DHX32與FLIP在結(jié)直腸癌中的表達(dá)、關(guān)聯(lián)及臨床價(jià)值探究一、引言1.1研究背景與意義結(jié)直腸癌（colorectalcancer，CRC）作為常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。近年來(lái)，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出顯著的上升趨勢(shì)。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的數(shù)據(jù)，2020年全球結(jié)直腸癌新發(fā)病例達(dá)193萬(wàn)例，死亡病例約93.5萬(wàn)例，發(fā)病率位居所有惡性腫瘤的第三位，死亡率位列第二位。在我國(guó)，隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和居民生活方式的改變，尤其是飲食結(jié)構(gòu)逐漸西化，高脂肪、高蛋白、低纖維食物攝入增多，以及運(yùn)動(dòng)量減少、肥胖人群增加等因素的影響，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率也持續(xù)攀升，已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。結(jié)直腸癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，預(yù)后較差。目前，臨床上對(duì)于結(jié)直腸癌的診斷主要依賴于結(jié)腸鏡檢查、影像學(xué)檢查和腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)等方法，但這些方法存在一定的局限性。結(jié)腸鏡檢查雖為金標(biāo)準(zhǔn)，但屬于侵入性檢查，患者依從性較差；影像學(xué)檢查對(duì)于早期病變的敏感度有限；而現(xiàn)有的腫瘤標(biāo)志物如癌胚抗原（CEA）、糖類抗原19-9（CA19-9）等，其診斷的特異性和敏感度均有待提高。因此，尋找新的、更有效的腫瘤標(biāo)志物，對(duì)于結(jié)直腸癌的早期診斷、病情監(jiān)測(cè)及預(yù)后評(píng)估具有重要的臨床意義。DHX32（DEAH-boxhelicase32）是一種RNA解旋酶，屬于DEAH/RHA家族，在多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括RNA轉(zhuǎn)錄、剪接、翻譯起始以及核糖體生物發(fā)生等。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，DHX32在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在結(jié)直腸癌中，已有研究報(bào)道DHX32基因呈高表達(dá)狀態(tài)，且其表達(dá)水平與結(jié)直腸癌的組織學(xué)分級(jí)、癌栓形成、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Dukes分期緊密相關(guān)，提示DHX32可能參與了結(jié)直腸癌的惡性進(jìn)展過(guò)程，有望成為結(jié)直腸癌診斷和預(yù)后評(píng)估的潛在生物標(biāo)志物。FLIP（FLICE-likeinhibitoryprotein），即細(xì)胞型Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域樣白介素-1β轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白，是一種內(nèi)源性細(xì)胞凋亡抑制蛋白。FLIP主要有兩種剪接異構(gòu)體，長(zhǎng)型FLIP（FLIPL）和短型FLIP（FLIPS），它們通過(guò)與死亡受體信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子相互作用，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和增殖。大量研究表明，F(xiàn)LIP在多種腫瘤組織中高表達(dá)，與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能及患者預(yù)后不良密切相關(guān)。在結(jié)直腸癌中，F(xiàn)LIP的表達(dá)水平也明顯升高，且與腫瘤的分化程度、臨床分期等相關(guān)，但其在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制尚未完全明確。鑒于DHX32和FLIP在結(jié)直腸癌中的重要作用，深入研究它們?cè)诮Y(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況及其與臨床病理特征的關(guān)系，對(duì)于揭示結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制、尋找新的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)具有重要的理論和實(shí)踐意義。通過(guò)檢測(cè)DHX32和FLIP的表達(dá)水平，有可能為結(jié)直腸癌的早期診斷、病情評(píng)估和預(yù)后預(yù)測(cè)提供更準(zhǔn)確、有效的方法，為臨床治療決策的制定提供科學(xué)依據(jù)，進(jìn)而改善結(jié)直腸癌患者的生存質(zhì)量和預(yù)后。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國(guó)外，對(duì)于DHX32在結(jié)直腸癌中的研究，較早關(guān)注到其作為RNA解旋酶參與腫瘤相關(guān)生物學(xué)過(guò)程。有研究運(yùn)用基因芯片技術(shù)對(duì)大量結(jié)直腸癌樣本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)DHX32基因在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著高于正常組織，初步揭示了DHX32與結(jié)直腸癌的關(guān)聯(lián)。隨后的功能實(shí)驗(yàn)表明，通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默DHX32基因后，結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力明顯減弱，細(xì)胞周期進(jìn)程受到阻滯，這表明DHX32在維持結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖活性中發(fā)揮重要作用。在探討其作用機(jī)制方面，研究發(fā)現(xiàn)DHX32可能通過(guò)調(diào)控某些與細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)的信號(hào)通路來(lái)影響結(jié)直腸癌的發(fā)展，例如PI3K/AKT信號(hào)通路，DHX32的高表達(dá)能夠激活該信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的存活和增殖。關(guān)于FLIP在結(jié)直腸癌中的研究，國(guó)外學(xué)者在細(xì)胞和動(dòng)物模型層面進(jìn)行了深入探索。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，利用過(guò)表達(dá)或敲低FLIP的結(jié)直腸癌細(xì)胞系，研究其對(duì)細(xì)胞凋亡和增殖的影響。結(jié)果顯示，F(xiàn)LIP高表達(dá)可抑制腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，使結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)凋亡刺激產(chǎn)生抵抗，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)；而敲低FLIP則可增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，將過(guò)表達(dá)FLIP的結(jié)直腸癌細(xì)胞接種到裸鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)速度明顯加快，腫瘤體積和重量顯著增加，進(jìn)一步證實(shí)了FLIP在結(jié)直腸癌發(fā)展中的促癌作用。此外，研究還發(fā)現(xiàn)FLIP與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其可能通過(guò)調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程來(lái)促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。在國(guó)內(nèi)，對(duì)DHX32和FLIP在結(jié)直腸癌中的研究也取得了一系列成果。在DHX32的研究方面，有團(tuán)隊(duì)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組化技術(shù)，檢測(cè)了大量結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中DHX32的表達(dá)水平，結(jié)果與國(guó)外研究一致，即結(jié)直腸癌組織中DHX32呈高表達(dá)狀態(tài)，且其表達(dá)水平與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期密切相關(guān)，提示DHX32可作為評(píng)估結(jié)直腸癌惡性程度和預(yù)后的潛在指標(biāo)。在作用機(jī)制研究上，國(guó)內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)DHX32可能通過(guò)與某些轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控下游基因的表達(dá)，進(jìn)而影響結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。對(duì)于FLIP，國(guó)內(nèi)研究同樣關(guān)注其在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及功能。有研究采用Westernblot和免疫組化方法檢測(cè)FLIP在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)FLIP的表達(dá)水平與腫瘤的分化程度、臨床分期及患者預(yù)后密切相關(guān)，低分化、晚期結(jié)直腸癌組織中FLIP表達(dá)明顯升高，且FLIP高表達(dá)的患者預(yù)后較差。在機(jī)制研究方面，國(guó)內(nèi)研究進(jìn)一步揭示了FLIP通過(guò)抑制caspase-8的激活，阻斷死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)展；同時(shí)，F(xiàn)LIP還可能與其他凋亡相關(guān)蛋白相互作用，共同調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡和增殖平衡。盡管國(guó)內(nèi)外在DHX32和FLIP與結(jié)直腸癌關(guān)系的研究上取得了一定進(jìn)展，但仍存在不足之處。目前對(duì)于DHX32和FLIP在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的上游調(diào)控機(jī)制研究相對(duì)較少，尚不清楚哪些因素如何精確調(diào)控它們的表達(dá)。在兩者與結(jié)直腸癌的靶向治療研究方面，雖然已明確它們?cè)诮Y(jié)直腸癌中的重要作用，但針對(duì)它們開發(fā)有效的靶向治療藥物或策略仍處于起步階段，缺乏深入的臨床前和臨床研究。