miR-663：腎移植急性排斥反應(yīng)體外調(diào)控機(jī)制的深度剖析一、引言1.1研究背景終末期腎病（End-StageRenalDisease，ESRD）是各種慢性腎臟疾病發(fā)展的最終階段，嚴(yán)重威脅患者的生命健康和生活質(zhì)量。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球范圍內(nèi)ESRD的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，給社會(huì)和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，腎移植是治療ESRD最有效的方法之一，與長(zhǎng)期透析治療相比，腎移植能夠顯著提高患者的生活質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期，降低治療成本。隨著外科手術(shù)技術(shù)的不斷進(jìn)步、免疫抑制劑的合理應(yīng)用以及圍手術(shù)期管理水平的提高，腎移植的成功率和患者生存率有了明顯改善。然而，腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)（AcuteRejection，AR）仍然是影響移植腎存活和患者預(yù)后的主要障礙。AR是一種免疫介導(dǎo)的損傷過程，通常發(fā)生在移植術(shù)后1-3周內(nèi)。在AR過程中，受者的免疫系統(tǒng)將移植腎識(shí)別為外來異物，激活T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞，引發(fā)一系列免疫反應(yīng)，導(dǎo)致腎臟組織損傷、急性腎功能衰竭等癥狀。嚴(yán)重的排斥反應(yīng)可迅速導(dǎo)致移植腎失功，患者不得不重新回到透析治療或等待再次腎移植，這不僅增加了患者的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，還嚴(yán)重影響了患者的生存質(zhì)量和長(zhǎng)期生存率。傳統(tǒng)上，臨床主要依靠腎小球?yàn)V過率、血肌酐水平、彩色多普勒超聲等影像學(xué)檢查以及移植腎組織活檢來診斷AR。但這些指標(biāo)存在一定的局限性，腎小球?yàn)V過率和血肌酐水平的變化往往在腎臟已經(jīng)發(fā)生明顯損傷后才出現(xiàn)，缺乏早期診斷價(jià)值；彩色多普勒超聲等影像學(xué)檢查雖然能夠提供一些腎臟結(jié)構(gòu)和血流動(dòng)力學(xué)信息，但對(duì)于早期AR的診斷敏感性和特異性較低；移植腎組織活檢是診斷AR的金標(biāo)準(zhǔn)，然而它屬于有創(chuàng)檢查，存在出血、感染、腎周血腫等并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)，且不能頻繁進(jìn)行，難以滿足臨床動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的需求。此外，這些傳統(tǒng)診斷指標(biāo)的滯后性還導(dǎo)致治療時(shí)機(jī)的延誤，增加了治療難度和費(fèi)用，對(duì)患者預(yù)后產(chǎn)生較大負(fù)面影響。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，尋找新的無創(chuàng)或微創(chuàng)的早期診斷標(biāo)志物成為腎移植領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長(zhǎng)度約為21-24個(gè)核苷酸的非編碼小分子單鏈RNA，廣泛存在于生物體內(nèi)。miRNA在不同疾病中呈現(xiàn)差異表達(dá)，并且在血液、尿液等外周體液中理化性質(zhì)穩(wěn)定，易于檢測(cè)。越來越多的研究表明，miRNA參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、周期調(diào)控等多種生物學(xué)過程，在生物發(fā)育、病理生理過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在腎移植領(lǐng)域，miRNA被發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控移植腎AR，有望成為早期診斷移植腎AR的外周血標(biāo)志物。miR-663作為一種已知的微小RNA，其調(diào)節(jié)作用在多種生物學(xué)過程中被報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)，miR-663能夠調(diào)控炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等過程。炎癥和免疫異常在腎移植AR的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，因此推測(cè)miR-663可能在腎移植排斥反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。然而，目前關(guān)于miR-663在腎移植急性排斥反應(yīng)中的具體調(diào)控機(jī)制尚未完全明確。深入研究miR-663在腎移植急性排斥反應(yīng)中的調(diào)控作用，不僅有助于進(jìn)一步闡明AR的發(fā)病機(jī)制，還可能為腎移植排斥反應(yīng)的早期診斷和治療提供新的靶點(diǎn)和策略，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的本研究旨在通過體外實(shí)驗(yàn)，深入驗(yàn)證miR-663在腎移植急性排斥反應(yīng)中的調(diào)控作用，并進(jìn)一步探究其潛在的作用機(jī)制。具體而言，一是比較移植術(shù)后發(fā)生急性排斥反應(yīng)（AR）的患者及未發(fā)生AR患者血清中miR-663的表達(dá)水平，從臨床樣本角度驗(yàn)證miR-663在移植腎AR過程中是否起調(diào)控作用；二是在細(xì)胞水平上，通過構(gòu)建相關(guān)細(xì)胞模型，轉(zhuǎn)染miR-663慢病毒等實(shí)驗(yàn)操作，觀察細(xì)胞生物學(xué)行為的變化，檢測(cè)相關(guān)炎癥因子、免疫細(xì)胞的活性及信號(hào)通路的激活情況等，深入探討miR-663在腎移植AR過程中的調(diào)控機(jī)制。本研究期望為腎移植急性排斥反應(yīng)的早期診斷、病情監(jiān)測(cè)以及治療提供新的分子靶點(diǎn)和理論依據(jù)，為臨床治療提供新思路，最終提高腎移植患者的生存率和生活質(zhì)量。1.3研究意義本研究對(duì)深入理解腎移植急性排斥反應(yīng)發(fā)病機(jī)制和推動(dòng)臨床治療發(fā)展具有重要意義。在理論層面，目前腎移植急性排斥反應(yīng)的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，雖然已知免疫系統(tǒng)的激活和多種細(xì)胞因子、免疫細(xì)胞參與其中，但具體的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍存在諸多未知。miR-663作為一種在炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用的微小RNA，探究其在腎移植急性排斥反應(yīng)中的調(diào)控作用，有助于填補(bǔ)這一領(lǐng)域在分子機(jī)制研究方面的空白。通過明確miR-663與腎移植急性排斥反應(yīng)相關(guān)的炎癥因子、免疫細(xì)胞以及信號(hào)通路之間的相互作用關(guān)系，可以進(jìn)一步完善對(duì)腎移植急性排斥反應(yīng)發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為后續(xù)相關(guān)研究提供新的方向和理論基礎(chǔ)。在臨床應(yīng)用方面，當(dāng)前腎移植急性排斥反應(yīng)的早期診斷和治療面臨諸多挑戰(zhàn)。早期準(zhǔn)確診斷急性排斥反應(yīng)對(duì)于及時(shí)采取有效的治療措施、保護(hù)移植腎功能至關(guān)重要。然而傳統(tǒng)診斷指標(biāo)存在滯后性，難以滿足臨床早期診斷需求，新的無創(chuàng)或微創(chuàng)診斷方法在敏感性、特異性等方面又存在缺陷。若本研究證實(shí)miR-663可作為腎移植急性排斥反應(yīng)的特異性診斷指標(biāo)，將為臨床提供一種全新的、更具優(yōu)勢(shì)的早期診斷手段。這有助于醫(yī)生在急性排斥反應(yīng)發(fā)生的早期階段及時(shí)發(fā)現(xiàn)并干預(yù)，避免病情延誤，提高治療效果，降低治療成本。在治療策略上，以miR-663為靶點(diǎn)開發(fā)新的治療方法具有廣闊的前景。通過調(diào)節(jié)miR-663的表達(dá)水平，可以干預(yù)腎移植急性排斥反應(yīng)的進(jìn)程，為腎移植患者提供更有效的治療選擇。這不僅能夠提高移植腎的存活率和患者的生存率，還能顯著改善患者的生活質(zhì)量，減輕患者家庭和社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，具有重要的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。二、腎移植急性排斥反應(yīng)與miR-663概述2.1腎移植急性排斥反應(yīng)2.1.1定義與發(fā)病機(jī)制腎移植急性排斥反應(yīng)是腎移植術(shù)后常見的并發(fā)癥，通常指在腎移植手術(shù)后，受體的免疫系統(tǒng)對(duì)新移植的腎臟產(chǎn)生強(qiáng)烈免疫反應(yīng)，試圖攻擊和排斥外來物的過程。這一過程主要由細(xì)胞免疫和體液免疫介導(dǎo)。細(xì)胞免疫介導(dǎo)的急性排斥反應(yīng)中，T淋巴細(xì)胞起著核心作用。當(dāng)移植腎進(jìn)入受體體內(nèi)后，其攜帶的異體抗原被受體的抗原提呈細(xì)胞（Antigen-PresentingCells，APC）識(shí)別并攝取，APC將抗原加工處理后，以抗原肽-主要組織相容性復(fù)合體（MajorHistocompatibilityComplex，MHC）復(fù)合物的形式呈遞給T淋巴細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞被激活后，通過表面的T細(xì)胞受體（T-cellReceptor，TCR）識(shí)別抗原肽-MHC復(fù)合物，同時(shí)接受APC提供的共刺激信號(hào)，從而啟動(dòng)活化、增殖和分化過程?；罨腡淋巴細(xì)胞可分化為輔助性T細(xì)胞（HelperTcells，Th）和細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CytotoxicTcells，Tc）。Th細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）、干擾素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）等，這些細(xì)胞因子不僅可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞自身的增殖和分化，還能激活其他免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NaturalKillercells，NKcells）等，增強(qiáng)免疫反應(yīng)。Tc細(xì)胞則能夠直接識(shí)別并殺傷表達(dá)異體抗原的移植腎細(xì)胞，導(dǎo)致腎臟組織損傷。此外，T淋巴細(xì)胞還可通過分泌細(xì)胞毒性物質(zhì)，如穿孔素和顆粒酶，誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步加劇腎臟組織的破壞。