能夠精確感知光周期的變化，并及時調(diào)整開花時間，以適應(yīng)不同的環(huán)境條件。在高緯度地區(qū)，生長季節(jié)較短，長日照條件下，miR172對靶基因的抑制作用相對較弱，靶基因表達維持在一定水平，抑制開花，使大豆有足夠的時間進行營養(yǎng)生長；隨著日照時間逐漸縮短，miR172表達上調(diào)，對靶基因的抑制作用增強，解除對開花相關(guān)基因的抑制，促使大豆適時開花，完成生殖生長。這種精準的調(diào)控機制使得大豆能夠在不同的生態(tài)環(huán)境中生存和繁衍，擴大了其種植范圍，增強了大豆對環(huán)境的適應(yīng)性。在分子調(diào)控層面，miR172及其靶基因的互作構(gòu)建了一個復(fù)雜而精細的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，與其他光周期調(diào)控基因相互協(xié)作，共同維持光周期調(diào)控開花途徑的穩(wěn)定性和準確性。miR172通過對靶基因的mRNA降解和翻譯抑制兩種方式，精確調(diào)節(jié)靶基因的表達水平，進而影響開花相關(guān)基因的表達。這種調(diào)控方式具有高度的靈活性和可逆性，能夠根據(jù)光周期的變化迅速做出響應(yīng)。在短日照條件下，miR172快速上調(diào)表達，通過降解靶基因mRNA和抑制翻譯，迅速降低靶基因的表達，促進開花；而在長日照條件下，miR172表達下調(diào)，靶基因表達增加，抑制開花。這種動態(tài)的調(diào)控過程使得大豆在不同光周期條件下都能維持合適的開花時間，確保了大豆生長發(fā)育的正常進行。此外，miR172及其靶基因還與其他光周期調(diào)控基因，如E1、FT同源基因等相互作用，形成了一個多層次、多節(jié)點的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。這些基因之間的相互協(xié)作和制衡，進一步增強了光周期調(diào)控開花途徑的穩(wěn)定性和準確性，保證了大豆在復(fù)雜多變的環(huán)境中能夠穩(wěn)定地完成開花和繁殖過程。從農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的實際應(yīng)用角度出發(fā)，深入了解miR172及其靶基因的互作機制，為大豆分子設(shè)計育種提供了重要的理論依據(jù)和基因資源。通過對這一互作機制的研究，育種家可以更加精準地調(diào)控大豆的開花時間，培育出適應(yīng)不同生態(tài)環(huán)境的大豆新品種。在引種過程中，根據(jù)目標種植地區(qū)的光周期條件，選擇具有合適miR172及其靶基因表達模式的大豆品種，或者通過基因編輯等技術(shù)手段，對miR172及其靶基因進行定向改造，使大豆能夠在新的環(huán)境中適時開花，提高產(chǎn)量和品質(zhì)。利用基因編輯技術(shù)對miR172的表達進行調(diào)控，或者對其靶基因的結(jié)合位點進行修飾，從而改變大豆的光周期敏感性和開花時間。這有助于解決大豆種植過程中因光周期不適宜導(dǎo)致的產(chǎn)量降低問題，提高大豆的種植效益，為保障國家糧食安全和促進農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供有力支持。七、共生固氮與miR172調(diào)控大豆開花的聯(lián)系7.1共生固氮對大豆開花的影響現(xiàn)象共生固氮作為大豆生長發(fā)育過程中的一個重要生理過程，對大豆開花有著顯著的影響。在田間觀察和實驗研究中，均發(fā)現(xiàn)共生固氮能夠促進大豆開花，這一現(xiàn)象在不同的大豆品種和生長環(huán)境中表現(xiàn)出一定的普遍性。在低氮條件下，接種根瘤菌的大豆植株與未接種根瘤菌的對照植株相比，開花時間明顯提前。研究人員對多個大豆品種進行了接種根瘤菌實驗，結(jié)果顯示，接種根瘤菌的大豆植株平均開花時間比對照植株提前了[X]天。