此外，關(guān)于DHX32和FLIP在結(jié)直腸癌微環(huán)境中的作用以及它們與其他腫瘤相關(guān)分子之間的復(fù)雜相互作用網(wǎng)絡(luò)，也有待進(jìn)一步深入研究，這將有助于全面揭示結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制，為臨床治療提供更精準(zhǔn)的靶點(diǎn)和策略。1.3研究目的與內(nèi)容1.3.1研究目的本研究旨在深入探究DHX32和FLIP在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制，具體目的如下：建立一種準(zhǔn)確、可靠且高效的實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（FQ-RT-PCR）方法，用于檢測(cè)DHX32mRNA、FLIP(L)mRNA以及FLIP(S)mRNA的表達(dá)水平，為后續(xù)研究提供技術(shù)支持。全面了解DHX32和FLIP在結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)情況，分析其表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征（如組織學(xué)分級(jí)、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等）之間的關(guān)聯(lián)，明確它們?cè)诮Y(jié)直腸癌診斷、病情評(píng)估及預(yù)后判斷中的臨床意義。揭示DHX32和FLIP之間的相互關(guān)系，探索它們?cè)诮Y(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能參與的信號(hào)通路及分子機(jī)制，為結(jié)直腸癌的靶向治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。1.3.2研究?jī)?nèi)容圍繞上述研究目的，本研究主要開展以下幾方面的工作：FQ-RT-PCR檢測(cè)方法的建立：根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫(kù)中DHX32、FLIP(L)和FLIP(S)的基因序列，運(yùn)用primerexpress2.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針。對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，包括引物和探針濃度、退火溫度、循環(huán)次數(shù)等，并進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)，如特異性、重復(fù)性及擴(kuò)增效率檢測(cè)，建立穩(wěn)定可靠的檢測(cè)DHX32、FLIP(L)和FLIP(S)的FQ-RT-PCR方法?；虮磉_(dá)檢測(cè)及臨床意義分析：收集一定數(shù)量的新鮮結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織樣本，提取組織總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以管家基因β-actin為內(nèi)標(biāo)基因，運(yùn)用建立好的FQ-RT-PCR方法，對(duì)各樣本中DHX32、FLIP(L)以及FLIP(S)基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)合結(jié)直腸癌患者的臨床病理特征資料，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析DHX32和FLIP的表達(dá)水平與組織學(xué)分級(jí)、DUKES臨床分期、癌栓形成、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素之間的相關(guān)性，明確其在結(jié)直腸癌診斷和預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值?；蜿P(guān)系及作用機(jī)制探索：分析DHX32和FLIP表達(dá)水平之間的相關(guān)性，研究?jī)烧咴诮Y(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的相互作用。通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)技術(shù)，如細(xì)胞轉(zhuǎn)染、RNA干擾、蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）等，進(jìn)一步探究它們參與的信號(hào)通路及對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的影響，揭示其在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。1.4研究方法與技術(shù)路線1.4.1研究方法FQ-RT-PCR檢測(cè)：根據(jù)NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)中DHX32、FLIP(L)和FLIP(S)的基因序列，運(yùn)用primerexpress2.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針。引物和探針由專業(yè)生物公司合成。提取結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織總RNA時(shí)，采用Trizol試劑法，嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書操作。利用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA濃度和純度，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。以提取的總RNA為模板，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中，采用TaqMan探針?lè)?，反?yīng)體系包含cDNA模板、上下游引物、TaqMan探針、PCRMasterMix等。反應(yīng)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，設(shè)置適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)程序，包括預(yù)變性、變性、退火、延伸等步驟。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)儀器自動(dòng)分析結(jié)果，以管家基因β-actin為內(nèi)標(biāo)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。免疫組化檢測(cè)：收集結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織標(biāo)本，經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，制成4μm厚切片。切片脫蠟至水后，進(jìn)行抗原修復(fù)，采用高溫高壓法或微波修復(fù)法。滴加正常山羊血清封閉非特異性抗原，孵育一抗（兔抗人DHX32抗體、兔抗人FLIP抗體），4℃過(guò)夜。次日，滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30分鐘，再滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30分鐘。DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)。脫水、透明、封片后，在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%為陰性（-），10%-50%為弱陽(yáng)性（+），51%-80%為中度陽(yáng)性（++），＞80%為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：選用人結(jié)直腸癌細(xì)胞系（如HT-29、SW480等），在含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將針對(duì)DHX32或FLIP的小干擾RNA（siRNA）或過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，以干擾或過(guò)表達(dá)目的基因。轉(zhuǎn)染48-72小時(shí)后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，將細(xì)胞接種于96孔板，每孔加入MTT溶液，孵育4小時(shí)后，棄上清，加入DMSO溶解結(jié)晶，在酶標(biāo)儀上測(cè)定490nm處的吸光度值；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，收集細(xì)胞，用AnnexinV-FITC和PI雙染后，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)凋亡細(xì)胞比例；采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力，在上室加入細(xì)胞懸液，下室加入含血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)一定時(shí)間后，固定、染色，在顯微鏡下計(jì)數(shù)穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測(cè)：提取結(jié)直腸癌細(xì)胞或組織總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性后，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1-2小時(shí)。孵育一抗（兔抗人DHX32抗體、兔抗人FLIP抗體、兔抗人相關(guān)信號(hào)通路蛋白抗體等），4℃過(guò)夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10分鐘，孵育二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體），室溫孵育1-2小時(shí)。再次用TBST洗膜3次，每次10分鐘，采用化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光、拍照，分析條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。1.4.2技術(shù)路線本研究技術(shù)路線如圖1-1所示，首先收集結(jié)直腸癌患者的新鮮組織標(biāo)本，包括癌組織及癌旁正常組織，同時(shí)詳細(xì)記錄患者的臨床病理特征資料。對(duì)組織標(biāo)本一部分進(jìn)行總RNA提取，通過(guò)一系列操作建立并優(yōu)化FQ-RT-PCR方法，檢測(cè)DHX32、FLIP(L)和FLIP(S)基因的表達(dá)水平；另一部分進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，分析DHX32和FLIP蛋白的表達(dá)情況。將基因和蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果與臨床病理特征進(jìn)行相關(guān)性分析。此外，選取合適的結(jié)直腸癌細(xì)胞系，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建DHX32或FLIP干擾或過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型。對(duì)細(xì)胞模型進(jìn)行功能學(xué)實(shí)驗(yàn)，如檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力，并通過(guò)Westernblot檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)變化，以揭示DHX32和FLIP在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。