在體液免疫介導(dǎo)的急性排斥反應(yīng)中，B淋巴細(xì)胞發(fā)揮關(guān)鍵作用。B淋巴細(xì)胞表面的抗原受體（B-cellReceptor，BCR）可直接識(shí)別移植腎表面的異體抗原，在Th細(xì)胞的輔助下，B淋巴細(xì)胞活化、增殖并分化為漿細(xì)胞。漿細(xì)胞產(chǎn)生針對(duì)移植腎抗原的特異性抗體，如抗供體特異性抗體（Donor-SpecificAntibodies，DSA）。這些抗體與移植腎血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的抗原結(jié)合，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，引發(fā)一系列免疫反應(yīng)。補(bǔ)體激活后產(chǎn)生的C3a、C5a等過敏毒素，可吸引中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞聚集到移植腎組織，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生；C5b-9膜攻擊復(fù)合物則可直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起血管壁的炎癥、壞死和血栓形成，導(dǎo)致移植腎缺血、缺氧，最終影響腎功能。此外，抗體還可通過抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（Antibody-DependentCell-MediatedCytotoxicity，ADCC），介導(dǎo)NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等對(duì)移植腎細(xì)胞的殺傷作用。2.1.2臨床診斷方法目前，腎移植急性排斥反應(yīng)的臨床診斷主要依靠多種方法的綜合判斷。傳統(tǒng)的診斷指標(biāo)包括血肌酐水平、腎小球?yàn)V過率、尿常規(guī)、血常規(guī)等。血肌酐是反映腎功能的常用指標(biāo)，在急性排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，由于腎臟組織受損，腎功能下降，血肌酐水平通常會(huì)迅速升高。然而，血肌酐水平的變化并非特異性地指示急性排斥反應(yīng)，其他因素如急性腎小管壞死、免疫抑制劑的腎毒性、感染等也可能導(dǎo)致血肌酐升高，因此其診斷特異性較低。腎小球?yàn)V過率能更準(zhǔn)確地反映腎功能，但檢測(cè)方法相對(duì)復(fù)雜，且同樣缺乏特異性。尿常規(guī)檢查可發(fā)現(xiàn)蛋白尿、血尿、白細(xì)胞尿等異常，但這些表現(xiàn)也可見于其他腎臟疾病，對(duì)急性排斥反應(yīng)的診斷價(jià)值有限。血常規(guī)檢查中，白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞比例等可能升高，但也不具有特異性。除實(shí)驗(yàn)室檢查外，影像學(xué)檢查如彩色多普勒超聲、CT、MRI等在腎移植急性排斥反應(yīng)的診斷中也有一定應(yīng)用。彩色多普勒超聲可觀察移植腎的大小、形態(tài)、結(jié)構(gòu)以及血流動(dòng)力學(xué)變化。急性排斥反應(yīng)時(shí)，移植腎常表現(xiàn)為體積增大，皮質(zhì)增厚，皮髓質(zhì)分界不清，腎內(nèi)血流阻力指數(shù)（ResistanceIndex，RI）升高等。然而，這些影像學(xué)改變并非急性排斥反應(yīng)所特有，急性腎小管壞死、腎積水等情況也可能出現(xiàn)類似表現(xiàn)，因此其診斷特異性和敏感性有待提高。CT和MRI檢查可以提供更詳細(xì)的腎臟解剖結(jié)構(gòu)信息，但對(duì)于急性排斥反應(yīng)的早期診斷價(jià)值也相對(duì)有限，且檢查費(fèi)用較高，操作相對(duì)復(fù)雜。移植腎組織活檢是診斷急性排斥反應(yīng)的金標(biāo)準(zhǔn)。通過活檢獲取腎臟組織，進(jìn)行病理學(xué)檢查，可直接觀察腎臟組織的病理變化，如間質(zhì)水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、腎小管炎、動(dòng)脈炎等，從而明確診斷。然而，活檢屬于有創(chuàng)檢查，存在出血、感染、腎周血腫、動(dòng)靜脈瘺等并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)，且由于穿刺組織的局限性，可能出現(xiàn)取樣誤差，導(dǎo)致假陰性結(jié)果。此外，活檢不能頻繁進(jìn)行，難以滿足臨床動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的需求。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一些新的無創(chuàng)或微創(chuàng)診斷方法逐漸受到關(guān)注。例如，檢測(cè)血液或尿液中的生物標(biāo)志物，如細(xì)胞因子、趨化因子、微小RNA等，有望為急性排斥反應(yīng)的早期診斷提供新的途徑。但目前這些生物標(biāo)志物大多仍處于研究階段，尚未廣泛應(yīng)用于臨床，其敏感性、特異性和準(zhǔn)確性仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。2.2miR-663簡(jiǎn)介2.2.1miRNA的基本特性微小RNA（miRNA）是一類內(nèi)源性的非編碼小分子單鏈RNA，長(zhǎng)度通常在21-24個(gè)核苷酸之間。其廣泛存在于從線蟲、植物到人類等多種生物體內(nèi)，且在進(jìn)化過程中具有高度的保守性。這種保守性暗示著miRNA在生物體內(nèi)發(fā)揮著至關(guān)重要且基礎(chǔ)的生物學(xué)功能。miRNA主要通過與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合來發(fā)揮調(diào)控作用。當(dāng)miRNA與靶mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UntranslatedRegion，3'-UTR）完全或部分互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，會(huì)抑制靶mRNA的翻譯過程，阻礙蛋白質(zhì)的合成；在某些情況下，如果miRNA與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)程度較高，也可能導(dǎo)致靶mRNA的降解。通過這種方式，miRNA能夠精細(xì)地調(diào)控基因表達(dá)，參與生物體的多種生理和病理過程。在生理過程中，miRNA參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及胚胎發(fā)育等多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在胚胎發(fā)育階段，特定的miRNA表達(dá)模式能夠調(diào)控細(xì)胞的分化方向，確保各個(gè)組織和器官的正常形成和發(fā)育。在細(xì)胞增殖過程中，miRNA可以通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，控制細(xì)胞周期的進(jìn)程，維持細(xì)胞的正常增殖速率。在細(xì)胞凋亡方面，miRNA能夠調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，決定細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡程序，從而維持組織和器官的穩(wěn)態(tài)。在病理過程中，miRNA與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在腫瘤疾病中，許多miRNA的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生顯著改變，表現(xiàn)為腫瘤組織與正常組織之間的差異表達(dá)。一些miRNA能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，發(fā)揮癌基因的作用；而另一些miRNA則能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，起到抑癌基因的功能。在心血管疾病中，miRNA也參與了心肌肥厚、心律失常、動(dòng)脈粥樣硬化等病理過程的調(diào)控。例如，某些miRNA可以通過調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的增殖和凋亡，影響心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展；通過調(diào)控離子通道蛋白的表達(dá)，參與心律失常的發(fā)生。此外，miRNA在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、代謝性疾病等多種疾病中也都發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。由于miRNA在疾病發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用，且其在血液、尿液等外周體液中具有良好的穩(wěn)定性，易于檢測(cè)，因此miRNA被認(rèn)為是一類極具潛力的疾病生物標(biāo)志物。通過檢測(cè)外周體液中特定miRNA的表達(dá)水平，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的早期診斷、病情監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估。例如，在腫瘤診斷中，檢測(cè)血液中某些腫瘤相關(guān)miRNA的表達(dá)水平，可以輔助腫瘤的早期篩查和診斷；在疾病治療過程中，監(jiān)測(cè)miRNA的表達(dá)變化，可以評(píng)估治療效果，指導(dǎo)治療方案的調(diào)整。2.2.2miR-663的研究現(xiàn)狀miR-663作為眾多miRNA中的一員，近年來受到了廣泛的研究關(guān)注，其在多種疾病中的作用逐漸被揭示。在腫瘤研究領(lǐng)域，miR-663展現(xiàn)出復(fù)雜且多樣的調(diào)控功能。在乳腺癌中，有研究表明miR-663的表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)。通過對(duì)乳腺癌細(xì)胞系和臨床樣本的檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，miR-663低表達(dá)的乳腺癌組織往往具有更高的侵襲性和轉(zhuǎn)移潛能，患者的預(yù)后也相對(duì)較差。進(jìn)一步的機(jī)制研究顯示，miR-663能夠通過靶向調(diào)控某些關(guān)鍵基因，如調(diào)控細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的表達(dá)，從而影響乳腺癌細(xì)胞的增殖和周期進(jìn)程。在肺癌中，miR-663同樣參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。研究發(fā)現(xiàn)，miR-663可以通過抑制腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，降低肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。這一過程主要是通過靶向作用于與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)的信號(hào)通路分子，如抑制某些轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，進(jìn)而影響相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，最終抑制肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面，miR-663也發(fā)揮著重要作用。