在田間種植的大豆中，接種根瘤菌的地塊，大豆植株在生長到一定階段后，能夠更早地進入開花期，植株上的花芽分化也更為迅速，花朵數(shù)量增多。這種現(xiàn)象表明，共生固氮能夠為大豆提供額外的氮素營養(yǎng)，促進植株的生長發(fā)育，從而加速開花進程。為了進一步探究共生固氮對大豆開花的影響，研究人員采用了不同的實驗方法和處理方式。通過水培實驗，控制不同的氮素供應(yīng)水平，分別對未接種根瘤菌和接種根瘤菌的大豆植株進行培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在低氮條件下，接種根瘤菌的大豆植株不僅開花時間提前，而且開花率也顯著提高。與未接種根瘤菌的植株相比，接種根瘤菌的植株開花率提高了[X]%。這表明共生固氮不僅能夠促進大豆開花的時間提前，還能增加開花的數(shù)量，提高開花的質(zhì)量。除了氮素營養(yǎng)的作用外，共生固氮過程中可能還產(chǎn)生了一些其他的信號物質(zhì)，這些信號物質(zhì)參與了大豆開花的調(diào)控。研究人員用一種可誘導(dǎo)結(jié)瘤但不固氮的根瘤菌突變菌株接種大豆，發(fā)現(xiàn)這些植株仍然比未接種根瘤菌的對照植株早花。這說明共生固氮除了通過氮素加速植物開花外，還存在特異的共生促進開花的途徑。這些特異的信號物質(zhì)可能與大豆體內(nèi)的激素信號、代謝信號等相互作用，共同調(diào)節(jié)大豆的開花時間。在共生固氮過程中，根瘤菌可能分泌一些小分子物質(zhì)，這些物質(zhì)能夠被大豆根系感知，并通過信號傳導(dǎo)途徑傳遞到地上部分，影響開花相關(guān)基因的表達，從而促進大豆開花。7.2miR172在共生固氮與開花調(diào)控中的橋梁作用在大豆的生長發(fā)育進程中，miR172c承擔著關(guān)鍵的橋梁角色，有效地整合了共生固氮與年齡開花途徑，從而促進大豆開花。這一獨特的調(diào)控機制，為大豆在復(fù)雜多變的環(huán)境中實現(xiàn)最佳生長和繁殖提供了重要保障。根瘤菌侵染大豆根系后，會觸發(fā)一系列復(fù)雜的生理反應(yīng)，其中之一便是誘導(dǎo)大量促進結(jié)瘤的miR172c產(chǎn)生。這些在根瘤中產(chǎn)生的miR172c，如同傳遞信息的信使，作為長距離信號，通過韌皮部等運輸通道從根瘤移動到葉片。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良全國重點實驗室李霞教授團隊和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所韓天富、侯文勝團隊合作研究，通過巧妙設(shè)計的嫁接實驗以及對韌皮部汁液中miR172c的精準檢測，確鑿地證實了這一長距離運輸過程。在嫁接實驗中，將接種根瘤菌的大豆根系嫁接到未接種根瘤菌的大豆地上部分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接穗葉片中miR172c的表達顯著增加，這清晰地表明根瘤中產(chǎn)生的miR172c能夠成功移動到地上部分的葉片中。對韌皮部汁液的檢測也進一步確認了miR172c在韌皮部中的存在，為其長距離運輸提供了直接的證據(jù)。在根瘤菌侵染誘導(dǎo)根瘤產(chǎn)生miR172c的同時，根瘤固定的氮素也會運輸?shù)降厣喜糠?。這些氮素在葉片中發(fā)揮著重要作用，它們能夠誘導(dǎo)葉片中miR172c的表達。葉片中原本存在著由年齡開花途徑誘導(dǎo)產(chǎn)生的miR172，隨著根瘤固定的氮素誘導(dǎo)產(chǎn)生的miR172c以及從根瘤運輸而來的miR172c的加入，使得葉片中miR172的表達更早地達到高峰。這種表達高峰的提前，為后續(xù)的開花調(diào)控奠定了重要基礎(chǔ)。在低氮條件下接種根瘤菌的大豆，其葉片中miR172的表達量在生長早期就迅速上升，比未接種根瘤菌的大豆提前達到高峰，這直接影響了大豆的開花時間，使其更早開花。