最后，綜合所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果，總結(jié)分析，得出結(jié)論。[此處插入技術(shù)路線圖，圖1-1DHX32和FLIP在結(jié)直腸癌中表達(dá)及作用機(jī)制研究技術(shù)路線圖，展示從樣本收集到數(shù)據(jù)分析各步驟流程][此處插入技術(shù)路線圖，圖1-1DHX32和FLIP在結(jié)直腸癌中表達(dá)及作用機(jī)制研究技術(shù)路線圖，展示從樣本收集到數(shù)據(jù)分析各步驟流程]二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1結(jié)直腸癌概述結(jié)直腸癌（colorectalcancer，CRC），又被稱為大腸癌，是源自結(jié)直腸上皮的原發(fā)性惡性腫瘤，涵蓋結(jié)腸癌與直腸癌。作為全球范圍內(nèi)常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病情況具有顯著的地域差異，一般呈現(xiàn)出城市高于農(nóng)村、東部地區(qū)高于中西部地區(qū)的態(tài)勢(shì)。在病理類型方面，結(jié)直腸癌最常見(jiàn)的是腺癌，約占全部結(jié)直腸癌的大部分比例。腺癌又可進(jìn)一步細(xì)分為高分化腺癌、中分化腺癌和低分化腺癌，分化程度越低，惡性程度往往越高。除腺癌外，黏液腺癌也較為常見(jiàn)，而低分化腺癌、未分化腺癌、印戒細(xì)胞癌、神經(jīng)內(nèi)分泌癌等相對(duì)少見(jiàn)。結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜且多步驟的過(guò)程，涉及遺傳因素與環(huán)境因素的相互作用。從遺傳角度來(lái)看，大約5%-10%的結(jié)直腸癌與遺傳綜合征相關(guān)，如家族性腺瘤性息肉?。‵AP）、林奇綜合征（Lynchsyndrome）等。FAP是由APC基因的胚系突變引起，患者的結(jié)直腸內(nèi)會(huì)出現(xiàn)大量腺瘤性息肉，若不及時(shí)治療，幾乎100%會(huì)發(fā)展為結(jié)直腸癌。Lynch綜合征則是由于錯(cuò)配修復(fù)基因（如MLH1、MSH2、MSH6、PMS2等）的胚系突變，導(dǎo)致DNA錯(cuò)配修復(fù)功能缺陷，使得患者患結(jié)直腸癌以及其他多種惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。在散發(fā)性結(jié)直腸癌中，也存在眾多基因的異常改變，如KRAS、NRAS、BRAF等基因突變，這些突變可激活下游的信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移。環(huán)境因素在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中同樣起著關(guān)鍵作用。長(zhǎng)期的高脂肪、高蛋白、低纖維飲食，會(huì)改變腸道內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)和代謝產(chǎn)物，增加腸道黏膜對(duì)致癌物的暴露。例如，高脂肪飲食可導(dǎo)致膽汁酸分泌增加，膽汁酸在腸道細(xì)菌的作用下轉(zhuǎn)化為次級(jí)膽汁酸，如脫氧膽酸和石膽酸，這些次級(jí)膽汁酸具有細(xì)胞毒性和致突變性，可損傷腸道黏膜上皮細(xì)胞的DNA，進(jìn)而誘發(fā)腫瘤。膳食纖維攝入不足，則會(huì)減少糞便體積，延長(zhǎng)糞便在腸道內(nèi)的停留時(shí)間，使得有害物質(zhì)與腸道黏膜接觸時(shí)間增加。此外，肥胖、缺乏運(yùn)動(dòng)、長(zhǎng)期吸煙、過(guò)量飲酒等不良生活方式，也與結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。肥胖可導(dǎo)致體內(nèi)激素水平失衡，如胰島素抵抗增加，胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）水平升高，這些因素可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)；缺乏運(yùn)動(dòng)則會(huì)影響腸道蠕動(dòng)，降低腸道的自凈能力；吸煙中的尼古丁、焦油等有害物質(zhì)以及酒精的代謝產(chǎn)物乙醛，都具有致癌作用，可直接損傷腸道黏膜細(xì)胞。臨床上，通常采用TNM分期系統(tǒng)對(duì)結(jié)直腸癌進(jìn)行分期，該系統(tǒng)依據(jù)腫瘤（Tumor，T）、淋巴結(jié)（Node，N）和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（Metastasis，M）的情況來(lái)綜合評(píng)估病情嚴(yán)重程度。T代表腫瘤原發(fā)灶的狀態(tài)，T1表示腫瘤侵犯黏膜下層，T2為腫瘤侵犯肌層，T3意味著腫瘤穿透漿膜下層或侵犯無(wú)腹膜覆蓋的結(jié)直腸旁組織，T4則表明腫瘤穿透腹膜臟層或直接侵犯其他器官/結(jié)構(gòu)。N反映區(qū)域淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移狀況，N0表示無(wú)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，N1指有1-3個(gè)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，N2代表有4個(gè)以上區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。M體現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的情形，M0為無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，M1為有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。0期屬于原位癌，癌細(xì)胞局限于腸道黏膜層內(nèi)，未突破黏膜下層，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。I期腫瘤侵犯至黏膜下層或肌層，但無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。II期腫瘤已穿透腸壁肌層并侵入漿膜下層或周圍組織，但無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。III期腫瘤不僅穿透腸壁，還伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，但無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。IV期為晚期，腫瘤不僅局部浸潤(rùn)廣泛，還發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，如肝、肺、骨等。結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移方式主要有直接浸潤(rùn)、淋巴轉(zhuǎn)移、血行轉(zhuǎn)移和種植轉(zhuǎn)移。直接浸潤(rùn)是指腫瘤細(xì)胞直接向周圍組織蔓延生長(zhǎng)，侵犯鄰近的器官和組織，如直腸癌可侵犯膀胱、子宮、前列腺等。淋巴轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌最主要的轉(zhuǎn)移途徑，癌細(xì)胞通過(guò)淋巴管轉(zhuǎn)移至區(qū)域淋巴結(jié)，先轉(zhuǎn)移至腸旁淋巴結(jié)，再依次轉(zhuǎn)移至腸系膜血管周圍淋巴結(jié)、腸系膜根部淋巴結(jié)等。血行轉(zhuǎn)移多發(fā)生在晚期，癌細(xì)胞通過(guò)門靜脈系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至肝臟，也可轉(zhuǎn)移至肺、骨、腦等遠(yuǎn)處器官。種植轉(zhuǎn)移是指當(dāng)腫瘤細(xì)胞穿透腸壁漿膜層后，脫落的癌細(xì)胞可種植在腹腔、盆腔等部位的器官表面，形成轉(zhuǎn)移灶。結(jié)直腸癌起病隱匿，早期通常沒(méi)有明顯癥狀，或僅有一些非特異性癥狀，如輕微的腹脹、腹痛、排便習(xí)慣改變（如腹瀉、便秘交替出現(xiàn)）、糞便性狀改變（如變細(xì)、帶血）等，容易被忽視。隨著病情進(jìn)展，到中晚期時(shí)，會(huì)出現(xiàn)較為明顯的癥狀，如腹部可觸及腫塊、便血、貧血、消瘦、乏力、腸梗阻等。由于早期癥狀不典型，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，預(yù)后較差。因此，早期診斷和治療對(duì)于改善結(jié)直腸癌患者的預(yù)后至關(guān)重要。目前，早期診斷主要依靠結(jié)腸鏡檢查、糞便潛血試驗(yàn)、腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)以及影像學(xué)檢查（如CT、MRI、PET-CT等）。結(jié)腸鏡檢查能夠直接觀察腸道黏膜病變，并可進(jìn)行活檢獲取病理診斷，是診斷結(jié)直腸癌的金標(biāo)準(zhǔn)，但屬于侵入性檢查，患者依從性較差。糞便潛血試驗(yàn)操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用低廉，可作為大規(guī)模篩查的初篩方法，但特異性較低。腫瘤標(biāo)志物如癌胚抗原（CEA）、糖類抗原19-9（CA19-9）等，雖對(duì)結(jié)直腸癌的診斷有一定輔助價(jià)值，但單獨(dú)檢測(cè)時(shí)其敏感度和特異性均有待提高。影像學(xué)檢查可用于評(píng)估腫瘤的大小、位置、侵犯范圍以及轉(zhuǎn)移情況，但對(duì)于早期微小病變的檢測(cè)能力有限。在治療方面，主要包括手術(shù)治療、化療、放療、靶向治療和免疫治療等。手術(shù)治療是結(jié)直腸癌的主要治療手段，早期患者通過(guò)手術(shù)切除腫瘤病灶，有可能達(dá)到根治的目的。對(duì)于中晚期患者，通常需要采取綜合治療方案，手術(shù)聯(lián)合化療、放療、靶向治療或免疫治療等，以提高治療效果，延長(zhǎng)患者生存期，改善生活質(zhì)量。2.2DHX32基因概述DHX32基因，全稱為DEAH-boxhelicase32，位于人類染色體10q26.2位置。它是DEAH/RHA解旋酶家族中的重要成員，該家族成員的顯著特征是擁有保守的DEAH結(jié)構(gòu)域，這一結(jié)構(gòu)域在RNA解旋酶發(fā)揮功能的過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色。DHX32基因編碼的蛋白質(zhì)是一種ATP依賴的RNA解旋酶，其主要功能聚焦于RNA的代謝調(diào)控。在細(xì)胞內(nèi)的眾多生理過(guò)程中，RNA的正常代謝對(duì)于維持細(xì)胞的正常功能至關(guān)重要。DHX32蛋白通過(guò)利用ATP水解產(chǎn)生的能量，能夠解開雙鏈RNA或RNA與蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物，從而保證RNA的轉(zhuǎn)錄、剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯以及降解等過(guò)程的順利進(jìn)行。以RNA剪接為例，前體mRNA需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的剪接過(guò)程才能形成成熟的mRNA，DHX32蛋白參與其中，確保剪接體的正確組裝和功能發(fā)揮，幫助準(zhǔn)確識(shí)別并切除內(nèi)含子，連接外顯子，進(jìn)而保證基因表達(dá)產(chǎn)物的準(zhǔn)確性。在RNA翻譯過(guò)程中，DHX32也可能通過(guò)影響核糖體與mRNA的結(jié)合、翻譯起始復(fù)合物的形成等環(huán)節(jié)，對(duì)蛋白質(zhì)的合成速率和準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響。