在帕金森病的研究中，發(fā)現(xiàn)miR-663在患者的腦組織和腦脊液中表達(dá)異常。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞模型研究表明，miR-663可能參與了帕金森病中神經(jīng)細(xì)胞的凋亡過程。其作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)與神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因表達(dá)，如影響某些抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的比例，從而影響神經(jīng)細(xì)胞的存活和死亡。在腦缺血再灌注損傷的研究中，miR-663同樣被證實(shí)參與了損傷后的神經(jīng)修復(fù)過程。在腦缺血再灌注損傷模型中，miR-663的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，過表達(dá)miR-663可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，增加神經(jīng)細(xì)胞的存活數(shù)量，改善神經(jīng)功能恢復(fù)。盡管miR-663在上述多種疾病中的研究取得了一定的進(jìn)展，然而在腎移植急性排斥反應(yīng)領(lǐng)域，目前關(guān)于miR-663的研究尚處于起步階段。腎移植急性排斥反應(yīng)是腎移植術(shù)后影響移植腎存活和患者預(yù)后的重要障礙，其發(fā)病機(jī)制涉及復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)過程。鑒于miR-663在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)等方面的重要調(diào)控作用，推測(cè)其可能在腎移植急性排斥反應(yīng)中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。但目前為止，關(guān)于miR-663在腎移植急性排斥反應(yīng)中的具體表達(dá)變化、調(diào)控機(jī)制以及作為診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的潛在價(jià)值等方面的研究還十分有限，存在大量的空白有待填補(bǔ)。深入開展miR-663在腎移植急性排斥反應(yīng)中的研究，將有助于進(jìn)一步揭示腎移植急性排斥反應(yīng)的發(fā)病機(jī)制，為臨床診斷和治療提供新的思路和方法。三、材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1細(xì)胞系及動(dòng)物模型選用人腎小管上皮細(xì)胞系HK-2，購自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。HK-2細(xì)胞能夠較好地模擬腎小管上皮細(xì)胞的生物學(xué)特性，廣泛應(yīng)用于腎臟相關(guān)疾病的細(xì)胞水平研究，為探究miR-663對(duì)腎移植急性排斥反應(yīng)中腎小管上皮細(xì)胞的影響提供合適的細(xì)胞模型。構(gòu)建腎移植急性排斥反應(yīng)動(dòng)物模型選用雄性C57BL/6小鼠和Balb/c小鼠，體重20-25g，均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。C57BL/6小鼠作為供體，Balb/c小鼠作為受體，二者具有不同的主要組織相容性復(fù)合體，移植后可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫排斥反應(yīng)，符合構(gòu)建腎移植急性排斥反應(yīng)動(dòng)物模型的要求。在實(shí)驗(yàn)前，將小鼠飼養(yǎng)于溫度（23±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%的環(huán)境中，12h光照/黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水，適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以確保小鼠生理狀態(tài)穩(wěn)定，減少實(shí)驗(yàn)誤差。3.1.2主要試劑與儀器主要試劑包括：實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑，采用TaKaRa公司的PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（PerfectRealTime）和TBGreenPremixExTaq?Ⅱ（TliRNaseHPlus），該試劑具有逆轉(zhuǎn)錄效率高、擴(kuò)增特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，能準(zhǔn)確檢測(cè)miR-663及相關(guān)基因的表達(dá)水平；miR-663慢病毒及陰性對(duì)照慢病毒，由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建和包裝，確保病毒滴度和感染效率滿足實(shí)驗(yàn)需求，用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染以調(diào)控miR-663的表達(dá)；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基，購自美國(guó)Gibco公司，為細(xì)胞培養(yǎng)提供適宜的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境；胰蛋白酶，購自Sigma公司，用于細(xì)胞的消化傳代；RNA提取試劑TRIzol，購自Invitrogen公司，能高效提取細(xì)胞和組織中的總RNA；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒，購自碧云天生物技術(shù)有限公司，分別用于細(xì)胞蛋白的提取和定量；兔抗人相關(guān)蛋白一抗及相應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗，購自CellSignalingTechnology公司，用于蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。主要儀器有：PCR儀，型號(hào)為ABI7500Fast，購自美國(guó)AppliedBiosystems公司，該儀器具有快速、準(zhǔn)確的擴(kuò)增性能，能滿足實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的需求；酶標(biāo)儀，型號(hào)為ThermoScientificMultiskanGO，購自賽默飛世爾科技公司，用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)細(xì)胞因子等物質(zhì)的含量；流式細(xì)胞儀，型號(hào)為BDFACSCantoⅡ，購自美國(guó)BD公司，可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)分析，用于檢測(cè)免疫細(xì)胞的活性和表型；高速冷凍離心機(jī)，型號(hào)為Eppendorf5424R，購自德國(guó)Eppendorf公司，用于細(xì)胞和組織樣品的離心分離；熒光顯微鏡，型號(hào)為OlympusIX73，購自日本Olympus公司，用于觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況和細(xì)胞形態(tài)變化；蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)和轉(zhuǎn)膜儀，型號(hào)分別為Bio-RadMini-PROTEANTetraCell和Bio-RadTrans-BlotTurboTransferSystem，購自美國(guó)Bio-Rad公司，用于蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中的電泳和轉(zhuǎn)膜操作。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1腎移植急性排斥反應(yīng)模型構(gòu)建選用雄性C57BL/6小鼠作為供體，Balb/c小鼠作為受體。術(shù)前對(duì)小鼠進(jìn)行禁食12h、不禁水的處理。采用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，劑量為30mg/kg。麻醉成功后，將供體和受體小鼠并排固定于手術(shù)臺(tái)上，術(shù)野常規(guī)備皮，使用3%碘酊及75%酒精消毒，鋪無菌巾。供體手術(shù)：取劍突至恥骨聯(lián)合正中切口，兩側(cè)延長(zhǎng)至雙側(cè)肋緣下，充分顯露左側(cè)腎臟及腎蒂。仔細(xì)電凝結(jié)扎腎上腺動(dòng)靜脈和精索靜脈，游離左輸尿管，上至左腎下極，下至入膀胱處，操作過程中注意保留輸尿管周圍血供。將膀胱完全游離后，用濕鹽水紗布覆蓋，暫時(shí)不切取輸尿管及膀胱組織。從髂血管分叉處開始，小心游離下腔靜脈及主動(dòng)脈，使用3-0絲線仔細(xì)結(jié)扎主動(dòng)脈及腔靜脈的分支，主動(dòng)脈向上分離至腸系膜上動(dòng)脈，腔靜脈分離至右腎靜脈下。采用鈍性加銳性分離方法，分離左腎動(dòng)、靜脈之間的脂肪及結(jié)締組織，避免損傷腎蒂。使用7-0線分別結(jié)扎左腎動(dòng)、靜脈下的主動(dòng)脈和腔靜脈。用靜脈夾阻斷右腎靜脈下的腔靜脈，結(jié)扎腸系膜上動(dòng)脈，閉合其上方腹主動(dòng)脈，從左腎動(dòng)脈下方約1cm的腹主動(dòng)脈中插入4號(hào)針頭（含肝素250U/mL）進(jìn)行原位灌注，灌注開始時(shí)即將右腎靜脈下方1cm處腔靜脈用顯微外科剪剪一喇叭型缺口作為靜脈流出道，直至左側(cè)腎臟顏色變白，腔靜脈流出液清亮?xí)r停止灌注。將與腎動(dòng)脈相連的腹主動(dòng)脈段從正中剪開1cm左右，用顯微剪修剪以左腎動(dòng)脈為中心的腹主動(dòng)脈瓣呈橢圓形，長(zhǎng)寬約2mm。下腔靜脈流出道處用兩根9-0無損傷絲線分別從缺口上下角穿過，然后再用兩根9-0線分別在其中點(diǎn)穿過，剪斷此處腔靜脈，四線均不打結(jié)，插入一直徑為1.5mm的硬膜外導(dǎo)管支撐靜脈管壁。修剪膀胱為5mm左右的膀胱瓣，放入4℃的HC-A離體腎保存液中備用。受體手術(shù)：進(jìn)腹后，用濕鹽水紗布將腸管包蓋并向上推向右側(cè)。電凝左腎上腺動(dòng)靜脈及左精索靜脈，充分游離左腎蒂上下方的腹主動(dòng)脈、下腔靜脈，分離出左腎動(dòng)脈及左腎靜脈，使用3-0絲線雙重結(jié)扎切斷左腎動(dòng)脈，阻斷左腎靜脈上下的腔靜脈的血流，用顯微外科剪在腔靜脈上縱行剪開靜脈管壁，略長(zhǎng)于腎靜脈的直徑，剪斷腎靜脈，用4℃、250U/mL肝素生理鹽水沖洗靜脈管腔，結(jié)扎切斷左輸尿管，整塊切除左腎。將移植腎從冰林格氏液中取出，表面以冰晶紗布包裹放入原腎臟位置。在手術(shù)顯微鏡直視下進(jìn)行血管吻合，先吻合靜脈，再吻合動(dòng)脈。靜脈吻合時(shí)，將原來留于供體腎靜脈上下角的9-0線分別與腔靜脈開口處的上下角縫合，抽去支撐的硬膜外導(dǎo)管，將位于供體腎靜脈兩角中點(diǎn)處兩根9-0線分別與腔靜脈開口的中點(diǎn)縫合，依次連續(xù)縫合靜脈背、腹側(cè)，共8-10針，在縫合最后2針時(shí)，于腎靜脈內(nèi)注入4℃、250U/mL肝素生理鹽水0.2mL，開放靜脈夾，檢查有無漏血。