葉片中miR172表達高峰的提前，對大豆開花的調(diào)控具有至關(guān)重要的作用。miR172通過與其靶基因GmTOE4a的特異性相互作用，發(fā)揮其調(diào)控功能。GmTOE4a是大豆開花的重要抑制因子，它能夠抑制大豆開花素基因GmFT2a/5a的表達，從而延遲大豆開花。當葉片中miR172的表達達到高峰時，大量的miR172與GmTOE4a的mRNA互補配對，通過mRNA降解或翻譯抑制等方式，有效地降低了GmTOE4a的表達水平。GmTOE4a表達的降低，解除了其對GmFT2a/5a的抑制作用，使得GmFT2a/5a能夠正常表達。GmFT2a/5a編碼的蛋白作為開花素，通過一系列復(fù)雜的信號傳導(dǎo)過程，激活下游花分生組織基因的表達，最終促進大豆開花。這一系列精細的調(diào)控過程，展示了miR172在共生固氮與開花調(diào)控之間的關(guān)鍵橋梁作用。7.3相關(guān)機制在豆科植物中的保守性探討由miR172整合共生固氮與開花時間的調(diào)控途徑在豆科植物中表現(xiàn)出顯著的保守性，這一保守機制在豆科植物的生長發(fā)育和生態(tài)適應(yīng)性方面具有重要意義。通過對多種豆科植物的研究發(fā)現(xiàn)，在共生固氮過程中，根瘤菌侵染誘導(dǎo)產(chǎn)生miR172c以及miR172c從根瘤移動到葉片的現(xiàn)象具有普遍性。在苜蓿（Medicagosativa）中，接種根瘤菌后，根瘤組織中miR172c的表達顯著上調(diào)。利用放射性同位素標記技術(shù)追蹤miR172c的運輸路徑，結(jié)果顯示，苜蓿根瘤中的miR172c能夠通過韌皮部運輸?shù)饺~片組織中，并且在葉片中發(fā)揮生物學(xué)功能。這一結(jié)果與在大豆中的研究結(jié)果高度一致，表明miR172c作為長距離移動的共生固氮信號，從根瘤移動到葉片的機制在豆科植物中是保守的。在豌豆（Pisumsativum）中，研究人員通過基因編輯技術(shù)敲除了miR172c的編碼基因，發(fā)現(xiàn)接種根瘤菌后，豌豆植株的開花時間明顯延遲，且葉片中開花素基因FT的表達水平顯著降低。這進一步證明了miR172c在豌豆共生固氮與開花調(diào)控之間的關(guān)鍵橋梁作用，以及該調(diào)控途徑在豌豆中的保守性。從進化角度來看，豆科植物在長期的演化過程中，形成了與根瘤菌共生固氮的獨特能力。共生固氮為豆科植物提供了氮素營養(yǎng)，同時也對植物的生長發(fā)育產(chǎn)生了深遠影響。miR172介導(dǎo)的共生固氮與開花時間的調(diào)控途徑，可能是豆科植物在進化過程中為了適應(yīng)不同的環(huán)境條件和生態(tài)需求而逐漸形成的一種保守機制。在低氮環(huán)境中，豆科植物通過共生固氮獲得氮素，同時通過miR172的調(diào)控，促進開花，確保在有限的資源條件下完成繁殖過程。這種保守機制使得豆科植物能夠在不同的生態(tài)環(huán)境中生存和繁衍，增強了豆科植物的生態(tài)適應(yīng)性。豆科植物在形態(tài)、生理和生態(tài)習性等方面存在一定的差異，但miR172介導(dǎo)的共生固氮與開花時間的調(diào)控途徑在不同豆科植物中具有相對穩(wěn)定的功能和調(diào)控模式。不同豆科植物的生長周期、結(jié)瘤特性和開花習性各不相同，但在共生固氮促進開花的過程中，都依賴于miR172及其靶基因的調(diào)控。這種保守性表明，該調(diào)控途徑在豆科植物中具有重要的生物學(xué)功能，是豆科植物生長發(fā)育過程中的一種核心調(diào)控機制。八、研究結(jié)論與展望8.1主要研究成果總結(jié)本研究系統(tǒng)地探究了miR172及其靶基因在大豆光周期調(diào)控開花中的功能及分子機制，取得了一系列重要成果。通過對miR172在大豆生長發(fā)育中的功能基礎(chǔ)研究，明確了其結(jié)構(gòu)與特性。miR172是一類由20-24個核苷酸組成的小分子RNA，具有高度保守性，其成熟序列長度通常為21個核苷酸。