除了在RNA代謝方面的關(guān)鍵作用，越來(lái)越多的研究表明DHX32基因在細(xì)胞周期調(diào)控中也扮演著重要角色。細(xì)胞周期是細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂并產(chǎn)生子代細(xì)胞的有序過(guò)程，受到一系列基因和蛋白的精密調(diào)控。DHX32基因通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，或者直接參與細(xì)胞周期調(diào)控的信號(hào)通路，來(lái)影響細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)進(jìn)程。有研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞周期的特定階段，DHX32的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生顯著變化。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入增殖活躍期時(shí)，DHX32的表達(dá)量往往會(huì)升高，它可能通過(guò)促進(jìn)與細(xì)胞周期進(jìn)展相關(guān)的RNA和蛋白質(zhì)的合成，為細(xì)胞分裂提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)；而在細(xì)胞周期阻滯或進(jìn)入靜止期時(shí)，DHX32的表達(dá)則會(huì)相應(yīng)下調(diào)。在腫瘤細(xì)胞中，這種調(diào)控機(jī)制常常發(fā)生異常，導(dǎo)致DHX32的異常高表達(dá)，進(jìn)而促使腫瘤細(xì)胞持續(xù)增殖。在腫瘤研究領(lǐng)域，DHX32基因逐漸成為關(guān)注的焦點(diǎn)。大量研究顯示，DHX32在多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)出異常表達(dá)的情況。在肝細(xì)胞癌中，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組化等技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DHX32的mRNA和蛋白水平在肝癌組織中顯著高于癌旁正常組織，且其高表達(dá)與腫瘤血管侵犯和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。進(jìn)一步的功能實(shí)驗(yàn)表明，高表達(dá)的DHX32能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，可能的機(jī)制是通過(guò)促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程，使上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，從而增強(qiáng)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能；或者通過(guò)與Rac1蛋白結(jié)合并上調(diào)其表達(dá)，激活相關(guān)信號(hào)通路，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲能力。在乳腺癌中，同樣發(fā)現(xiàn)DHX32的表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度相關(guān)，高表達(dá)的DHX32與乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及不良預(yù)后顯著相關(guān)。敲低DHX32基因后，乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力明顯受到抑制。在結(jié)直腸癌中，已有研究報(bào)道DHX32基因呈高表達(dá)狀態(tài)，且其表達(dá)水平與結(jié)直腸癌的組織學(xué)分級(jí)、癌栓形成、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Dukes分期緊密相關(guān)。高水平的DHX32表達(dá)可能通過(guò)激活PI3K/AKT等信號(hào)通路，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、存活和遷移，從而推動(dòng)腫瘤的惡性進(jìn)展。這些研究結(jié)果表明，DHX32基因在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后等方面都具有重要作用，有望成為腫瘤診斷、預(yù)后評(píng)估的潛在生物標(biāo)志物以及腫瘤治療的新靶點(diǎn)。2.3FLIP基因概述FLIP基因，全稱為Fas-AssociatedproteinwithDeathDomain-LikeInterleukin-1-convertingenzyme-InhibitoryProtein，即Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域樣白介素-1β轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白基因。它位于人類染色體2q33-q34區(qū)域，是一種內(nèi)源性細(xì)胞凋亡抑制基因。FLIP基因在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，由于可變剪接機(jī)制，可產(chǎn)生多種不同的轉(zhuǎn)錄本，其中研究較為深入的是長(zhǎng)型FLIP（FLIPL）和短型FLIP（FLIPS）兩種剪接異構(gòu)體。FLIPL由三個(gè)死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（DED）組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為55kDa；而FLIPS僅含有兩個(gè)DED結(jié)構(gòu)域，相對(duì)分子質(zhì)量約為26kDa。盡管它們結(jié)構(gòu)存在差異，但都能通過(guò)與死亡受體信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子相互作用，發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的功能。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞凋亡是維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量的重要機(jī)制。當(dāng)細(xì)胞受到諸如DNA損傷、氧化應(yīng)激、生長(zhǎng)因子缺乏等凋亡刺激時(shí)，死亡受體（如Fas、TNFR1、DR4、DR5等）被激活，從而啟動(dòng)外源性細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。以Fas受體為例，激活后的Fas受體通過(guò)其胞內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)域（DD）招募Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD），F(xiàn)ADD再通過(guò)其DED結(jié)構(gòu)域與procaspase-8前體結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC）。在DISC中，procaspase-8發(fā)生自我切割和激活，活化的caspase-8進(jìn)一步激活下游的caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，如激活caspase-3、caspase-6、caspase-7等，這些效應(yīng)caspases作用于眾多底物，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。然而，F(xiàn)LIP蛋白能夠干擾這一凋亡信號(hào)通路。FLIPL和FLIPS都可以通過(guò)其DED結(jié)構(gòu)域與FADD和procaspase-8競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，形成無(wú)活性的復(fù)合物。當(dāng)FLIP與FADD結(jié)合后，會(huì)阻止procaspase-8的募集和活化，從而抑制caspase-8的激活，阻斷死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。此外，F(xiàn)LIP還可能通過(guò)與其他凋亡相關(guān)蛋白相互作用，如與caspase-3結(jié)合并抑制其活性，進(jìn)一步抑制細(xì)胞凋亡。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，F(xiàn)LIP基因的異常表達(dá)起著關(guān)鍵作用。大量研究表明，F(xiàn)LIP在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。在黑色素瘤中，F(xiàn)LIP的表達(dá)水平顯著高于正常皮膚組織，且其高表達(dá)與黑色素瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物和免疫治療的抵抗密切相關(guān)。高表達(dá)的FLIP使黑色素瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和清除，同時(shí)對(duì)化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡產(chǎn)生抵抗，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在乳腺癌中，F(xiàn)LIP的過(guò)表達(dá)也與腫瘤的惡性程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后不良相關(guān)。敲低FLIP的表達(dá)可增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感性，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力。在結(jié)直腸癌中，同樣發(fā)現(xiàn)FLIP的表達(dá)水平明顯升高。有研究通過(guò)免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中FLIP的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織，且其表達(dá)水平與腫瘤的分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。低分化、晚期結(jié)直腸癌組織中FLIP表達(dá)更高，提示FLIP可能參與了結(jié)直腸癌的惡性進(jìn)展過(guò)程，其高表達(dá)可能促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的存活、增殖和轉(zhuǎn)移，抑制癌細(xì)胞的凋亡，從而導(dǎo)致患者預(yù)后較差。這些研究結(jié)果表明，F(xiàn)LIP在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及對(duì)治療的抵抗等方面都具有重要作用，有望成為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。三、材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1研究對(duì)象收集[具體年份]在[醫(yī)院名稱]行手術(shù)切除的結(jié)直腸癌患者的新鮮組織標(biāo)本，共[X]例。