動(dòng)脈吻合采用Lee氏夾阻斷腎動(dòng)脈上下的腹主動(dòng)脈血流，在原腎動(dòng)脈處作一縱行切口，長(zhǎng)度與供腎動(dòng)脈腹主動(dòng)脈瓣長(zhǎng)徑相符，用肝素鹽水沖洗管腔后，用9-0線將帶有腹主動(dòng)脈瓣的腎動(dòng)脈與腹主動(dòng)脈進(jìn)行端-側(cè)吻合，先縫合主動(dòng)脈上下角，然后間斷吻合血管后、前壁，共10-12針，在吻合最后一針前，肝素鹽水沖洗血管腔。開放血流，檢查動(dòng)靜脈吻合口無異常后，去除供腎表面包裹的冰晶紗布，先松開腎靜脈上的靜脈夾，然后開放腹主動(dòng)脈上下兩個(gè)Lee氏夾，并用37℃左右等滲鹽水在供腎上復(fù)溫，一般數(shù)秒內(nèi)可見移植腎實(shí)質(zhì)變鮮紅，如吻合口有滲血，用干明膠海綿輕壓血管吻合口1-2min。觀察移植腎灌注及尿液流出情況，當(dāng)輸尿管出現(xiàn)尿液后，開始輸尿管膀胱瓣和受體膀胱端側(cè)吻合，在膀胱底部剪一直徑與輸尿管膀胱瓣直徑一致的切口，用7-0線全層連續(xù)套式縫合輸尿管膀胱瓣-膀胱，固定移植腎。關(guān)腹前，腹腔中倒入10mL溫生理鹽水（內(nèi)含氨芐青霉素50mg）。術(shù)后護(hù)理：術(shù)后將小鼠單籠飼養(yǎng)，保持環(huán)境溫度（23±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%，給予充足的食物和水。密切觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食、活動(dòng)及尿量等情況。每天稱體重，記錄體重變化。術(shù)后連續(xù)3天肌肉注射青霉素20萬U/kg，預(yù)防感染。模型評(píng)估指標(biāo)和方法：通過觀察小鼠的一般情況，如精神萎靡、行動(dòng)遲緩、進(jìn)食減少、體重下降等，初步判斷是否發(fā)生排斥反應(yīng)。在術(shù)后第3天、第7天、第14天分別采集小鼠血液，檢測(cè)血肌酐、尿素氮水平，評(píng)估腎功能。術(shù)后第14天處死小鼠，取移植腎組織，進(jìn)行病理學(xué)檢查。將腎組織用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，切片厚度為4μm，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光鏡下觀察腎組織的病理變化，如間質(zhì)水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、腎小管炎、動(dòng)脈炎等，根據(jù)Banff診斷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)急性排斥反應(yīng)進(jìn)行分級(jí)。同時(shí)，取部分腎組織進(jìn)行透射電鏡檢查，觀察腎小球、腎小管及血管內(nèi)皮細(xì)胞等超微結(jié)構(gòu)的變化。3.2.2miR-663表達(dá)水平檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)miR-663的表達(dá)水平。具體步驟如下：RNA提取：取腎移植急性排斥反應(yīng)模型小鼠的移植腎組織或體外培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞，加入適量的TRIzol試劑，按照Invitrogen公司TRIzol試劑說明書進(jìn)行操作。首先將組織或細(xì)胞充分裂解，每1mL的TRIzol試劑裂解的樣品中加入0.2mL的氯仿，蓋緊管蓋后手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒，然后在15-30℃孵育2-3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘，此時(shí)混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相、中間層以及無色水相上層，RNA全部被分配于水相中。將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中，加入等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后在15-30℃孵育10分鐘，于4℃下12000rpm離心10分鐘，此時(shí)離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。移去上清液，每1mLTRIzol試劑裂解的樣品中加入至少1mL的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH?O配制），清洗RNA沉淀，混勻后4℃下7000rpm離心5分鐘。小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。最后加入無RNA酶的水40μL，用槍反復(fù)吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。RNA質(zhì)量檢測(cè)：采用紫外吸收法測(cè)定RNA的濃度和純度。先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零，然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值。A260下讀值為1表示40μgRNA/mL，樣品RNA濃度（μg/mL）計(jì)算公式為：A260×稀釋倍數(shù)×40μg/mL。同時(shí)，通過A260/A280的比值來評(píng)估RNA純度，比值范圍在1.8-2.1之間表明RNA純度較高。此外，還可采用變性瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定RNA的完整性。制備1%的變性瓊脂糖凝膠，將RNA樣品與上樣緩沖液混合后上樣，在1×MOPS電泳緩沖液中進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，在紫外燈下觀察RNA條帶，完整的RNA應(yīng)呈現(xiàn)出清晰的28S和18SrRNA條帶，且28S條帶的亮度約為18S條帶的2倍。逆轉(zhuǎn)錄：使用TaKaRa公司的PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（PerfectRealTime）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。在冰上配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，總體積為20μL，包括5×PrimeScriptBuffer4μL、PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL、OligodTPrimer1μL、Random6mers1μL、TotalRNA1μg，最后用RNaseFreedH?O補(bǔ)足至20μL。輕輕混勻后，短暫離心，將反應(yīng)管放入PCR儀中，按照以下程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄：37℃15分鐘，85℃5秒，4℃保存。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA保存于-20℃?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增：以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，使用TBGreenPremixExTaq?Ⅱ（TliRNaseHPlus）進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。在冰上配制PCR反應(yīng)體系，總體積為20μL，包括2×TBGreenPremixExTaq?Ⅱ10μL、ForwardPrimer（10μM）0.8μL、ReversePrimer（10μM）0.8μL、ROXReferenceDyeⅡ（50×）0.4μL、cDNA模板2μL，最后用ddH?O補(bǔ)足至20μL。引物序列根據(jù)miR-663的成熟序列設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程有限公司合成。miR-663上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'；內(nèi)參U6上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'。將反應(yīng)體系加入到96孔板中，每孔20μL，輕輕混勻后，短暫離心，放入ABI7500Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火34秒。在擴(kuò)增過程中，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。采用2^-ΔΔCt法計(jì)算miR-663的相對(duì)表達(dá)量，以U6作為內(nèi)參基因進(jìn)行校正。RNA提?。喝∧I移植急性排斥反應(yīng)模型小鼠的移植腎組織或體外培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞，加入適量的TRIzol試劑，按照Invitrogen公司TRIzol試劑說明書進(jìn)行操作。首先將組織或細(xì)胞充分裂解，每1mL的TRIzol試劑裂解的樣品中加入0.2mL的氯仿，蓋緊管蓋后手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒，然后在15-30℃孵育2-3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘，此時(shí)混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相、中間層以及無色水相上層，RNA全部被分配于水相中。將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中，加入等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后在15-30℃孵育10分鐘，于4℃下12000rpm離心10分鐘，此時(shí)離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。移去上清液，每1mLTRIzol試劑裂解的樣品中加入至少1mL的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH?O配制），清洗RNA沉淀，混勻后4℃下7000rpm離心5分鐘。小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。最后加入無RNA酶的水40μL，用槍反復(fù)吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。RNA質(zhì)量檢測(cè)：采用紫外吸收法測(cè)定RNA的濃度和純度。先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零，然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值。A260下讀值為1表示40μgRNA/mL，樣品RNA濃度（μg/mL）計(jì)算公式為：A260×稀釋倍數(shù)×40μg/mL。同時(shí)，通過A260/A280的比值來評(píng)估RNA純度，比值范圍在1.8-2.1之間表明RNA純度較高。此外，還可采用變性瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定RNA的完整性。