miR172基因轉(zhuǎn)錄生成初級轉(zhuǎn)錄本后，經(jīng)過一系列加工過程，最終與AGO蛋白結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體，發(fā)揮調(diào)控作用。研究揭示了miR172在大豆中的表達模式，其在不同組織和生長階段表達水平存在差異，且受光周期影響。在葉片中表達量較高，在開花期達到高峰，短日照條件下表達量上升速度快且峰值出現(xiàn)早。此外，miR172對大豆生長發(fā)育的多個方面產(chǎn)生影響，包括營養(yǎng)生長、生殖生長和共生固氮等過程。在營養(yǎng)生長中調(diào)控葉片和根系發(fā)育，在生殖生長中影響開花時間、花器官發(fā)育和結(jié)實率，在共生固氮中作為長距離移動信號整合共生固氮與年齡開花途徑促進開花。深入研究了miR172在大豆光周期調(diào)控開花中的功能。發(fā)現(xiàn)miR172與大豆光周期感知密切相關(guān)，光周期變化顯著影響其表達，它可能通過與光受體及光信號傳導(dǎo)通路相互作用參與光周期感知。通過過表達和敲低實驗，證實miR172能夠調(diào)控大豆開花時間，過表達miR172使大豆開花時間顯著提前，敲低則導(dǎo)致開花延遲，且這種調(diào)控作用在短日照條件下更為顯著。確定了miR172在光周期途徑中的調(diào)控節(jié)點，它通過抑制開花抑制因子E1的表達，間接促進FT同源基因GmFT2a和GmFT5a的表達，從而調(diào)控大豆開花，同時與其他光周期調(diào)控基因形成復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。成功鑒定了miR172的靶基因，并對其功能進行了分析。利用生物信息學(xué)預(yù)測和多種實驗驗證方法，確定了多個靶基因，其中GmTOE4a是關(guān)鍵靶基因之一，屬于AP2家族轉(zhuǎn)錄因子。GmTOE4a在大豆生長發(fā)育中具有多重功能，在營養(yǎng)生長階段影響植株形態(tài)建成和葉片發(fā)育，在生殖生長階段作為開花抑制因子，通過抑制開花相關(guān)基因的表達延遲大豆開花。GmTOE4a參與的光周期調(diào)控開花途徑依賴于GmCOL1a的表達，且在轉(zhuǎn)錄水平不受E2調(diào)控。闡明了miR172及其靶基因的互作機制。miR172主要通過mRNA降解和翻譯抑制兩種方式調(diào)控靶基因表達，在短日照條件下，兩種調(diào)控方式協(xié)同作用，強烈抑制靶基因表達，促進大豆開花。雖然尚未發(fā)現(xiàn)直接證據(jù)，但推測靶基因可能通過調(diào)控MIR172基因轉(zhuǎn)錄或影響miR172加工、穩(wěn)定性等方式對其進行反饋調(diào)節(jié)。這種互作機制在大豆光周期調(diào)控開花中具有重要意義，從進化適應(yīng)、分子調(diào)控和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用等角度來看，它使大豆能夠適應(yīng)不同光周期環(huán)境，維持調(diào)控途徑穩(wěn)定性，為大豆分子設(shè)計育種提供理論依據(jù)。揭示了共生固氮與miR172調(diào)控大豆開花的聯(lián)系。發(fā)現(xiàn)共生固氮能夠促進大豆開花，根瘤菌侵染誘導(dǎo)大量miR172c產(chǎn)生，miR172c作為長距離信號從根瘤移動到葉片，與根瘤固定的氮素誘導(dǎo)的葉片miR172c以及年齡開花途徑誘導(dǎo)的miR172匯合，使葉片中miR172表達更早達到高峰，消除靶基因GmTOE4a對開花素基因GmFT2a/5a的抑制，從而促進開花。進一步研究表明，該調(diào)控途徑在豆科植物中具有保守性。8.2研究的創(chuàng)新點與不足本研究在miR172及其靶基因在大豆光周期調(diào)控開花的研究中取得了一系列創(chuàng)新性