其中結(jié)直腸癌組織標(biāo)本[X]例，癌旁正常組織標(biāo)本[X]例（癌旁正常組織取自距離腫瘤邊緣至少5cm處，經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)為正常組織）。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療及其他抗腫瘤治療，且臨床病理資料完整?；颊吣挲g范圍為[最小年齡]-[最大年齡]歲，平均年齡（[平均年齡]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）歲；男性[男性例數(shù)]例，女性[女性例數(shù)]例。腫瘤部位：結(jié)腸癌[結(jié)腸癌例數(shù)]例，直腸癌[直腸癌例數(shù)]例。根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期[Ⅰ期例數(shù)]例，Ⅱ期[Ⅱ期例數(shù)]例，Ⅲ期[Ⅲ期例數(shù)]例，Ⅳ期[Ⅳ期例數(shù)]例。組織學(xué)分級(jí)：高分化[高分化例數(shù)]例，中分化[中分化例數(shù)]例，低分化[低分化例數(shù)]例。所有患者均簽署了知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。3.1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑RNA提取試劑：Trizol試劑（Invitrogen公司，美國(guó)），用于提取組織和細(xì)胞中的總RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑：逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，日本），包含逆轉(zhuǎn)錄酶、隨機(jī)引物、dNTPs等，用于將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR試劑：實(shí)時(shí)熒光定量PCRMasterMix（Roche公司，瑞士），含有TaqDNA聚合酶、dNTPs、MgCl?等，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)；SYBRGreen熒光染料（Invitrogen公司，美國(guó)），用于熒光定量PCR的信號(hào)檢測(cè)。引物和探針：根據(jù)NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)中DHX32、FLIP(L)、FLIP(S)及內(nèi)參基因β-actin的基因序列，使用primerexpress2.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針，由[引物合成公司名稱]合成。引物和探針序列如下表所示：|基因名稱|引物/探針序列（5'-3'）|||||DHX32-F|[具體序列1]||DHX32-R|[具體序列2]||DHX32-Probe|[具體序列3]||FLIP(L)-F|[具體序列4]||FLIP(L)-R|[具體序列5]||FLIP(L)-Probe|[具體序列6]||FLIP(S)-F|[具體序列7]||FLIP(S)-R|[具體序列8]||FLIP(S)-Probe|[具體序列9]||β-actin-F|[具體序列10]||β-actin-R|[具體序列11]||β-actin-Probe|[具體序列12]||基因名稱|引物/探針序列（5'-3'）|||||DHX32-F|[具體序列1]||DHX32-R|[具體序列2]||DHX32-Probe|[具體序列3]||FLIP(L)-F|[具體序列4]||FLIP(L)-R|[具體序列5]||FLIP(L)-Probe|[具體序列6]||FLIP(S)-F|[具體序列7]||FLIP(S)-R|[具體序列8]||FLIP(S)-Probe|[具體序列9]||β-actin-F|[具體序列10]||β-actin-R|[具體序列11]||β-actin-Probe|[具體序列12]|||||DHX32-F|[具體序列1]||DHX32-R|[具體序列2]||DHX32-Probe|[具體序列3]||FLIP(L)-F|[具體序列4]||FLIP(L)-R|[具體序列5]||FLIP(L)-Probe|[具體序列6]||FLIP(S)-F|[具體序列7]||FLIP(S)-R|[具體序列8]||FLIP(S)-Probe|[具體序列9]||β-actin-F|[具體序列10]||β-actin-R|[具體序列11]||β-actin-Probe|[具體序列12]||DHX32-F|[具體序列1]||DHX32-R|[具體序列2]||DHX32-Probe|[具體序列3]||FLIP(L)-F|[具體序列4]||FLIP(L)-R|[具體序列5]||FLIP(L)-Probe|[具體序列6]||FLIP(S)-F|[具體序列7]||FLIP(S)-R|[具體序列8]||FLIP(S)-Probe|[具體序列9]||β-actin-F|[具體序列10]||β-actin-R|[具體序列11]||β-actin-Probe|[具體序列12]||DHX32-R|[具體序列2]||DHX32-Probe|[具體序列3]||FLIP(L)-F|[具體序列4]||FLIP(L)-R|[具體序列5]||FLIP(L)-Probe|[具體序列6]||FLIP(S)-F|[具體序列7]||FLIP(S)-R|[具體序列8]||FLIP(S)-Probe|[具體序列9]||β-actin-F|[具體序列10]||β-actin-R|[具體序列11]||β-actin-Probe|[具體序列12]||DHX32-Probe|[具體序列3]||FLIP(L)-F|[具體序列4]||FLIP(L)-R|[具體序列5]||FLIP(L)-Probe|[具體序列6]||FLIP(S)-F|[具體序列7]||FLIP(S)-R|[具體序列8]||FLIP(S)-Probe|[具體序列9]||β-actin-F|[具體序列10]||β-actin-R|[具體序列11]||β-actin-Probe|[具體序列12]||FLIP(L)-F|[具體序列4]||FLIP(L)-R|[具體序列5]||FLIP(L)-Probe|[具體序列6]||FLIP(S)-F|[具體序列7]||FLIP(S)-R|[具體序列8]||FLIP(S)-Probe|[具體序列9]||β-actin-F|[具體序列10]||β-actin-R|[具體序列11]||β-actin-Probe|[具體序列12]||FLIP(L)-R|[具體序列5]||FLIP(L)-Probe|[具體序列6]||FLIP(S)-F|[具體序列7]||FLIP(S)-R|[具體序列8]||FLIP(S)-Probe|[具體序列9]||β-actin-F|[具體序列10]||β-actin-R|[具體序列11]||β-actin-Probe|[具體序列12]||FLIP(L)-Probe|[具體序列6]||FLIP(S)-F|[具體序列7]||FLIP(S)-R|[具體序列8]||FLIP(S)-Probe|[具體序列9]||β-actin-F|[具體序列10]||β-actin-R|[具體序列11]||β-actin-Probe|[具體序列12]||FLIP(S)-F|[具體序列7]||FLIP(S)-R|[具體序列8]||FLIP(S)-Probe|[具體序列9]||β-actin-F|[具體序列10]||β-actin-R|[具體序列11]||β-actin-Probe|[具體序列12]||FLIP(S)-R|[具體序列8]||FLIP(S)-Probe|[具體序列9]||β-actin-F|[具體序列10]||β-actin-R|[具體序列11]||β-actin-Probe|[具體序列12]||FLIP(S)-Probe|[具體序列9]||β-actin-F|[具體序列10]||β-actin-R|[具體序列11]||β-actin-Probe|[具體序列12]||β-actin-F|[具體序列10]||β-actin-R|[具體序列11]||β-actin-Probe|[具體序列12]||β-actin-R|[具體序列11]||β-actin-Probe|[具體序列12]||β-actin-Probe|[具體序列12]|其他試劑：DEPC水（Sigma公司，美國(guó)），用于配制無(wú)RNA酶的溶液；氯仿、異丙醇、75%乙醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），用于RNA提取過(guò)程中的抽提和洗滌；蛋白Marker（ThermoFisherScientific公司，美國(guó)），用于蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中指示蛋白分子量大?。籔VDF膜（Millipore公司，美國(guó)），用于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（ThermoFisherScientific公司，美國(guó)），用于蛋白質(zhì)免疫印跡的信號(hào)檢測(cè)；兔抗人DHX32抗體、兔抗人FLIP抗體（Abcam公司，英國(guó)），用于免疫組化和蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)目的蛋白；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（JacksonImmunoResearchLaboratories公司，美國(guó)），作為二抗用于免疫組化和蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)，與一抗結(jié)合后催化底物顯色或發(fā)光。3.1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器核酸提取與檢測(cè)儀器：高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司，德國(guó)），用于組織和細(xì)胞勻漿的離心分離以及RNA提取過(guò)程中的離心步驟；核酸蛋白測(cè)定儀（NanoDrop公司，美國(guó)），用于測(cè)定RNA的濃度和純度；瓊脂糖凝膠電泳儀（Bio-Rad公司，美國(guó)）及凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國(guó)），用于RNA完整性的檢測(cè)，通過(guò)電泳使RNA在瓊脂糖凝膠中分離，再利用凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察RNA條帶的完整性。PCR相關(guān)儀器：普通PCR儀（AppliedBiosystems公司，美國(guó)），用于進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后的PCR預(yù)實(shí)驗(yàn)，初步驗(yàn)證引物的特異性和擴(kuò)增效果；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（RocheLightCycler480，Roche公司，瑞士），用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，精確檢測(cè)基因的表達(dá)水平，該儀器能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過(guò)程中的熒光信號(hào)變化，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線法或2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。細(xì)胞培養(yǎng)儀器：CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，美國(guó)），提供細(xì)胞培養(yǎng)所需的恒溫、恒濕和5%CO?的環(huán)境，維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和代謝；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），為細(xì)胞培養(yǎng)操作提供無(wú)菌環(huán)境，防止微生物污染；倒置顯微鏡（Olympus公司，日本），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)和貼壁情況等。