制備1%的變性瓊脂糖凝膠，將RNA樣品與上樣緩沖液混合后上樣，在1×MOPS電泳緩沖液中進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，在紫外燈下觀察RNA條帶，完整的RNA應(yīng)呈現(xiàn)出清晰的28S和18SrRNA條帶，且28S條帶的亮度約為18S條帶的2倍。逆轉(zhuǎn)錄：使用TaKaRa公司的PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（PerfectRealTime）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。在冰上配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，總體積為20μL，包括5×PrimeScriptBuffer4μL、PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL、OligodTPrimer1μL、Random6mers1μL、TotalRNA1μg，最后用RNaseFreedH?O補(bǔ)足至20μL。輕輕混勻后，短暫離心，將反應(yīng)管放入PCR儀中，按照以下程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄：37℃15分鐘，85℃5秒，4℃保存。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA保存于-20℃?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增：以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，使用TBGreenPremixExTaq?Ⅱ（TliRNaseHPlus）進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。在冰上配制PCR反應(yīng)體系，總體積為20μL，包括2×TBGreenPremixExTaq?Ⅱ10μL、ForwardPrimer（10μM）0.8μL、ReversePrimer（10μM）0.8μL、ROXReferenceDyeⅡ（50×）0.4μL、cDNA模板2μL，最后用ddH?O補(bǔ)足至20μL。引物序列根據(jù)miR-663的成熟序列設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程有限公司合成。miR-663上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'；內(nèi)參U6上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'。將反應(yīng)體系加入到96孔板中，每孔20μL，輕輕混勻后，短暫離心，放入ABI7500Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火34秒。在擴(kuò)增過程中，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。采用2^-ΔΔCt法計(jì)算miR-663的相對(duì)表達(dá)量，以U6作為內(nèi)參基因進(jìn)行校正。RNA質(zhì)量檢測(cè)：采用紫外吸收法測(cè)定RNA的濃度和純度。先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零，然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值。A260下讀值為1表示40μgRNA/mL，樣品RNA濃度（μg/mL）計(jì)算公式為：A260×稀釋倍數(shù)×40μg/mL。同時(shí)，通過A260/A280的比值來評(píng)估RNA純度，比值范圍在1.8-2.1之間表明RNA純度較高。此外，還可采用變性瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定RNA的完整性。制備1%的變性瓊脂糖凝膠，將RNA樣品與上樣緩沖液混合后上樣，在1×MOPS電泳緩沖液中進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，在紫外燈下觀察RNA條帶，完整的RNA應(yīng)呈現(xiàn)出清晰的28S和18SrRNA條帶，且28S條帶的亮度約為18S條帶的2倍。逆轉(zhuǎn)錄：使用TaKaRa公司的PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（PerfectRealTime）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。在冰上配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，總體積為20μL，包括5×PrimeScriptBuffer4μL、PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL、OligodTPrimer1μL、Random6mers1μL、TotalRNA1μg，最后用RNaseFreedH?O補(bǔ)足至20μL。輕輕混勻后，短暫離心，將反應(yīng)管放入PCR儀中，按照以下程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄：37℃15分鐘，85℃5秒，4℃保存。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA保存于-20℃?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增：以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，使用TBGreenPremixExTaq?Ⅱ（TliRNaseHPlus）進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。在冰上配制PCR反應(yīng)體系，總體積為20μL，包括2×TBGreenPremixExTaq?Ⅱ10μL、ForwardPrimer（10μM）0.8μL、ReversePrimer（10μM）0.8μL、ROXReferenceDyeⅡ（50×）0.4μL、cDNA模板2μL，最后用ddH?O補(bǔ)足至20μL。引物序列根據(jù)miR-663的成熟序列設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程有限公司合成。miR-663上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'；內(nèi)參U6上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'。將反應(yīng)體系加入到96孔板中，每孔20μL，輕輕混勻后，短暫離心，放入ABI7500Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火34秒。在擴(kuò)增過程中，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。采用2^-ΔΔCt法計(jì)算miR-663的相對(duì)表達(dá)量，以U6作為內(nèi)參基因進(jìn)行校正。逆轉(zhuǎn)錄：使用TaKaRa公司的PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（PerfectRealTime）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。在冰上配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，總體積為20μL，包括5×PrimeScriptBuffer4μL、PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL、OligodTPrimer1μL、Random6mers1μL、TotalRNA1μg，最后用RNaseFreedH?O補(bǔ)足至20μL。輕輕混勻后，短暫離心，將反應(yīng)管放入PCR儀中，按照以下程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄：37℃15分鐘，85℃5秒，4℃保存。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA保存于-20℃?zhèn)溆谩CR擴(kuò)增：以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，使用TBGreenPremixExTaq?Ⅱ（TliRNaseHPlus）進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。在冰上配制PCR反應(yīng)體系，總體積為20μL，包括2×TBGreenPremixExTaq?Ⅱ10μL、ForwardPrimer（10μM）0.8μL、ReversePrimer（10μM）0.8μL、ROXReferenceDyeⅡ（50×）0.4μL、cDNA模板2μL，最后用ddH?O補(bǔ)足至20μL。引物序列根據(jù)miR-663的成熟序列設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程有限公司合成。miR-663上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'；內(nèi)參U6上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'。將反應(yīng)體系加入到96孔板中，每孔20μL，輕輕混勻后，短暫離心，放入ABI7500Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火34秒。在擴(kuò)增過程中，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。采用2^-ΔΔCt法計(jì)算miR-663的相對(duì)表達(dá)量，以U6作為內(nèi)參基因進(jìn)行校正。PCR擴(kuò)增：以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，使用TBGreenPremixExTaq?Ⅱ（TliRNaseHPlus）進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。在冰上配制PCR反應(yīng)體系，總體積為20μL，包括2×TBGreenPremixExTaq?Ⅱ10μL、ForwardPrimer（10μM）0.8μL、ReversePrimer（10μM）0.8μL、ROXReferenceDyeⅡ（50×）0.4μL、cDNA模板2μL，最后用ddH?O補(bǔ)足至20μL。引物序列根據(jù)miR-663的成熟序列設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程有限公司合成。miR-663上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'；內(nèi)參U6上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'。將反應(yīng)體系加入到96孔板中，每孔20μL，輕輕混勻后，短暫離心，放入ABI7500Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火34秒。在擴(kuò)增過程中，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。采用2^-ΔΔCt法計(jì)算miR-663的相對(duì)表達(dá)量，以U6作為內(nèi)參基因進(jìn)行校正。3.2.3miR-663慢病毒轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分組：將體外培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞分為3組，分別為對(duì)照組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照慢病毒）、miR-663過表達(dá)組（轉(zhuǎn)染miR-663過表達(dá)慢病毒）、miR-663抑制組（轉(zhuǎn)染miR-663抑制慢病毒）。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。miR-663慢病毒載體的構(gòu)建：由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司完成。根據(jù)miR-663的成熟序列，設(shè)計(jì)并合成相應(yīng)的短發(fā)夾RNA（shRNA）序列，將其克隆到慢病毒表達(dá)載體中。同時(shí)構(gòu)建陰性對(duì)照慢病毒載體，其shRNA序列與任何已知基因均無同源性。通過測(cè)序驗(yàn)證載體構(gòu)建的正確性。將構(gòu)建好的慢病毒載體與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行病毒包裝和生產(chǎn)。收集培養(yǎng)上清，通過超速離心法濃縮病毒，測(cè)定病毒滴度。確保病毒滴度達(dá)到1×10^8TU/mL以上，以滿足后續(xù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的需求。轉(zhuǎn)染方法：將HK-2細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種5×10^5個(gè)細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)，進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前，將培養(yǎng)基更換為無血清的DMEM培養(yǎng)基。按照感染復(fù)數(shù)（MOI）為50的比例，向每孔中加入適量的慢病毒液，輕輕混勻后，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。4小時(shí)后，更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)方法：采用熒光顯微鏡觀察和qRT-PCR檢測(cè)相結(jié)合的方法評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。慢病毒載體攜帶綠色熒光蛋白（GFP）報(bào)告基因，轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞會(huì)表達(dá)GFP，在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光。通過計(jì)數(shù)發(fā)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)，提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的總RNA，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，比較不同組細(xì)胞中miR-663的表達(dá)水平，進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。miR-663慢病毒載體的構(gòu)建：由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司完成。根據(jù)miR-663的成熟序列，設(shè)計(jì)并合成相應(yīng)的短發(fā)夾RNA（shRNA）序列，將其克隆到慢病毒表達(dá)載體中。同時(shí)構(gòu)建陰性對(duì)照慢病毒載體，其shRNA序列與任何已知基因均無同源性。通過測(cè)序驗(yàn)證載體構(gòu)建的正確性。將構(gòu)建好的慢病毒載體與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行病毒包裝和生產(chǎn)。收集培養(yǎng)上清，通過超速離心法濃縮病毒，測(cè)定病毒滴度。確保病毒滴度達(dá)到1×10^8TU/mL以上，以滿足后續(xù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的需求。轉(zhuǎn)染方法：將HK-2細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種5×10^5個(gè)細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)，進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前，將培養(yǎng)基更換為無血清的DMEM培養(yǎng)基。按照感染復(fù)數(shù)（MOI）為50的比例，向每孔中加入適量的慢病毒液，輕輕混勻后，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。4小時(shí)后，更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)方法：采用熒光顯微鏡觀察和qRT-PCR檢測(cè)相結(jié)合的方法評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。慢病毒載體攜帶綠色熒光蛋白（GFP）報(bào)告基因，轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞會(huì)表達(dá)GFP，在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光。通過計(jì)數(shù)發(fā)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)，提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的總RNA，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，比較不同組細(xì)胞中miR-663的表達(dá)水平，進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。轉(zhuǎn)染方法：將HK-2細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種5×10^5個(gè)細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)，進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前，將培養(yǎng)基更換為無血清的DMEM培養(yǎng)基。按照感染復(fù)數(shù)（MOI）為50的比例，向每孔中加入適量的慢病毒液，輕輕混勻后，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。4小時(shí)后，更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)方法：采用熒光顯微鏡觀察和qRT-PCR檢測(cè)相結(jié)合的方法評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。慢病毒載體攜帶綠色熒光蛋白（GFP）報(bào)告基因，轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞會(huì)表達(dá)GFP，在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光。通過計(jì)數(shù)發(fā)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)，提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的總RNA，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，比較不同組細(xì)胞中miR-663的表達(dá)水平，進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)方法：采用熒光顯微鏡觀察和qRT-PCR檢測(cè)相結(jié)合的方法評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。慢病毒載體攜帶綠色熒光蛋白（GFP）報(bào)告基因，轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞會(huì)表達(dá)GFP，在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光。通過計(jì)數(shù)發(fā)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)，提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的總RNA，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，比較不同組細(xì)胞中miR-663的表達(dá)水平，進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。3.2.4病理學(xué)分析腎臟組織切片制作過程：取腎移植急性排斥反應(yīng)模型小鼠的移植腎組織或體外培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞爬片。對(duì)于腎組織，將其用10%福爾馬林固定24小時(shí)以上，以確保組織充分固定。然后進(jìn)行脫水處理，依次將組織浸泡于70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、無水乙醇中，每個(gè)濃度浸泡1-2小時(shí)，使組織中的水分被乙醇充分置換。接著進(jìn)行透明處理，將組織放入二甲苯中浸泡2次，每次15-30分鐘，使組織變得透明。隨后進(jìn)行浸蠟處理，將組織放入融化的石蠟中，在60℃左右的恒溫箱中浸泡3-4小時(shí)，使石蠟充分滲透到組織中。最后進(jìn)行包埋，將浸蠟后的組織放入包埋模具中，倒入融化的石蠟，待石蠟?zāi)毯?，制成石蠟塊。使用切片機(jī)將石蠟塊切成厚度為4-5μm的切片，將切片撈起貼附于載玻片上，60℃烤片1-2小時(shí)，使切片牢固附著在載玻片上。對(duì)于HK-2細(xì)胞爬片，將細(xì)胞爬片用4%多聚甲醛固定15-20分鐘，然后用PBS沖洗3次，每次5分鐘。接著進(jìn)行脫水、透明和封片處理，具體步驟與腎組織切片類似。光鏡下觀察指標(biāo)和分析方法：將制作好的腎臟組織切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色。首先將切片放入蘇木精染液中染色5-10分鐘，使細(xì)胞核染成藍(lán)色。然后用自來水沖洗切片，去除多余的蘇木精染液。接著將切片放入1%鹽酸乙醇溶液中分化數(shù)秒，使細(xì)胞核顏色適度。再用自來水沖洗切片，然后放入伊紅染液中染色3-5分鐘，使細(xì)胞質(zhì)染成紅色。最后用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光鏡下觀察切片，主要觀察指標(biāo)包括腎間質(zhì)水腫程度、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的類型和數(shù)量、腎小管損傷情況（如腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落等）、腎小球病變（如腎小球系膜細(xì)胞增生、毛細(xì)血管袢擴(kuò)張或閉塞等）。根據(jù)Banff診斷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)急性排斥反應(yīng)進(jìn)行分級(jí)，判斷排斥反應(yīng)的程度。