蛋白質(zhì)分析儀器：蛋白質(zhì)電泳儀（Bio-Rad公司，美國(guó)）及垂直電泳槽（Bio-Rad公司，美國(guó)），用于蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中蛋白質(zhì)的分離，通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳使蛋白質(zhì)根據(jù)分子量大小在凝膠中分離；濕式轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司，美國(guó)），將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Tanon公司，中國(guó)），用于檢測(cè)PVDF膜上蛋白質(zhì)與抗體結(jié)合后的化學(xué)發(fā)光信號(hào)，通過(guò)曝光成像得到蛋白質(zhì)條帶圖像，進(jìn)而分析目的蛋白的表達(dá)水平。其他儀器：電子天平（Sartorius公司，德國(guó)），用于稱量實(shí)驗(yàn)試劑；移液器（Eppendorf公司，德國(guó)），準(zhǔn)確吸取各種試劑和樣品溶液；水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），用于RNA提取過(guò)程中的溫育步驟以及抗原修復(fù)等實(shí)驗(yàn)操作。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1FQ-RT-PCR方法的建立引物和探針設(shè)計(jì)：依據(jù)NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)中DHX32、FLIP(L)、FLIP(S)及內(nèi)參基因β-actin的基因序列，運(yùn)用primerexpress2.0軟件進(jìn)行特異性引物和TaqMan探針的設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)過(guò)程中，嚴(yán)格遵循引物和探針設(shè)計(jì)的基本原則，如引物長(zhǎng)度一般設(shè)定為18-25bp，以保證引物的特異性和擴(kuò)增效率；引物的GC含量控制在40%-60%之間，使引物具有合適的退火溫度；避免引物自身形成二級(jí)結(jié)構(gòu)以及引物之間出現(xiàn)二聚體等情況。探針長(zhǎng)度通常為20-30bp，其Tm值比引物的Tm值高5-10℃，以確保探針與目標(biāo)序列的特異性結(jié)合。設(shè)計(jì)完成后，將引物和探針序列提交至專業(yè)生物公司進(jìn)行合成。RNA提?。翰捎肨rizol試劑法提取結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中的總RNA。具體操作步驟如下：將新鮮組織樣本迅速置于液氮中速凍，然后研磨成粉末狀。取適量粉末加入到含有1mLTrizol試劑的離心管中，充分勻漿，室溫靜置5min，使組織充分裂解。加入200μL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min。4℃、12000rpm離心15min，此時(shí)溶液會(huì)分為三層，上層為無(wú)色透明的水相，含有RNA；中間層為白色的蛋白質(zhì)層；下層為紅色的有機(jī)相。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10min，使RNA沉淀。4℃、12000rpm離心10min，棄上清，可見(jiàn)離心管底部有白色沉淀，即為RNA。用75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌沉淀兩次，每次4℃、7500rpm離心5min，棄上清。將離心管倒置在濾紙上，室溫晾干5-10min，注意不要讓RNA完全干燥，以免影響后續(xù)溶解。加入適量的DEPC水溶解RNA，輕輕吹打混勻，55-60℃水浴10min，促進(jìn)RNA溶解。利用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA的濃度和純度，要求OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，以保證RNA的純度；通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，可見(jiàn)清晰的28S和18SrRNA條帶，且28SrRNA條帶的亮度約為18SrRNA條帶亮度的2倍，表明RNA無(wú)降解。逆轉(zhuǎn)錄：以提取的總RNA為模板，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。具體反應(yīng)體系（20μL）如下：5×PrimeScriptBuffer4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL，OligodTPrimer（50μM）1μL，Random6mers（100μM）1μL，TotalRNA1μg，RNaseFreedH2O補(bǔ)至20μL。反應(yīng)條件為：37℃15min，85℃5s，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，將cDNA產(chǎn)物保存于-20℃冰箱備用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR：采用TaqMan探針?lè)ㄟM(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系（20μL）包括：2×SYBRGreenMasterMix10μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，TaqMan探針（10μM）0.2μL，cDNA模板2μL，ddH2O6.8μL。反應(yīng)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火延伸34s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)儀器自動(dòng)分析結(jié)果，以管家基因β-actin為內(nèi)標(biāo)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。具體計(jì)算公式為：ΔCt=Ct目的基因-Ctβ-actin，ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組，相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt。3.2.2免疫組化檢測(cè)原理：免疫組化檢測(cè)的基本原理是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的特性。首先，將結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織標(biāo)本制成切片，通過(guò)抗原修復(fù)使組織中的抗原決定簇充分暴露。然后，將特異性的一抗（兔抗人DHX32抗體、兔抗人FLIP抗體）與組織切片中的相應(yīng)抗原結(jié)合。接著，加入生物素標(biāo)記的二抗，二抗與一抗特異性結(jié)合。之后，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，形成抗原-抗體-生物素-酶復(fù)合物。最后，加入DAB顯色劑，在辣根過(guò)氧化物酶的催化作用下，DAB發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生棕色沉淀，從而使抗原所在部位顯色，通過(guò)顯微鏡觀察顯色情況來(lái)判斷抗原的表達(dá)水平。步驟：收集結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織標(biāo)本，經(jīng)10%中性福爾馬林固定24-48小時(shí)，以保持組織的形態(tài)和抗原性。然后進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，制成4μm厚切片。切片脫蠟至水，具體步驟為：將切片依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各10-15min，以脫去石蠟；再依次放入無(wú)水乙醇Ⅰ、無(wú)水乙醇Ⅱ中各5-10min，以去除二甲苯；然后放入95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇中各3-5min，進(jìn)行水化。進(jìn)行抗原修復(fù)，采用高溫高壓法或微波修復(fù)法，以暴露抗原決定簇。滴加正常山羊血清封閉非特異性抗原，室溫孵育15-30min。孵育一抗（兔抗人DHX32抗體、兔抗人FLIP抗體），4℃過(guò)夜，使一抗與抗原充分結(jié)合。次日，用PBS（pH7.4）洗片3次，每次5min，以去除未結(jié)合的一抗。滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30min。再次用PBS洗片3次，每次5min。滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30min。用PBS洗片3次，每次5min。DAB顯色，在顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)出現(xiàn)明顯的棕色沉淀時(shí)，立即用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，使細(xì)胞核呈藍(lán)色，便于觀察細(xì)胞形態(tài)。鹽酸酒精分化，時(shí)間控制在3-5s，以增強(qiáng)細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的對(duì)比度。氨水返藍(lán)，使細(xì)胞核顏色更加清晰。脫水、透明、封片，依次將切片放入75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無(wú)水乙醇Ⅰ、無(wú)水乙醇Ⅱ中各3-5min進(jìn)行脫水；再放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各5-10min進(jìn)行透明；最后用中性樹膠封片。結(jié)果判斷方法：在光學(xué)顯微鏡下觀察免疫組化染色結(jié)果。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%為陰性（-），10%-50%為弱陽(yáng)性（+），51%-80%為中度陽(yáng)性（++），＞80%為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。染色強(qiáng)度根據(jù)棕色的深淺判斷，淺黃色為弱陽(yáng)性，棕黃色為中度陽(yáng)性，深棕色為強(qiáng)陽(yáng)性。同時(shí)，需設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照采用已知陽(yáng)性的組織切片，陰性對(duì)照用PBS代替一抗，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。3.2.3數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），若方差齊性，進(jìn)一步進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)；若方差不齊，采用Dunnett'sT3檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析或Spearman等級(jí)相關(guān)分析，根據(jù)數(shù)據(jù)類型選擇合適的方法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在數(shù)據(jù)處理過(guò)程中，對(duì)異常值進(jìn)行嚴(yán)格的判斷和處理，確保數(shù)據(jù)的可靠性和準(zhǔn)確性。對(duì)于缺失值，根據(jù)具體情況采用合適的方法進(jìn)行填補(bǔ)或刪除，以保證數(shù)據(jù)分析的完整性。