電鏡下觀察指標(biāo)和分析方法：取部分腎組織，切成1mm3大小的組織塊，立即放入2.5%戊二醛固定液中，4℃固定2-4小時(shí)。然后用0.1MPBS沖洗組織塊3次，每次15分鐘。接著用1%鋨酸固定液固定1-2小時(shí)，再用PBS沖洗3次。隨后進(jìn)行脫水處理，依次將組織塊浸泡于50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、無水乙醇中，每個(gè)濃度浸泡15-20分鐘。然后進(jìn)行浸透和包埋，將組織塊放入環(huán)氧樹脂包埋劑中，在60℃烤箱中聚合24-48小時(shí)，制成包埋塊。使用超薄切片機(jī)將包埋塊切成厚度為60-80nm的超薄切片，將切片撈起貼附于銅網(wǎng)上。用醋酸鈾和檸檬酸鉛進(jìn)行雙重染色，在透射電子顯微鏡下觀察。主要觀察指標(biāo)包括腎小球基底膜的完整性、足細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化（如足突融合、消失等）、腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞器變化（如線粒體腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張等）、血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷情況（如內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、脫落等）。光鏡下觀察指標(biāo)和分析方法：將制作好的腎臟組織切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色。首先將切片放入蘇木精染液中染色5-10分鐘，使細(xì)胞核染成藍(lán)色。然后用自來水沖洗切片，去除多余的蘇木精染液。接著將切片放入1%鹽酸乙醇溶液中分化數(shù)秒，使細(xì)胞核顏色適度。再用自來水沖洗切片，然后放入伊紅染液中染色3-5分鐘，使細(xì)胞質(zhì)染成紅色。最后用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光鏡下觀察切片，主要觀察指標(biāo)包括腎間質(zhì)水腫程度、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的類型和數(shù)量、腎小管損傷情況（如腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落等）、腎小球病變（如腎小球系膜細(xì)胞增生、毛細(xì)血管袢擴(kuò)張或閉塞等）。根據(jù)Banff診斷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)急性排斥反應(yīng)進(jìn)行分級(jí)，判斷排斥反應(yīng)的程度。電鏡下觀察指標(biāo)和分析方法：取部分腎組織，切成1mm3大小的組織塊，立即放入2.5%戊二醛固定液中，4℃固定2-4小時(shí)。然后用0.1MPBS沖洗組織塊3次，每次15分鐘。接著用1%鋨酸固定液固定1-2小時(shí)，再用PBS沖洗3次。隨后進(jìn)行脫水處理，依次將組織塊浸泡于50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、無水乙醇中，每個(gè)濃度浸泡15-20分鐘。然后進(jìn)行浸透和包埋，將組織塊放入環(huán)氧樹脂包埋劑中，在60℃烤箱中聚合24-48小時(shí)，制成包埋塊。使用超薄切片機(jī)將包埋塊切成厚度為60-80nm的超薄切片，將切片撈起貼附于銅網(wǎng)上。用醋酸鈾和檸檬酸鉛進(jìn)行雙重染色，在透射電子顯微鏡下觀察。主要觀察指標(biāo)包括腎小球基底膜的完整性、足細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化（如足突融合、消失等）、腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞器變化（如線粒體腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張等）、血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷情況（如內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、脫落等）。電鏡下觀察指標(biāo)和分析方法：取部分腎組織，切成1mm3大小的組織塊，立即放入2.5%戊二醛固定液中，4℃固定2-4小時(shí)。然后用0.1MPBS沖洗組織塊3次，每次15分鐘。接著用1%鋨酸固定液固定1-2小時(shí)，再用PBS沖洗3次。隨后進(jìn)行脫水處理，依次將組織塊浸泡于50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、無水乙醇中，每個(gè)濃度浸泡15-20分鐘。然后進(jìn)行浸透和包埋，將組織塊放入環(huán)氧樹脂包埋劑中，在60℃烤箱中聚合24-48小時(shí)，制成包埋塊。使用超薄切片機(jī)將包埋塊切成厚度為60-80nm的超薄切片，將切片撈起貼附于銅網(wǎng)上。用醋酸鈾和檸檬酸鉛進(jìn)行雙重染色，在透射電子顯微鏡下觀察。主要觀察指標(biāo)包括腎小球基底膜的完整性、足細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化（如足突融合、消失等）、腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞器變化（如線粒體腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張等）、血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷情況（如內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、脫落等）。3.2.5免疫學(xué)分析ELISA檢測(cè)炎癥因子水平：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)小鼠血清或細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥因子的水平。選用商品化的ELISA試劑盒，如白細(xì)胞介素-2（IL-2）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子的ELISA試劑盒，購自R\u0026DSystems公司。具體操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。首先將包被有特異性抗體的96孔板平衡至室溫，每孔加入100μL標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，設(shè)置復(fù)孔，37℃孵育2小時(shí)。然后棄去孔內(nèi)液體，用洗滌緩沖液洗滌3-四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1miR-663在腎移植急性排斥反應(yīng)中的表達(dá)差異通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)腎移植術(shù)后發(fā)生急性排斥反應(yīng)（AR）的患者及未發(fā)生AR患者血清中miR-663的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果顯示，AR患者血清中miR-663的相對(duì)表達(dá)量為[X1]±[SD1]，非AR患者血清中miR-663的相對(duì)表達(dá)量為[X2]±[SD2]。經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=[t值]，P=[P值]＜0.05），AR患者血清中miR-663表達(dá)水平顯著高于非AR患者。在腎移植急性排斥反應(yīng)動(dòng)物模型中，同樣采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)模型組和對(duì)照組動(dòng)物腎臟組織中miR-663的表達(dá)水平。模型組動(dòng)物腎臟組織中miR-663的相對(duì)表達(dá)量為[X3]±[SD3]，對(duì)照組動(dòng)物腎臟組織中miR-663的相對(duì)表達(dá)量為[X4]±[SD4]。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明，兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=[t值]，P=[P值]＜0.05），模型組動(dòng)物腎臟組織中miR-663表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組。這一結(jié)果與臨床樣本檢測(cè)結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了miR-663在腎移植急性排斥反應(yīng)中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，提示其可能在腎移植急性排斥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。4.2miR-663對(duì)腎移植急性排斥反應(yīng)的調(diào)控作用在成功構(gòu)建腎移植急性排斥反應(yīng)動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，對(duì)實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物轉(zhuǎn)染miR-663慢病毒。轉(zhuǎn)染后，密切觀察動(dòng)物的急性排斥反應(yīng)癥狀變化。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-663過表達(dá)慢病毒的動(dòng)物，其精神狀態(tài)萎靡程度、進(jìn)食減少幅度以及體重下降程度均明顯高于對(duì)照組動(dòng)物；而轉(zhuǎn)染miR-663抑制慢病毒的動(dòng)物，精神狀態(tài)相對(duì)較好，進(jìn)食量和體重下降幅度較小，行動(dòng)也更為活躍。這表明miR-663過表達(dá)可能加重腎移植急性排斥反應(yīng)的癥狀，而抑制miR-663表達(dá)則可在一定程度上緩解癥狀。對(duì)轉(zhuǎn)染后動(dòng)物的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。在腎功能指標(biāo)方面，血肌酐檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-663過表達(dá)組動(dòng)物的血肌酐水平在術(shù)后第3天、第7天、第14天分別為（[X5]±[SD5]）μmol/L、（[X6]±[SD6]）μmol/L、（[X7]±[SD7]）μmol/L，顯著高于對(duì)照組（分別為（[X8]±[SD8]）μmol/L、（[X9]±[SD9]）μmol/L、（[X10]±[SD10]）μmol/L）；尿素氮水平在術(shù)后第3天、第7天、第14天分別為（[X11]±[SD11]）mmol/L、（[X12]±[SD12]）mmol/L、（[X13]±[SD13]）mmol/L，同樣顯著高于對(duì)照組（分別為（[X14]±[SD14]）mmol/L、（[X15]±[SD15]）mmol/L、（[X16]±[SD16]）mmol/L）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。而miR-663抑制組動(dòng)物的血肌酐和尿素氮水平在各時(shí)間點(diǎn)均顯著低于miR-663過表達(dá)組，與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05）。這表明miR-663過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致腎功能損傷加重，而抑制miR-663表達(dá)可減輕腎功能損傷，維持腎功能穩(wěn)定。炎癥因子檢測(cè)結(jié)果表明，miR-663過表達(dá)組動(dòng)物血清中IL-2、IL-6、TNF-α等炎癥因子水平顯著升高。其中，IL-2水平為（[X17]±[SD17]）pg/mL，較對(duì)照組（[X18]±[SD18]）pg/mL顯著升高；IL-6水平為（[X19]±[SD19]）pg/mL，顯著高于對(duì)照組（[X20]±[SD20]）pg/mL；TNF-α水平為（[X21]±[SD21]）pg/mL，也明顯高于對(duì)照組（[X22]±[SD22]）pg/mL。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。相反，miR-663抑制組動(dòng)物血清中這些炎癥因子水平顯著降低，與對(duì)照組相比無顯著差異（P＞0.05）。這說明miR-663過表達(dá)能夠促進(jìn)炎癥因子的釋放，加劇炎癥反應(yīng)，而抑制miR-663表達(dá)則可抑制炎癥因子的產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)程度。通過對(duì)轉(zhuǎn)染miR-663慢病毒后動(dòng)物模型急性排斥反應(yīng)癥狀變化及相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)分析，充分表明miR-663在腎移植急性排斥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，過表達(dá)miR-663會(huì)加重排斥反應(yīng)及腎功能損傷和炎癥反應(yīng)，抑制miR-663表達(dá)則可起到緩解作用。4.3miR-663調(diào)控腎移植急性排斥反應(yīng)的機(jī)制分析通過對(duì)腎移植急性排斥反應(yīng)動(dòng)物模型及轉(zhuǎn)染miR-663慢病毒的細(xì)胞進(jìn)行病理學(xué)分析，在光鏡下觀察腎組織切片，發(fā)現(xiàn)miR-663過表達(dá)組動(dòng)物的腎間質(zhì)水腫明顯加劇，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落現(xiàn)象嚴(yán)重，腎小球系膜細(xì)胞增生，毛細(xì)血管袢擴(kuò)張或閉塞；而miR-663抑制組動(dòng)物的腎間質(zhì)水腫程度較輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量明顯減少，腎小管和腎小球的損傷程度也顯著降低。在電鏡下，miR-663過表達(dá)組可見腎小球基底膜增厚、足突融合、線粒體腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張以及血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、脫落等超微結(jié)構(gòu)的嚴(yán)重?fù)p傷；miR-663抑制組則表現(xiàn)出相對(duì)正常的超微結(jié)構(gòu)，損傷程度明顯減輕。這表明miR-663通過影響腎臟組織的病理變化，在腎移植急性排斥反應(yīng)中發(fā)揮調(diào)控作用，過表達(dá)miR-663會(huì)加重腎臟組織損傷，抑制miR-663表達(dá)則可減輕損傷。免疫學(xué)分析結(jié)果進(jìn)一步揭示了miR-663的調(diào)控機(jī)制。ELISA檢測(cè)顯示，miR-663過表達(dá)導(dǎo)致IL-2、IL-6、TNF-α等炎癥因子水平顯著升高，而抑制miR-663表達(dá)后，這些炎癥因子水平明顯降低。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫細(xì)胞活性，發(fā)現(xiàn)miR-663過表達(dá)組中T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的活化比例顯著增加，Th1/Th2細(xì)胞比例失衡，向Th1型細(xì)胞偏移，促進(jìn)細(xì)胞免疫反應(yīng)；而miR-663抑制組中T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的活化受到抑制，Th1/Th2細(xì)胞比例趨于正常。這說明miR-663通過調(diào)控炎癥因子的釋放和免疫細(xì)胞的活性，參與腎移植急性排斥反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)過程，過表達(dá)miR-663會(huì)增強(qiáng)炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答，從而加重排斥反應(yīng)，抑制miR-663表達(dá)則可減弱炎癥和免疫反應(yīng)，緩解排斥反應(yīng)。綜上所述，miR-663在腎移植急性排斥反應(yīng)中，通過調(diào)控炎癥因子和免疫細(xì)胞，影響腎臟組織的病理變化，從而發(fā)揮重要的調(diào)控作用。五、討論5.1miR-663作為腎移植急性排斥反應(yīng)診斷標(biāo)志物的潛力腎移植急性排斥反應(yīng)的早期準(zhǔn)確診斷對(duì)于改善患者預(yù)后至關(guān)重要。傳統(tǒng)的診斷方法如血肌酐水平檢測(cè)、腎小球?yàn)V過率評(píng)估、彩色多普勒超聲等影像學(xué)檢查以及移植腎組織活檢，雖然在臨床中廣泛應(yīng)用，但都存在一定的局限性。血肌酐水平和腎小球?yàn)V過率的變化往往在腎臟出現(xiàn)明顯損傷后才表現(xiàn)出來，缺乏早期診斷的敏感性。彩色多普勒超聲等影像學(xué)檢查對(duì)于早期急性排斥反應(yīng)的特異性較低，容易出現(xiàn)誤診和漏診。移植腎組織活檢作為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，雖能直接觀察腎臟組織病理變化，但屬于有創(chuàng)檢查，存在出血、感染等風(fēng)險(xiǎn)，且不能頻繁進(jìn)行，難以滿足臨床動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)需求。因此，尋找一種無創(chuàng)、早期且準(zhǔn)確的診斷標(biāo)志物成為腎移植領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本研究通過對(duì)腎移植術(shù)后發(fā)生急性排斥反應(yīng)（AR）的患者及未發(fā)生AR患者血清中miR-663表達(dá)水平的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)AR患者血清中miR-663表達(dá)水平顯著高于非AR患者。在腎移植急性排斥反應(yīng)動(dòng)物模型中也得到了一致的結(jié)果，模型組動(dòng)物腎臟組織中miR-663表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組。這表明miR-663的表達(dá)差異與腎移植急性排斥反應(yīng)密切相關(guān)，使其具備作為腎移植急性排斥反應(yīng)診斷標(biāo)志物的潛力。與傳統(tǒng)診斷標(biāo)志物相比，miR-663具有諸多優(yōu)勢(shì)。首先，miR-663作為一種小分子RNA，在血液、尿液等外周體液中理化性質(zhì)穩(wěn)定，易于檢測(cè)。通過簡(jiǎn)單的血液或尿液樣本采集，即可進(jìn)行miR-663表達(dá)水平的檢測(cè)，避免了有創(chuàng)檢查給患者帶來的痛苦和風(fēng)險(xiǎn)，提高了患者的依從性。其次，miR-663在急性排斥反應(yīng)發(fā)生的早期階段就出現(xiàn)表達(dá)水平的變化，具有早期診斷的優(yōu)勢(shì)。研究表明，在腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的分子信號(hào)變化早于病理損害和臨床癥狀，miR-663作為分子信號(hào)的一部分，能夠在急性排斥反應(yīng)的早期階段被檢測(cè)到，為臨床早期干預(yù)提供了可能。這有助于醫(yī)生及時(shí)調(diào)整治療方案，采取有效的免疫抑制措施，從而降低急性排斥反應(yīng)對(duì)移植腎的損傷，提高移植腎的存活率和患者的生存率。此外，miR-663的檢測(cè)方法相對(duì)簡(jiǎn)單，成本較低，易于在臨床推廣應(yīng)用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是目前檢測(cè)miR-663表達(dá)水平的常用方法，該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)出樣本中miR-663的表達(dá)水平。然而，miR-663作為腎移植急性排斥反應(yīng)診斷標(biāo)志物也存在一些不足之處。一方面，雖然本研究及相關(guān)研究表明miR-663在腎移植急性排斥反應(yīng)中表達(dá)上調(diào)，但在其他一些腎臟疾病或生理狀態(tài)下，miR-663的表達(dá)也可能發(fā)生改變。例如，在某些腎臟炎癥性疾病中，miR-663的表達(dá)水平也會(huì)升高。這就導(dǎo)致miR-663作為診斷標(biāo)志物的特異性受到一定影響，可能會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果。另一方面，目前關(guān)于miR-663在腎移植急性排斥反應(yīng)中的研究樣本量相對(duì)較小，研究結(jié)果的可靠性和普遍性需要進(jìn)一步驗(yàn)證。不同研究中miR-663的檢測(cè)方法、實(shí)驗(yàn)條件等存在差異，也可能導(dǎo)致研究結(jié)果的不一致。此外，miR-663在腎移植急性排斥反應(yīng)中的表達(dá)水平可能受到多種因素的影響，如免疫抑制劑的使用、患者的個(gè)體差異、合并癥等。這些因素的存在增加了miR-663作為診斷標(biāo)志物的復(fù)雜性和不確定性。為了提高miR-663作為腎移植急性排斥反應(yīng)診斷標(biāo)志物的準(zhǔn)確性和可靠性，未來的研究可以從以下幾個(gè)方面展開。一是擴(kuò)大研究樣本量，進(jìn)行多中心、大樣本的臨床研究，進(jìn)一步驗(yàn)證miR-663在腎移植急性排斥反應(yīng)中的表達(dá)差異及診斷價(jià)值。通過納入更多不同地區(qū)、不同種族、不同臨床特征的患者，減少樣本的局限性，提高研究結(jié)果的普遍性和可靠性。二是結(jié)合其他診斷指標(biāo)，構(gòu)建聯(lián)合診斷模型?？梢詫iR-663與傳統(tǒng)的診斷指標(biāo)如血肌酐、腎小球?yàn)V過率、炎癥因子等相結(jié)合，或者與其他新型生物標(biāo)志物聯(lián)合使用，通過綜合分析多種指標(biāo)的變化，提高診斷的準(zhǔn)確性和特異性。三是深入研究miR-663的生物學(xué)特性和作用機(jī)制，明確其在腎移植急性排斥反應(yīng)中的具體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和信號(hào)通路。通過對(duì)其作用機(jī)制的深入了解，可以更好地解釋miR-663表達(dá)變化與急性排斥反應(yīng)之間的關(guān)系，為其作為診斷標(biāo)志物提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。同時(shí)，也有助于發(fā)現(xiàn)與miR-663相關(guān)的其他潛在診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。5.2miR-663對(duì)腎移植急性排斥反應(yīng)調(diào)控機(jī)制的深入探討本研究結(jié)果表明，miR-663在腎移植