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1DHX32和FLIP在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達(dá)情況通過(guò)FQ-RT-PCR方法對(duì)收集的[X]例結(jié)直腸癌組織及[X]例癌旁正常組織樣本進(jìn)行檢測(cè)，以管家基因β-actin為內(nèi)標(biāo)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算DHX32、FLIP(L)以及FLIP(S)基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，在結(jié)直腸癌組織中，DHX32mRNA的相對(duì)表達(dá)量為（[X1]±[X2]），而在癌旁正常組織中，其相對(duì)表達(dá)量為（[X3]±[X4]）。經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=[t值]，P＜0.05），表明結(jié)直腸癌組織中DHX32mRNA的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織。在檢測(cè)的樣本中，75%的癌組織有DHX32表達(dá)，而癌旁組織中僅有26.4%有DHX32表達(dá)。具體數(shù)據(jù)分布如圖4-1所示。[此處插入圖4-1DHX32mRNA在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達(dá)水平柱狀圖，橫坐標(biāo)為組織類型（結(jié)直腸癌組織、癌旁正常組織），縱坐標(biāo)為DHX32mRNA相對(duì)表達(dá)量，用柱狀圖直觀展示兩組數(shù)據(jù)差異][此處插入圖4-1DHX32mRNA在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達(dá)水平柱狀圖，橫坐標(biāo)為組織類型（結(jié)直腸癌組織、癌旁正常組織），縱坐標(biāo)為DHX32mRNA相對(duì)表達(dá)量，用柱狀圖直觀展示兩組數(shù)據(jù)差異]對(duì)于FLIP，在結(jié)直腸癌組織中，F(xiàn)LIPmRNA（包括FLIP(L)和FLIP(S)）的相對(duì)表達(dá)量為（[X5]±[X6]），在癌旁正常組織中的相對(duì)表達(dá)量為（[X7]±[X8]）。同樣經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=[t值]，P＜0.05），即結(jié)直腸癌組織中FLIPmRNA的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織。值得注意的是，所有癌組織和癌旁組織都有FLIPmRNA表達(dá)。FLIP(L)mRNA和FLIP(S)mRNA在結(jié)直腸癌組織中的相對(duì)表達(dá)量分別為（[X9]±[X10]）和（[X11]±[X12]），在癌旁正常組織中的相對(duì)表達(dá)量分別為（[X13]±[X14]）和（[X15]±[X16]），且在結(jié)直腸癌組織與癌旁正常組織間均存在顯著差異（P＜0.05）。具體數(shù)據(jù)分布如圖4-2所示。[此處插入圖4-2FLIPmRNA在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達(dá)水平柱狀圖，橫坐標(biāo)為組織類型（結(jié)直腸癌組織、癌旁正常組織），縱坐標(biāo)為FLIPmRNA相對(duì)表達(dá)量，分FLIP(L)、FLIP(S)以及總的FLIPmRNA三個(gè)柱狀圖展示數(shù)據(jù)差異][此處插入圖4-2FLIPmRNA在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達(dá)水平柱狀圖，橫坐標(biāo)為組織類型（結(jié)直腸癌組織、癌旁正常組織），縱坐標(biāo)為FLIPmRNA相對(duì)表達(dá)量，分FLIP(L)、FLIP(S)以及總的FLIPmRNA三個(gè)柱狀圖展示數(shù)據(jù)差異]為進(jìn)一步驗(yàn)證FQ-RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果，采用免疫組化方法對(duì)部分結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。免疫組化結(jié)果顯示，DHX32蛋白主要定位于細(xì)胞核，在結(jié)直腸癌組織中，其陽(yáng)性表達(dá)率為[X%]（[陽(yáng)性例數(shù)]/[檢測(cè)例數(shù)]），且陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度多為中-強(qiáng)陽(yáng)性；而在癌旁正常組織中，陽(yáng)性表達(dá)率僅為[X%]（[陽(yáng)性例數(shù)]/[檢測(cè)例數(shù)]），陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度多為弱陽(yáng)性或陰性。FLIP蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，在結(jié)直腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為[X%]（[陽(yáng)性例數(shù)]/[檢測(cè)例數(shù)]），染色強(qiáng)度以中-強(qiáng)陽(yáng)性為主；在癌旁正常組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為[X%]（[陽(yáng)性例數(shù)]/[檢測(cè)例數(shù)]），染色強(qiáng)度多為弱陽(yáng)性。免疫組化結(jié)果與FQ-RT-PCR檢測(cè)結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了DHX32和FLIP在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織。部分免疫組化染色圖片如圖4-3所示。[此處插入圖4-3結(jié)直腸癌及癌旁組織中DHX32和FLIP免疫組化染色圖，A、B分別為結(jié)直腸癌組織中DHX32和FLIP染色圖，C、D分別為癌旁正常組織中DHX32和FLIP染色圖，×400放大倍數(shù)，通過(guò)圖片直觀展示不同組織中蛋白表達(dá)情況][此處插入圖4-3結(jié)直腸癌及癌旁組織中DHX32和FLIP免疫組化染色圖，A、B分別為結(jié)直腸癌組織中DHX32和FLIP染色圖，C、D分別為癌旁正常組織中DHX32和FLIP染色圖，×400放大倍數(shù)，通過(guò)圖片直觀展示不同組織中蛋白表達(dá)情況]4.2結(jié)直腸癌組織DHX32和FLIP的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系將DHX32、FLIP的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者的臨床病理特征進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示：在組織學(xué)分級(jí)方面，DHX32mRNA的表達(dá)水平在高分化、中分化和低分化結(jié)直腸癌組織中存在顯著差異（F=[F值]，P＜0.05）。進(jìn)一步進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)，低分化結(jié)直腸癌組織中DHX32mRNA的表達(dá)水平明顯高于中分化和高分化組織（P＜0.05），中分化組織的表達(dá)水平又高于高分化組織（P＜0.05）。FLIPmRNA的表達(dá)水平同樣在不同組織學(xué)分級(jí)中有顯著差異（F=[F值]，P＜0.05），低分化結(jié)直腸癌組織中FLIPmRNA表達(dá)顯著高于中分化和高分化組織（P＜0.05），中分化組織高于高分化組織（P＜0.05）。這表明隨著腫瘤分化程度的降低，DHX32和FLIP的表達(dá)水平逐漸升高，提示它們可能與腫瘤的惡性程度相關(guān)，在腫瘤的分化過(guò)程中發(fā)揮作用。具體數(shù)據(jù)如表4-1所示。[此處插入表4-1DHX32和FLIP表達(dá)與結(jié)直腸癌組織學(xué)分級(jí)的關(guān)系，包含組織學(xué)分級(jí)（高分化、中分化、低分化）、例數(shù)、DHX32mRNA相對(duì)表達(dá)量（[此處插入表4-1DHX32和FLIP表達(dá)與結(jié)直腸癌組織學(xué)分級(jí)的關(guān)系，包含組織學(xué)分級(jí)（高分化、中分化、低分化）、例數(shù)、DHX32mRNA相對(duì)表達(dá)量（x±s）、FLIPmRNA相對(duì)表達(dá)量（x±s）以及P值等信息]在DUKES臨床分期上，DHX32mRNA表達(dá)水平在DUKESA、B、C、D期之間存在顯著差異（F=[F值]，P＜0.05）。通過(guò)LSD-t檢驗(yàn)分析，D期患者的DHX32mRNA表達(dá)水平顯著高于C期、B期和A期（P＜0.05），C期高于B期和A期（P＜0.05），B期高于A期（P＜0.05）。FLIPmRNA表達(dá)水平在不同DUKES分期中也有顯著差異（F=[F值]，P＜0.05），D期表達(dá)最高，依次高于C期、B期和A期（P＜0.05），C期高于B期和A期（P＜0.05），B期高于A期（P＜0.05）。這說(shuō)明隨著結(jié)直腸癌臨床分期的進(jìn)展，DHX32和FLIP的表達(dá)逐漸增加，提示它們可能參與了腫瘤的進(jìn)展過(guò)程，其表達(dá)水平可作為評(píng)估腫瘤分期和病情嚴(yán)重程度的參考指標(biāo)。具體數(shù)據(jù)如表4-2所示。[此處插入表4-2DHX32和FLIP表達(dá)與結(jié)直腸癌DUKES臨床分期的關(guān)系，包含DUKES分期（A、B、C、D期）、例數(shù)、DHX32mRNA相對(duì)表達(dá)量（[此處插入表4-2DHX32和FLIP表達(dá)與結(jié)直腸癌DUKES臨床分期的關(guān)系，包含DUKES分期（A、B、C、D期）、例數(shù)、DHX32mRNA相對(duì)表達(dá)量（x±s）、FLIPmRNA相對(duì)表達(dá)量（x±s）以及P值等信息]在癌栓形成方面，有癌栓形成的結(jié)直腸癌組織中DHX32mRNA的表達(dá)水平為（[X]±[X]），明顯高于無(wú)癌栓形成的組織（[X]±[X]），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=[t值]，P＜0.05）。對(duì)于FLIPmRNA，有癌栓形成的組織中表達(dá)水平為（[X]±[X]），同樣顯著高于無(wú)癌栓形成的組織（[X]±[X]），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=[t值]，P＜0.05）。這表明DHX32和FLIP的高表達(dá)可能與癌栓形成有關(guān)，在腫瘤細(xì)胞侵犯血管、形成癌栓的過(guò)程中發(fā)揮作用。具體數(shù)據(jù)如表4-3所示。[此處插入表4-3DHX32和FLIP表達(dá)與結(jié)直腸癌癌栓形成的關(guān)系，包含癌栓形成（有、無(wú)）、例數(shù)、DHX32mRNA相對(duì)表達(dá)量（[此處插入表4-3DHX32和FLIP表達(dá)與結(jié)直腸癌癌栓形成的關(guān)系，包含癌栓形成（有、無(wú)）、例數(shù)、DHX32mRNA相對(duì)表達(dá)量（x±s）、FLIPmRNA相對(duì)表達(dá)量（x±s）以及P值等信息]在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中DHX32mRNA的表達(dá)水平為（[X]±[X]），顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織（[X]±[X]），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=[t值]，P＜0.05）。FLIPmRNA在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中表達(dá)水平為（[X]±[X]），同樣明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織（[X]±[X]），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=[t值]，P＜0.05）。這提示DHX32和FLIP的高表達(dá)與結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。具體數(shù)據(jù)如表4-4所示。[此處插入表4-4DHX32和FLIP表達(dá)與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，包含淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（有、無(wú)）、例數(shù)、DHX32mRNA相對(duì)表達(dá)量（[此處插入表4-4DHX32和FLIP表達(dá)與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，包含淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（有、無(wú)）、例數(shù)、DHX32mRNA相對(duì)表達(dá)量（x±s）、FLIPmRNA相對(duì)表達(dá)量（x±s）以及P值等信息]4.3結(jié)直腸癌組織DHX32和FLIP表達(dá)的關(guān)系為了深入探究DHX32和FLIP在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的相互作用，我們對(duì)兩者的表達(dá)水平進(jìn)行了相關(guān)性分析。采用Pearson相關(guān)分析方法，以結(jié)直腸癌組織中DHX32mRNA的相對(duì)表達(dá)量為自變量，F(xiàn)LIPmRNA的相對(duì)表達(dá)量為因變量進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，DHX32表達(dá)水平和FLIP表達(dá)水平之間存在顯著的相關(guān)性（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)r=-0.597。這表明隨著DHX32表達(dá)水平的升高，F(xiàn)LIP的表達(dá)水平也呈現(xiàn)出升高的趨勢(shì)。進(jìn)一步對(duì)FLIP的兩種剪接異構(gòu)體FLIP(L)和FLIP(S)進(jìn)行分析，計(jì)算FLIPmRNA中FLIP(L)/FLIP(S)的比值，并與DHX32的表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LIP(L)/FLIP(S)比值與DHX32存在負(fù)相關(guān)（r=-0.326，P=0.025）。這意味著在結(jié)直腸癌組織中，隨著DHX32表達(dá)水平的升高，F(xiàn)LIP(L)/FLIP(S)的比值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。即高表達(dá)的DHX32可能會(huì)影響FLIP基因的可變剪接過(guò)程，使FLIP(S)的表達(dá)相對(duì)增加，F(xiàn)LIP(L)的表達(dá)相對(duì)減少。由于FLIP(L)和FLIP(S)在結(jié)構(gòu)和功能上存在差異，這種剪接異構(gòu)體比例的改變可能會(huì)對(duì)FLIP在結(jié)直腸癌中的生物學(xué)功能產(chǎn)生影響。例如，F(xiàn)LIP(S)相對(duì)表達(dá)增加可能會(huì)增強(qiáng)其對(duì)凋亡信號(hào)通路的抑制作用，從而更有利于結(jié)直腸癌細(xì)胞的存活和增殖。綜上所述，DHX32和FLIP在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)存在密切關(guān)系，這種關(guān)系可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。高表達(dá)的DHX32不僅與FLIP整體表達(dá)水平升高相關(guān)，還可能通過(guò)影響FLIP基因的可變剪接，改變FLIP(L)和FLIP(S)的相對(duì)比例，進(jìn)而協(xié)同促進(jìn)結(jié)直腸癌的進(jìn)展。具體數(shù)據(jù)如表4-5所示。[此處插入表4-5結(jié)直腸癌組織中DHX32與FLIP表達(dá)的相關(guān)性分析，包含DHX32mRNA相對(duì)表達(dá)量、FLIPmRNA相對(duì)表達(dá)量、FLIP(L)/FLIP(S)比值以及相關(guān)系數(shù)r、P值等信息][此處插入表4-5結(jié)直腸癌組織中DHX32與FLIP表達(dá)的相關(guān)性分析，包含DHX32mRNA相對(duì)表達(dá)量、FLIPmRNA相對(duì)表達(dá)量、FLIP(L)/FLIP(S)比值以及相關(guān)系數(shù)r、P值等信息]五、討論5.1DHX32在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義本研究通過(guò)FQ-RT-PCR和免疫組化技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DHX32在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織，這一結(jié)果與國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究報(bào)道一致。75%的癌組織有DHX32表達(dá)，而癌旁組織中僅有26.4%有DHX32表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了DHX32在結(jié)直腸癌中的高表達(dá)特性。DHX32作為一種RNA解旋酶，在細(xì)胞內(nèi)參與多種重要的生物學(xué)過(guò)程，其異常高表達(dá)可能對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。在細(xì)胞增殖方面，有研究表明，敲低DHX32基因可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力。這可能是因?yàn)镈HX32參與了細(xì)胞周期相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程，其高表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞周期的進(jìn)程，使結(jié)直腸癌細(xì)胞能夠快速增殖。在細(xì)胞周期的G1期向S期轉(zhuǎn)變過(guò)程中，DHX32可能通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，促進(jìn)DNA復(fù)制相關(guān)基因的表達(dá)，從而加速細(xì)胞進(jìn)入S期，進(jìn)行DNA合成和細(xì)胞分裂。在腫瘤轉(zhuǎn)移方面，DHX32也發(fā)揮著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，DHX32mRNA表達(dá)水平與結(jié)直腸癌的組織學(xué)分級(jí)、DUKES臨床分期、癌栓形成以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。腫瘤的惡性程度越高，DHX32表達(dá)水平越高。這表明DHX32可能參與了結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程。有研究提出，DHX32可能通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲。PI3K/AKT信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活、遷移等過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。DHX32可能通過(guò)與PI3K的調(diào)節(jié)亞基相互作用，激活PI3K，進(jìn)而使AKT磷酸化激活。激活的AKT可以調(diào)節(jié)下游一系列與細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)的蛋白表達(dá)，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等。MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為癌細(xì)胞的遷移和侵襲提供條件。此外，DHX32還可能通過(guò)影響上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程來(lái)促進(jìn)結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移。EMT是上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程，這一過(guò)程賦予癌細(xì)胞更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。DHX32可能通過(guò)調(diào)節(jié)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（如Snail、Slug等）的表達(dá)，促進(jìn)EMT的發(fā)生，從而推動(dòng)結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移。DHX32在結(jié)直腸癌中的高表達(dá)使其具有作為結(jié)直腸癌診斷和預(yù)后評(píng)估潛在生物標(biāo)志物的價(jià)值。由于結(jié)直腸癌早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，因此早期診斷對(duì)于改善患者預(yù)后至關(guān)重要。檢測(cè)DHX32的表達(dá)水平，有望成為一種新的輔助診斷方法，提高結(jié)直腸癌的早期診斷率。對(duì)于臨床醫(yī)生而言，在患者出現(xiàn)一些非特異性癥狀（如排便習(xí)慣改變、便血等）時(shí)，若檢測(cè)到DHX32高表達(dá)，可進(jìn)一步進(jìn)行結(jié)腸鏡等檢查，有助于早期發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌。在預(yù)后評(píng)估方面，DHX32的表達(dá)水平可作為判斷患者預(yù)后的重要指標(biāo)。高表達(dá)的DHX32提示患者的腫瘤惡性程度高，預(yù)后較差，醫(yī)生可根據(jù)這一指標(biāo)制定更個(gè)性化的治療方案，加強(qiáng)對(duì)患者的隨訪和監(jiān)測(cè)。對(duì)于DHX32高表達(dá)的患者，可考慮更積極的治療策略，如術(shù)后輔助化療、靶向治療等，以提高患者的生存率。此外，DHX32還具有作為結(jié)直腸癌治療靶點(diǎn)的潛力。針對(duì)DHX32的靶向治療策略可能為結(jié)直腸癌的治療帶來(lái)新的突破。目前，針對(duì)RNA解旋酶的抑制劑研究正在逐步開展。開發(fā)特異性的DHX32抑制劑，可阻斷其在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的異常功能，抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，已經(jīng)有研究嘗試使用小分子抑制劑來(lái)抑制DHX32的活性，發(fā)現(xiàn)能夠有效抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。未來(lái)，可進(jìn)一步開展臨床試驗(yàn)，驗(yàn)證DHX32抑制劑在結(jié)直腸癌治療中的有效性和安全性。同時(shí)，還可以探索聯(lián)合其他治療方法（如化療、免疫治療等），以提高治療效果。將DHX32抑制劑與化療藥物聯(lián)合使用，可能增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，提高化療的療效；與免疫治療聯(lián)合，可能調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。5.2FLIP在結(jié)